一种植物源鼠类复合不育剂的制备方法与流程

本发明涉及一种鼠类不育剂及制备方法，特别是涉及一种鼠类不育剂农大-1号的制备方法，属于药物复方技术领域。

背景技术：

不育控制是国际上兴起的控制害鼠新技术之一，其原理是通过减少鼠类的繁殖以控制鼠类种群数量。通过模型，发现在1万只鼠类群体中，如连续3代，杀灭70％的个体，其种群经过26代后仍可恢复到原有水平；但若使70％的个体连续3代不育，经过19代则可使种群灭绝。因此，使用不育控制比传统的灭鼠更能达到防治的目的。不育控制还具有操作安全及不易对环境造成污染等特点。当前，我国已在不育剂的筛选、药效作用、药理机制等方面进行大量的探索，并取得令人瞩目的成效。

鉴于传统化学灭鼠措施会产生超补偿生殖作用(breeding compensation effect)，使用不育剂来控制鼠害已成为当今学者研究的热点。不育控制即借助某种技术和方法使鼠类的雄性或雌性绝育，或阻碍胚胎着床发育，甚至使幼体阻断生长发育，以降低其生育率，从而达到降低种群数量的目的，实质上就是通过控制生育率来控制鼠类。因此，与传统的灭鼠方法相比，使用有效的不育技术更可能达到有效防治鼠害的目的，且具有操作安全，不易对环境造成污染，成本低和效果持久等优点。

鼠类不育控制在国内外已有较多的研究，取得了一些成果，主要集中在对不育剂的筛选、实验室试验以及对部分野生种群的初步控制应用方面，理论上主要以生态学模型探讨不育控制下害鼠种群动态规律。而科学界关注的焦点集中在如何选择出无污染、无公害环保型的不育剂，并且对害鼠种群数量能够实现可持续的控制。植物源不育剂成为了主要选择对象。国内也已将雷公藤、棉酚、芸香、油茶皂素、蓖麻油、天花粉、秋水仙素、蓖麻、莪术醇、印楝油等植物源不育剂应用于害鼠的不育控制，均具有一定的效果，但是均不理想。

技术实现要素：

本发明的目的是通过提取新疆紫草(Arnebia euchroma)根的提取物紫草素(Shikonin)与雌激素炔雌醚(Quinestrol)进行混合，从而制备出一种效果显著且能够可持续控制小型鼠类繁殖的复合药剂。

一种鼠类不育剂农大-1号的制备方法，其特征在于，所述不育剂由下述原料制成：紫草素100重量份，炔雌醚10重量份，所述不育剂的紫草素、炔雌醚按比例混合均匀，按照用量配比加入食用油，加热到30℃-35℃摇匀20分钟，静置10分钟，得到所述不育剂。

进一步，所述制备方法包括：所述紫草素来源于新疆紫草的根，并且利用有机溶剂石油醚提取。

进一步，所述石油醚的用量为所述中药原料重量的10倍。

进一步，所述石油醚的温度为50℃，提取时间为1小时。

进一步，所述石油醚第一次提取后，提取液分出，重新加入与第一次等量的石油醚进行二次提取，重复上述提取的制备方法。

进一步，向得到的所述石油醚提取液中加入2％氢氧化钠，在40℃下，转化1小时。

进一步，1小时后，加入浓盐酸至产生沉淀，静置2小时。

进一步，沉淀用蒸馏水洗至中性，在50℃下烘干。

进一步，使用HZ-806大孔吸附树脂吸附。

进一步，在分离柱内，加入HZ-g06大孔吸附树脂及相当于其体积0.4-0.5倍的95％乙醇，浸泡24小时。

进一步，24小时后，用二倍柱体积的95％乙醇流过柱子，用蒸馏水冲洗流出液至pH值中性，再用5％盐酸、2％氢氧化钠溶液重复上一步所述的制备方法。

进一步，将权利要求9所述的制备方法的产物，用95％乙醇制成溶液，pH值为5.9，用处理过的HZ-806树脂吸附后再用丙酮以3BV/h的流速进行解吸，解吸液真空浓缩，得到纯化的紫草素中药纯品。

进一步，丙酮作为洗脱液与样液的量的比例为2∶1。

具体地，本发明提供的不育剂中，各药材组分的作用机制为：

紫草素：味苦、寒，具有凉血，活血，清热，解毒。治温热斑疹，湿热黄疸，紫癜，烧伤，湿疹，丹毒等功效。具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗生育等作用。亦可用于药物、化妆品着色剂。

炔雌醚：炔雌醚(炔雌醇环戊醚)为长效雌激素。

作为本发明的一种优选实施方式，所述不育剂各组分的含量为：紫草素100重量份，炔雌醚10重量份。

本发明提供的不育剂中，发明人通过研究各药材组分的合理配比、协同作用，使得采用本发明提供的不育剂制备得到的药物合剂在控制小型鼠类生育方面具有良好的效果。

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例证，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例证仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

附图说明

附图1为不同浓度实验组雌性小鼠子宫脏器系数。

附图2为不同浓度实验组雄性小鼠的精囊腺脏器系数。

附图3为不同浓度实验组雄性小鼠的精子密度。

附图4为不同浓度实验组雄性小鼠的睾丸脏器系数。

附图5为不同处理组小鼠第一次繁殖幼仔数。

附图6为不同处理组小鼠第二次繁殖幼仔数。

附图7为不同处理组小鼠繁殖启动期。

附图8为子午沙鼠种群第一胎产仔数比较。

附图9为午沙鼠种群第二胎产仔数比较。

附图10为午沙鼠种群第三胎产仔数比较。

附图11为子午沙鼠种群繁殖胎数比较。

附图12为子午沙鼠种群繁殖启动期比较。

附图13为紫草素提取、转化、纯化的流程图。

图中，Control为对照组，F-Treatment为雌性处理组，M-Treatment为雄性处理组。

具体实施方式

实际应用，例1，紫草素对小白鼠繁殖的影响

为明确植物提取物紫草素的抗生育作用，以昆明小白鼠为实验对象，首先分4组，每组15对，其中1组为对照组，其余3组分别以5mg/kg、20mg/kg和50mg/kg浓度紫草素进行灌胃给药。解剖并测定雌性子宫、雄性精囊腺、睾丸等3项脏器系数和精子密度共4项指标。其次，选择紫草素1种理想浓度进行繁殖实验，将新选小鼠分为4组，每组15对，对照组1组，其余3组设3种不同处理，雄性处理组，雌性处理组和雌雄处理组，处理组灌胃给药后进行繁殖实验。结果表明：50mg/kg紫草素浓度实验组的雌性子宫脏器系数极显著低于对照组和其余2个浓度实验组(F＝6.29，P＜0.01)，子宫出现明显萎缩，雄性精囊腺脏器系数、精子密度均显著低于对照组(F＝6.49，P＜0.01；F＝4.60，P＜0.05)，50mg/kg紫草素浓度具有抗生育的预期效果；小鼠繁殖实验表明，50mg/kg紫草素浓度显著降低了雌性处理组和雌雄处理组的出生率，雌性和雄性的繁殖启动期均显著延迟，将有效降低小鼠整个繁殖期的繁殖率。

材料

紫草索(Shikonin，分子式C₁₆H₁₆O₅，analytical standard≥97％，分子量288.30)为新疆紫草提取物。实验动物为成年昆明小白鼠，体重33.1-44.6g。

方法

实验动物处理

成年小白鼠在常温下养殖，给予足够饲料和水，发育正常。实验小白鼠分4组，每组15对，其中1组为对照组，其余3组分别以5mg/kg、20mg/kg和50mg/kg浓度紫草素进行灌胃，紫草素以食用油溶解，每只鼠单次灌胃油溶紫草素为0.2ml，1周灌胃2次，间隔3天，对照组以相同量食用油灌胃。最后1次灌胃后1周进行解剖，测定雌性子宫脏器系数、雄性精囊腺脏器系数、精子密度和睾丸脏器系数等4项指标。脏器系数用以下公式计算：

选择理想紫草素浓度进行繁殖实验，新选取小鼠4组，每组15对，其中对照组1组，实验组3组，设3种不同处理：雄性处理组(雄性给药，雌性不给药)，雌性处理组(雌性给药，雄性不给药)，雌雄处理组(雌、雄都给药)。实验组以理想浓度紫草素1周灌胃2次，间隔3天，对照组以相同量食用油灌胃，最后1次灌胃1周后进行合笼，记录小白鼠繁殖情况。

小鼠精子密度测定

在光学显微镜下，采用红细胞计数板计数，在1mm²的计数室中，计数25个方格中四周和中央共5个方格中的精子数量。计算方法：

精子密度(精子总数/ml)＝精子数×稀释倍数×5mm²×10um×1000ul

数据处理

采用SAS9.0单因子方差分析(One-way ANOVA)对不同处理小鼠雌性子宫脏器系数、雄性精囊腺、睾丸脏器系数和精子密度进行比较分析，对各组雌鼠新生幼仔数进行比较分析。结果与分析

紫草素对小鼠繁殖器官的影响

5mg/kg、20mg/kg和50mg/kg三个浓度实验组与对照组的雌性子宫脏器系数、雄性精囊腺脏器系数、精子密度和睾丸脏器系数的对比分析结果如图1-4。由图2可知，雌性子宫脏器系数50mg/kg浓度实验组极显著低于对照组和其余2个浓度实验组(F＝6.29，P＜0.01)。从解剖结果来看，三个实验组小鼠的子宫在外形上没有发现如变黑、水肿、充血等器质性变化和病变，经检测子宫脏器系数，只有50mg/kg浓度实验组与其余3组存在极显著差异，即50mg/kg浓度实验组子宫出现明显萎缩。由图2-3可知，50mg/kg浓度实验组雄性小鼠精囊腺脏器系数、精子密度均显著低于对照组(F＝6.49，P＜0.01；F＝4.60，P＜0.05)。由图4可知，不同浓度实验组雄性小鼠的睾丸脏器系数与对照组均没有显著差异(F＝1.09，P＞0.05)。上述结果表明，50mg/kg紫草素浓度具有抗生育作用的预期效果。

紫草素对小鼠繁殖的影响

我们选择50mg/kg浓度紫草素作为理想浓度不育剂，重新选择小鼠进行繁殖实验对比。小鼠分为4组，其中1个对照组，3个实验组，每组15对。实验组分别为：雌性处理组(雄性不给药)，雄性处理组(雌性不给药)，雌雄都处理组(雌、雄都给药)。对每组出生的新个体数进行统计，分析结果如图5。由图5可知，从第一次出生的幼体数量来看，对照组与雄性处理组差异不显著，并且此2组与雌性处理组和雌雄处理组差异极显著(F＝14.78，P＜0.001)，即后2个实验组出生的个体数显著小于对照组和雄性处理组。而雌性处理组与雌雄处理组出生的个体数量差异不显著。表明50mg/kg浓度紫草素显著降低了雌性处理组和雌雄处理组的出生率。

小鼠第二次繁殖幼仔数如图6。由图中可知，繁殖幼体数量差异与第一次有所不同，对照组与雄性处理组差异不显著，与雌性处理组和雌雄处理组差异极显著(F＝4.23，P＝0.0103)，即后2个实验组出生的个体数显著小于对照组，而雄性处理组与雌性处理组和雌雄处理组差异不显著。因此，50mg/kg浓度紫草素持续有效降低了雌性处理组和雌雄处理组的出生率。

小鼠自雌雄合笼至第一窝幼仔出生为止的天数为繁殖启动期(王涛涛等，2015)。不同处理组小鼠的繁殖启动期如图7。从繁殖启动期来看，3个处理组的均极显著大于对照组(F＝11.83，P＜0.001)，即处理组的繁殖启动期均明显推迟。雄性处理组和雌雄处理组与对照组的差异相当，繁殖启动期比对照组平均推迟了10-12天。雌性处理组与对照组的差异最大，其繁殖启动期较对照组平均推迟了16天。第二窝幼体出生时间，雌性处理组和雄性处理组均比对照组推迟10-11天，而雌雄处理组比对照组推迟18-20天。这样紫草素延长了小鼠的繁殖周期，直接效果是相对降低了小鼠的年度繁殖次数和繁殖率。表明50mg/Kg浓度紫草素对雌、雄小鼠的正常繁殖过程形成了明显干扰，对雌、雄小鼠均具有抗生育作用。

实际应用，例2，本发明的不育剂对子午沙鼠繁殖的影响

将子午沙鼠(Meriones meridianus)分为3组，设对照组、雌性处理组和雄性处理组，对不育剂的作用效果进行了实验研究。结果表明，年度繁殖期内子午沙鼠第一次繁殖，雄性处理组的平均胎仔数显著降低(F＝12.76，P＜0.01)，为1.42±0.12，抗生育率达到42.86％；第二次繁殖，雌性处理组和雄性处理组平均胎仔数均显著降低(F＝11.71，P＜0.01)，分别为1.42±0.13和0.14±0.04，抗生育率分别达到57.14％和85.78％；年度内对照组繁殖次数2-3次，2个处理组繁殖次数0-2次，均显著低于对照组(F＝11.87，P＜0.01)；2个处理组的繁殖启动期明显延迟，雌性处理组推迟15-22d，雄性处理组推迟32-157d。不育剂对两性均起到了不育作用。

材料与方法

材料

紫草素(Shikonin，分子式C₁₆H₁₆O₅，analytucal standard≥97％，分子量288.30)为新疆紫草提取物，主要成分为萘醌类化合物；炔雌醚(Quinestrol，Assay 99.27％)由北京紫竹天工科技有限公司提供(产品遵守美国许可证书USP22.)；实验用子午沙鼠(Meriones meridianus)于2014年10月捕自内蒙古阿拉善盟阿拉善左旗南部典型荒漠生境(E104°10′-105°30′，N37°24′-38°25′)。以40cm×40cm×60cm的鼠笼单独饲养于内蒙古农业大学荒漠生态与鼠害控制研究基地实验室(位于当地)，通风良好，自然光照，饲料充足自由取食。饲养5个月安全越冬后，于2015年4月选取健康和性成熟子午沙鼠雌雄各45只，共90只待用。

方法

药物浓度及试鼠分组：选取浓度为100mg/kg紫草素与炔雌醚按照10∶1比例混合均匀，配制成以食用油为溶剂的紫草素-炔雌醚油溶液不育剂(15ml/kg)。实验鼠分为对照组、雌鼠处理组、雄鼠处理组，每组雌雄各15只，单独饲养。体质量62.78±10.07(SE)。雌鼠处理组一周内间隔3天雌鼠灌胃两次，最后一次灌胃后一周与正常雄鼠按1∶1比例合笼。同样，雄鼠处理组一周内间隔3天雄鼠灌胃两次，最后一次灌胃后一周与正常雌鼠按1∶1比例合笼。对照组一周内雌、雄鼠用等量食用油间隔3天灌胃两次，最后一次灌胃后一周雌、雄鼠按1∶1比例合笼。

记录指标：实验鼠观察期为4月-10月，在观察期内每天检查记录各组鼠的产仔日期、每胎产仔数和繁殖胎数。

数据分析：对每组繁殖胎数、每胎的产仔数、繁殖启动期差异均作单因素方差分析(the One-Way ANOVA)，数据采用SAS9.0软件分析，显著性水平P＜0.05。对子午沙鼠的抗生育率采用下式计算：

抗生育率＝对照组生育率-试验组生育率。

结果

第一胎产仔数比较

子午沙鼠第一胎繁殖胎仔数单因素方差分析结果如图8。2个处理组与对照组同样均出现了繁殖，各组繁殖的胎仔数不同，对照组平均胎仔数为4.28±0.72，雌性处理组平均胎仔数为3.71±0.28，雄性处理组平均胎仔数为1.42±0.12，2个处理组均低于对照组。雌性处理组与对照组差异不显著，而雄性处理组的胎仔数与对照组和雌性处理组均差异极显著(F＝12.76，P＜0.01)，即雄性处理组的胎仔数极显著低于对照组和雌性处理组。说明不育剂对雄性的不育作用明显高于雌性。雄性处理组抗生育率为42.86％。

第二胎产仔数比较

子午沙鼠种群第二胎繁殖的个体数方差分析结果如图9。对照组平均胎仔数为3.57±0.43，雌性处理组平均胎仔数为1.42±0.13，雄性处理组平均胎仔数为0.14±0.04。可以看出2个处理组平均胎仔数均极显著低于对照组(F＝11.71，P＜0.01)，而且2个处理组的差异不显著，繁殖率均明显降低，雌性处理组为42.86％，雄性处理组为14.28％，对照组为100％。表明不育剂显著降低了2个处理组第二次繁殖的个体数和繁殖率。雌性处理组抗生育率为57.14％，雄性处理组抗生育率为85.78％，均明显升高。

第三胎产仔数比较

子午沙鼠种群第三胎繁殖的个体数差异性分析结果如图10。对照组进行了繁殖，处理组均未繁殖，可以看出对照组与2个处理组的繁殖胎仔数虽然无显著差异(F＝2.36，P＞0.05)，但是对照组仍有28.57％的成体进行了第三次繁殖，而处理组没有个体参加繁殖。本研究记录到的年度内对照组子午沙鼠最后一次繁殖幼体出生时间是9月20日，尽管接近其繁殖休眠期，但处理组无个体参加繁殖的现象，仍然不能完全排除不育剂的作用。

子午沙鼠种群繁殖胎数比较

实验期间子午沙鼠种群繁殖胎数差异性分析如图11。可知对照组繁殖2-3胎，繁殖3胎的占28.57％；雌性处理组繁殖1-2胎，繁殖2胎的占42.86％；雄性处理组繁殖0-2胎，繁殖2胎的占14.29％。可以看出2个处理组与对照组，以及2个处理组之间的差异均达到极显著(F＝11.87，P＜0.01)。表明不育剂极显著降低了处理组繁殖频率，相对延长了其繁殖周期，特别是对于雄性处理组的作用更加明显。

子午沙鼠繁殖启动期比较

繁殖启动期是指自子午沙鼠合笼配对开始至第一窝幼仔出生为止的天数。本研究实验观察期为183d(4月5日-10月5日)，若统计期内未产仔，繁殖启动期为实验观察期的天数。子午沙鼠种群繁殖启动期如图12。可以看出，对照组繁殖启动期平均为26.43±1.13d，雌性处理组平均为41.57±2.43d，雄性处理组平均为119±6.37d。差异性分析表明，雌性处理组与对照组差异不显著，雄性处理组与对照组差异极显著(Fig.5，F＝14.46，P＜0.001)。可见不育剂推迟了2个处理组的繁殖启动期，雌性处理组推迟15-22d，雄性处理组推迟32-157d，因此导致2个处理组后续妊娠期在年度内的改变和推移，而且2个处理组第三胎均未能繁殖，明显降低了子午沙鼠种群年度内的有效繁殖率。

紫草素的提取、转化与纯化流程

新疆紫草根中主要有效成分为紫草素及其衍生物，紫草素及其衍生物为萘醌类化合物，多为有色结晶，并且结构中5，8-位有两个酚羟基，故呈紫色。紫草素分子化学结构式为

中文名称：紫草素；

别名名称：紫草宁，紫根色素，欧紫草；

英文名称：Shikonin；

化学名称：5，8-二羟基-2-[(1R)-1-羟基-4-甲基戊-3-烯基]萘-1，4-二酮；

英文化学名称：5，8-Dihydroxy-2-[(1R)-1-hydroxy-4-methyl-pent-3-enyl]naphthalene-1，4-dione；

分子式：C₁₆H₁₆O₅；

分子量：288.30；

紫草素分子中具有酚羟基，故有酸性，能溶于碱液，加酸酸化又可析出，此性质常用于提取。

紫草素是萘醌类色素，脂溶性强，所以易溶于石油醚、氯仿，可溶于植物油、乙醇，不溶于水。紫草素衍生物均具有活性基团，如5，8-位酚羟基、侧链上的双键及酯键等，所以在提取、制备及储存时均应防止成分结构改变或被破坏。萘醌类成分在温度＜60℃、酸碱度pH＜7、超声＜30min条件下，对成分影响较小；在光线直射、温度＞60℃，酸碱度pH＞7、超声＞30min条件下，对成分影响较大。

紫草总色素提取工艺

1.提取溶剂的优选

为了选取最佳溶剂，分别称取紫草50g，按照表1数据，分别加入石油醚(40～80℃)、95％7醇、乙酸乙酯、氯仿、丙酮，振荡，放置一定时间，过滤，滤液定容于1000ml量瓶中，摇匀，精密量取10ml，放置在100ml量瓶中，分别用相应溶剂定容，摇匀，用可见紫外分光光度仪在520nm波长处测定吸收度，按左旋紫草素(C₁₆H₁₆O₅)的吸收系数(E_1cm^1％)为242计算紫草羟基萘醌总色素量，按公式(1)，计算紫草总色素得率，结果见表1。

表1不同溶剂提取紫草总色素的实验数据

从不同溶剂提取效果来看，石油醚、氯仿较理想。紫草中萘醌类色素为脂溶性成分，由于相似者易溶的特性，溶于亲脂性较强的溶剂。氯仿有一定毒性，在工业生产中应尽量避免使用该溶剂。石油醚(40～80℃)与水、碱液均不起反应，与碱液萃取效果理想，且石油醚(40～80℃)对紫草总色素的提取能力也较好，因此选择石油醚(40～80℃)为较佳提取溶剂。

2.动态提取法提取紫草总色素

采用动态提取法，将紫草总色素转化为紫草素，实验设计综合紫草总色素浸出与时间、温度关系的考察结果和生产实际，选择浸提时间、每次加溶剂的量及浸提次数为考察因素，每个因素又设定三个水平，根据因素水平表，选择正交表L₉(3⁴)进行实验，并以每个实验提取的紫草总色素得率作为考察指标，比色法测定含量，统计分析，确定最佳浸提提取工艺。

(1)正交设计表选用L₉(3⁴)因素水平表，见表2。

表2因素水平表

(2)试验方法及试验数据

准确称取紫草50g，分别根据表3的试验条件进行试验，合并提取液，过滤，定容至1000ml，摇匀，精密量取10ml，放置100ml容量瓶中，用石油醚定容，摇匀，用可见紫外分光光度仪在516nm处测定其吸收度。按左旋紫草素(C₁₆H₁₆O₅)的吸收系数(E_1cm^1％)为242，计算紫草羟基萘醌总色素量，并按公式(1)计算总色素提取率，结果见表3。

表3正交试验安排和结果

(3)方差分析结果

表4方差分析表

根据方差分析结果，A因素各水平之间没有显著差异，可选用A因素中的任何一水平，根据生产周期越短越好的要求，选用提取两次，每次提取1小时。而B、C因素各水平之间存在显著差异，由于B₁＜B₂＜B₃，C₁＜C₂＜C₃，因此最佳工艺应为A₁B₃C₃。从正交实验设计中直接观察可以看出提取紫草总色素含量较高的实验还有A₂B₂C₃，即第5号实验，现将以上两种提取工艺分别重复试验三次，结果如下：

表5较佳工艺对比表

以上结果表明两种较佳工艺提取紫草总色素得率相差不大，但从降低生产成本，缩短生产周期等因素考虑，选用最佳工艺A₁B₃C₃。即提取二次，每次提取时间为1小时，每次加石油醚量为10倍，提取温度为50℃。

提取紫草总色素最佳工艺：石油醚(40～80℃)动态提取2次，每次加石油醚(40～80℃)量为生药的10倍，每次1小时，提取温度为50℃，得到紫草总色素石油醚液。按公式(1)，计算紫草总色素得率。采用此工艺提取，紫草总色素提出率为2.16％。

紫草总色素转化为紫草素的工艺

紫草总色素转化为紫草素的过程为：

(1)紫草素总色素碱液作用下，发生水解反应，大部分色素分子中-R转化为-H，即转化为紫草素钠盐。

(2)转化液再加酸，紫草素钠盐即变为紫草素。

1.氢氧化钠溶液浓度的优选

准确量取优选出的较佳工艺提取的紫草总色素石油醚液850ml(相当于生药量50g)共5份，分别加0、1％、2％、3％、4％氢氧化钠溶液500ml萃取，放置24小时，分取碱提取液，用浓盐酸酸化至产生沉淀，浓盐酸可过量，静置2小时，布什漏斗抽滤，沉淀用蒸馏水洗至中性，于50℃下烘干，称重，并用高效液相色谱法测定紫草干提取物中紫草素含量，计算出紫草素量，并按公式(2)计算出紫草素得率，结果见表6。

表6氢氧化钠溶液浓度对紫草素提出量的影响

由表6可知，2％氢氧化钠溶液提取效果最好，因此选定2％氢氧化钠溶液为最佳提取溶剂。

2.氢氧化钠溶液用量的优选

准确量取采用优选出的较佳工艺提取的紫草总色素石油醚液850ml共5份，分别加2％氢氧化钠溶液400、500、600、700、800ml萃取，放置24小时，分取碱提取液，用浓盐酸酸化至产生沉淀，浓盐酸可过量，静置2小时，布氏漏斗抽滤，沉淀用蒸馏水洗至中性，于50℃下烘干，称重，并用高效液相色谱法测定紫草提取物中紫草素含量，按公式2计算出紫草素得率，结果见表7。

表7氢氧化钠溶液用量对紫草素提出量的影响

由表7可知，紫草素提出量随氢氧化钠溶液用量的增加而提高，并且700ml与800ml相差不大。

3.温度对紫草素得率的影响

准确量取采用优选出的较佳工艺提取的石油醚液850ml共4份，分别加2％氢氧化钠溶液700ml萃取，分别在20℃、30℃、40℃、50℃保温箱中，静置2小时，布氏漏斗抽滤，沉淀用蒸馏水洗至中性，于50℃下烘干，称重，并用高效液相色谱法测定紫草提取物中紫草素含量，计算出紫草素量，并按公式2计算出紫草素得率，结果见表8。

表8提取温度对紫草素得率的影响

由表8可知，紫草素提出率随提取温度的不同而有所不同。开始随着温度的升高，紫草素提出量也增加，在40℃时提出量最高。而继续提高温度至50℃，紫草素提出量反而下降。因为紫草总色素转化为紫草素是一个水解反应，增加温度可以使其反应加速，但随着时间延长，紫草总色素水解为紫草素后，再增加水解时间，紫草素会继续分解，转化为其它物质。因此设计40℃水解1、2、3、4、5、6小时的碱化水解工艺，见表9。由表9可以看出40℃时，水解1小时，紫草素得率较高。

表9 40℃不同碱化时间的对比实验

4.正交实验优选紫草总色素转化为紫草素工艺条件

(1)实验设计：结合上述紫草素提取转化工艺影响因素的考察结果和生产实际，选择氢氧化钠溶液浓度、用量、碱化时间作为考察因素，分别设定三个水平，根据因素水平表，选用L₉(3⁴)因素水平表，进行实验，见表10。

表10因素水平表

(2)试验方法及试验数据：准确量取石油醚液850ml分别按表11设计的试验条件进行试验，加不同浓度的碱液，碱化放置不同的时间后，碱提取液用浓盐酸酸化至产生沉淀，浓盐酸可过量，静置2小时，布氏漏斗抽滤，沉淀用蒸馏水洗至中性，于50℃下烘干，称重，并用高效液相色谱法测定紫草干提取物中紫草素含量，按公式2计算出紫草素得率。结果见表11。

表11正交试验安排和结果

(3)方差分析结果

表12方差分析表

由此可见因素A、C对紫草素提取转化率影响极显著，因素B对紫草素提取转化率影响显著，各因素对提取转化效果的影响程度依次为C＞A＞B，因此A，B，C三个因素的最佳参数为A₂B₃C₂，即紫草素转化的最佳工艺为：在40℃时，氢氧化钠溶液浓度为2％，用量为700ml(相当于药材量的14倍)，转化时间为1小时。

按此最佳工艺安排试验，平行操作3份，紫草素提出转化率分别为1.760％，1.776％，1.765％。平均为1.767％；紫草素纯度分别为75.12％、76.05％、75.84％，平均为75.67％。

紫草素转化工艺研究结果表明，最佳工艺为：40℃时，氢氧化钠溶液浓度为2％，用量为700ml(相当于药材量的14倍)，水解1小时，此时紫草素得率为1.767％；紫草干提取物中紫草素纯度为75.67％，此时还未达到实验目标要求。

紫草素纯化工艺

1.树脂预处理

在洁净的分离柱内，放入已经去除杂质、体积恒定的大孔吸附树脂，再加入相当于树脂体积0.4～0.5倍的乙醇，浸泡24小时。然后用二倍柱体积的乙醇流过柱子，用水冲洗流出液pH至中性，再用5％的盐酸、2％的氢氧化钠溶液重复以上步骤。

2.上样液制备及预处理：

称取紫草50g，按照最佳动态提取工艺提取、最佳碱化工艺转化制备成紫草素粗提物。然后用95％乙醇，制成不同浓度的紫草粗提物溶液，备用。

3.动态吸附处理：

为了更合理的设计生产化工艺路线，先采用小柱子对其动态柱分离条件进行考察，为生产提供科学的依据。

在进行动态吸附时，考察6个因素的影响，分别为不同洗脱剂、分离柱内径、上样液的浓度、药液的pH值、上样液流速、温度等。

(1)不同洗脱剂对紫草素纯度及收率的影响

实验中所用树脂为30g，所用药液的浓度为含紫草素粗提物0.801mg/ml(相当于50g生药/ml药液)，pH值为5.0，药液体积为100ml，柱径为22.5mm，树脂吸附后用200ml不同溶剂以1.5BV/h的流速进行解吸，解吸液真空浓缩，得到纯化的紫草素，紫草素精密称取约0.5g，置100ml量瓶中，加乙醇至刻度，4小时内时时振摇，滤过，精密量取续滤液5ml，置25ml量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀。照分光光度法，在516nm的波长处测定吸收度，按左旋紫草素(C₁₆H₁₆O₆)的吸收系数(E_1cm^1％)为242计算，测定紫草素含量，按公式3计算紫草素纯度，并按公式4计算紫草素收率，结果见表13。由表13可知，丙酮解吸效果最好，乙醇洗脱效果较差。

表13不同溶剂解吸的结果

(2)考察选择柱子的内径

药液pH值为5.0，上样液流速为1.5BV/h，柱径分别为15mm、20mm、22.5mm、25mm四种不同规格的柱子，所得数据如下，从表中的数据可以看出柱子的内径为20mm的紫草素收率和纯度最高，因此选择内径为20mm的柱子。

表14不同柱径紫草索收率以及产品中紫草素纯度的数据

(3)考察药液的浓度

采用的柱子内径为20.0mm，树脂量为30g，上样液的流速为1.5BV/h，上样液的浓度分别为0.801mg/ml、1.63mg/ml、3.25mg/ml，药液体积分别为150ml，75ml，36ml，即保持相同的生药量，所得数据如表所示。根据表中的数据，以药液浓度为1.63mg/ml紫草素收率和产品中紫草素纯度最高。因此选择药液浓度为1.63mg/ml的药液为最佳的上样浓度。

表15上样液浓度对紫草素收率及产品中紫草素纯度的影响

(4)考察上样液的pH值

pH值对吸附的影响一般来说，药液的pH值对树脂的吸附率影响较大，因此考察不同pH的药液对树脂吸附率的影响。从表16中看出，以溶液pH值为5.9，紫草素收率和产品中紫草素纯度为最高。

表16不同pH值的药液上柱后的吸附数据

(5)考察上样液流速

柱径：20mm，上样液的浓分别为1.63mg/ml，上样液体积75ml，pH值为5.9，树脂用量30g，用丙酮洗脱，流速分别选择1.5BV/h；3.0BV/h；5.0BV/h；7.5BV/h，所得数据如下表。理论上，上样液的流速越慢，紫草素的吸附越充分，但从表17中可看出，流速3.0BV/h的解吸效果与流速1.5BV/h相当，并且均比5.0BV/h、7.5BV/h的效果好。而流速快可以缩短生产周期，所以选定流速3.0BV/h为最佳流速。

表17不同的上样液流速时紫草素的收率及产品中紫草素纯度的数据

(6)考察温度的影响

一般来说，吸附分为物理吸附和化学吸附。物理吸附一般在低温下进行，而化学吸附需要一定的热量，为了测定打孔树脂对紫草素是物理吸附还是化学吸附，因此测定了不同温度下树脂对紫草素的吸附效果，而水洗和醇洗均在常温下进行。从表中的数据可以看出，在室温下吸附紫草素的收率最高，在35℃时紫草素的收率有所下降，在51℃有所上升，在75℃时有所下降，这说明树脂对紫草素的吸附既是物理吸附，又是化学吸附，在整个吸附过程中是物理吸附和化学吸附竞争的结果。

表18不同温度下树脂吸附紫草素的数据

以上实验结果表明，动态吸附的最佳条件是：紫草素较佳洗脱溶剂为丙酮，上样液浓度为1.63mg/ml，上样液最佳PH值为5.9，柱径选择为20mm，上样流速为3BV/h，温度采用室温下即可。

在最佳条件下吸附，所得紫草素收率为1.34％，产品中紫草素纯度达到96.6％，达到了预期目标。

结论

紫草素高效提纯是紫草活性成分发挥疗效的关键所在，而提取、纯化紫草素的关键技术问题是如何去除无效杂质，提高紫草素的收率和产品中紫草素纯度，缩短生产周期。作者利用紫草中萘醌类成分的物理化学特性，把动态提取，溶液萃取工艺与先进的树脂吸附工艺相结合，并分别优化了提取、转化、树脂吸附纯化三个步骤中的工艺参数，使得紫草素的最终收率达到1.34％，产品中紫草素纯度达到96.6％。并大大缩短了提取纯化时间。结论如下：

紫草总色素提取工艺

1、提取溶剂选择：通过对石油醚(40～80℃)、95％乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿五种不同溶剂对紫草素的提取能力的比较，结果表明石油醚(40～80℃)的提取效果优于其它溶剂。

2、提取方式的选择：石油醚(40～80℃)提取紫草总色素采用不同提取方式，如浸提、动态提取，通过实验比较，最后确定较适宜的提取方法为动态提取，即紫草加入石油醚(40～80℃)动态提取两次，每次加溶剂量为生药材量的10倍，提取温度为50℃，每次提取时间为1小时，此条件下，紫草总色素的收率可达2.16％。

转化工艺

此步骤是将紫草总色素转化为紫草素，正交实验结果表明，转化的最佳工艺为：紫草总色素石油醚液用2％的氢氧化钠溶液，用量为生药量的14倍，碱化时间为1小时，碱化温度为40℃，分取碱提取液，用浓盐酸酸化至产生沉淀，浓盐酸可过量，静置2小时，布氏漏斗抽滤，沉淀用蒸馏水洗至中性，于50℃下烘干，得到紫草素粗提取物。此条件下紫草素的收率可达1.767％，产品中紫草素的纯度可达75.67％。

纯化工艺

1、筛选树脂：通过静态吸附对四种不同极性的大孔树脂进行筛选，结果表明这四种树脂中，HZ-806树脂吸附率最快，解吸率也高，因此将其定为本研究项目的吸附树脂。

2、动态吸附：分别考察了上样液的流速、分离柱内径、上样液浓度、温度及pH值等因素对动态吸附的影响。结果表明：上样液的流速为3BV/h，分离柱内径为20mm，上样液的浓度为1.63mg/ml、温度为室温，pH值为5.9时吸附效果最好。在最佳石油醚(50℃)动态提取-碱液转化-大孔树脂吸附条件下，经单程提取、转化、纯化后紫草素的最终收率为1.34％，产品中紫草素的纯度为96.6％，均超过了文献的报道值。

以上实例仅为本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，所作出的若干改进，也应视为本发明的保护范围。