三种石斑鱼生长抑素基因及其应用的制作方法

专利名称：三种石斑鱼生长抑素基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体地说涉及三种基因。
背景技术：
生长抑素(somatostatin，SRIF或SS)最早是1973年Branzeau等从绵羊下丘脑中分离到。已有的研究发现生长抑素或结构相关抗原存在于多种脊椎动物和非脊椎动物的神经系统和消化管，它们调节着机体多种生理过程，包括生长、发育和代谢，被确认为一种广泛分布于神经系统和外周组织的多功能肽。
对鱼类SRIF的生理功能研究主要集中对胰腺与发育和代谢相关的激素调节，以及对垂体GH分泌的调控方面。虹鳟基因I和基因II产物(SRIF-14和SRIF-25)具有降低血液中胰岛素和胰高血糖素水平、刺激糖原分解和脂解作用。此外，由SRIF肽诱导的脂解作用在鲑降海过程脂类代谢的变化有关。在七鳃鳗，SRIF-14普遍刺激脂类的消耗和抑制脂类在储存器官的储存，导致血浆中脂肪酸水平的升高。SRIF-14对垂体GH释放的体内体外抑制作用已在许多硬骨鱼类中得到证明。与哺乳类一样，SRIF-14也是硬骨鱼类体内和体外的一种潜在抑制基础和刺激性GH释放的因子，但SRIF-14不抑制虹鳟或罗非鱼GH基因的表达。金鱼的3种类型的SRIF均抑制垂体GH体外释放。但鲶SRIF-22和鲑SRIF-25则不能抑制金鱼GH释放。在coho salmon，SRIF-14和哺乳类的SRIF-25和SRIF-28明显抑制血浆GH浓度。SRIF-14，哺乳类的SRIF-28或rat cortistatin抑制欧洲鳗垂体细胞GH释放。[脯氨酸2]SRIF-14抑制虹鳟垂体GH释放，与SRIF-14相似。虽然鲶SRIF-22没有在鲶鱼上试验，但它能抑制鼠垂体细胞GH分泌。SRIF-14也能有效地阻止罗非鱼垂体体外释放PRL。因此利用生长抑素对生长激素分泌的抑制作用，采用生物工程的方法制备高活力的生长抑素抗体作为饵料添加剂，可以有效地促进动物个体的生长，而目前在鱼类中尚未有相关的报道。
另外，已有的结果也显示不同的生长抑素基因具有不同的生物学功能。从金鱼脑中鉴定了3种SRIF cDNAs，这是第一次从一种脊椎动物上鉴定到3种不同的SRIF基因。本发明中所公开的石斑鱼的三种生长抑素基因是鲈形目鱼类的第一例。石斑鱼是海洋珊瑚礁鱼类，属鮨科(Serranidae)，石斑鱼属(Epinephelus)，有30多种。石斑鱼是一种名贵的海水鱼类，具有极高的经济价值。石斑鱼的苗种培育是养殖生产持续发展的关键，但目前在石斑鱼人工养殖中还没有一种能有效促进其苗种生长的饵料添加剂。

发明内容
本发明的目的在于针对目前石斑鱼苗种培育生长缓慢的问题，提供三种石斑鱼生长抑素基因。
本发明的另一目的在于提供这三种基因在石斑鱼生长发育中的应用。
本发明的斜带石斑鱼生长抑素基因是以斜带石斑鱼下丘脑总RNA反转录得到的cDNA为模板，经PCR和Gene RACER方法扩增而得到的。其中斜带石斑鱼PSSI序列全长644nt，含5’端非翻译区序列53个nt、3’非翻译区序列219nt，和一个开放阅读框序列372nt。此ORF编码123个氨基酸，其N端+1至第28位氨基酸为推测的信号肽序列。在C未端有R-K(Arg-Lys)双残基转化酶酶切识别位点可产生具有与所有已知的脊椎动物PSS I完全相同的SS14。在此识别位点前(+93位点上)带有单残基酶切识别位点R(Arg)，推测可产生一个分子量较大的肽SS30。在序列的3’端有PolyA信号AATAAA的出现，其核苷酸序列及其所编码的氨基酸序列如序列表所示。
斜带石斑鱼PSS II序列全长604nt，含5’端非翻译区序列65个nt、一个开放阅读框序列384nt和3’非翻译区序列155nt。在570nt处带有终止信号序列ATTAAA。此ORF编码127个氨基酸，其N端前24位氨基酸为推测的信号肽序列，含一段疏水性的氨基酸序列。在其推测氨基酸序列的第99位上带有单残基酶切识别位点R，推测可产生SS28，其C端是SS14肽的变异体，这种SS14肽的变异体在所有已报道的鱼类SS II一样，即其第7位苯丙氨酸(Phe，F)和第10位苏氨酸(Thr，T)分别被酪氨酸Y(Tyr7)和甘氨酸G(Gly10)所代替，在此SS14肽变异体之前有R-K双残基转化酶酶切识别位点推测可产生[Tyr7，Gly10]SS14。其核苷酸序列及其所编码的氨基酸序列如序列表所示。
斜带石斑鱼PSSIII序列全长817nt，含5’端非翻译区序列214个nt、一个开放阅读框序列333nt和3’非翻译区序列270nt。在3’非翻译区带有终止信号序列AATAAA。此ORF编码110个氨基酸，其N端+1至第19位氨基酸为推测的信号肽序列，含一段疏水性的氨基酸序列。在+95、+96位上有R-K双残基转化酶识别位点推测可剪切产生[Pro2]SS14肽。+87位和+82位氨基酸上有单碱基识别位点R，可能分别剪切产生28肽和23肽的SS。其核苷酸序列及其所编码的氨基酸序列如序列表所示。
本发明的有益效果利用本发明的三种石斑鱼生长抑素基因，可以制备各种用于促进苗种生长的饵料添加剂，大大提高了鱼苗的生长速度，有着重要的经济效益。


图1是斜带石斑鱼生长抑素基因PSSI中间片段克隆的凝胶电泳分析图；图2是是斜带石斑鱼生长抑素基因PSSI5’和3’端克隆的凝胶电泳分析图；图3是斜带石斑鱼生长抑素基因PSSII3’端片段克隆的凝胶电泳分析图；图4是斜带石斑鱼生长抑素基因PSSII5’端片段克隆的凝胶电泳分析图；图5是斜带石斑鱼生长抑素基因PSSIII3’端片段克隆的凝胶电泳分析图；图6是斜带石斑鱼生长抑素基因PSSIII5’端片段克隆的凝胶电泳分析图；图7是斜带石斑鱼三种生长抑素基因PSSI，PSSII，PSS III的基因转录产物mRNAs在脑组织的分布的电泳分析图；图8是斜带石斑鱼三种生长抑素基因PSSI，PSSII，PSS III的基因转录产物mRNAs在脑组织中分布的半定量分析图；图9是斜带石斑鱼三种生长抑素基因PSSI，PSSII，PSS III的基因转录产物mRNAs在外周组织的分布的电泳分析图；图10是斜带石斑鱼三种生长抑素基因PSSI，PSSII，PSS III的基因转录产物mRNAs在外周组织的分布的半定量分析图；图11是斜带石斑鱼三种生长抑素基因PSSI，PSSII，PSS III的基因转录产物mRNAs在胚胎期及个体早期发育的表达分析电泳图；图12是斜带石斑鱼三种生长抑素基因PSSI，PSSII，PSS III的基因转录产物mRNAs在胚胎期及个体早期发育表达的半定量分析图。
其中图1中，1为扩增产物，2为100bp Marker；图2中，1为5’端片段，2为100bp 33’端片段；图3中，1为100bp Marker，2为扩增产物；图4中，1为100bp Marker，2、3为扩增产物；图5中，1为100bp Marker，2为阴性对照；3为扩增产物；图6中，1为100bpMarker，2为扩增产物；图7中，1为嗅球，2为端脑，3为上丘脑，4为下丘脑，5为小脑，6为延脑，7为脊髓，8为垂体，9为100bpMarker；图8中，1为嗅球，2为端脑，3为上丘脑，4为下丘脑，5为小脑，6为延脑，7为脊髓，8为垂体；图9中，1为皮肤，2为红肌，3为白肌，4为脂肪，5为血，6为鳃，7为眼，8为心，9为胸腺，10为性腺，11为脾，12为肾，13为头肾，14为肝脏，15为胃，16为前肠，17为中肠，18为后肠，19为100bp Marker；图10中，1为皮肤，2为红肌，3为白肌，4为脂肪，5为血，6为鳃，7为眼，8为心，9为胸腺，10为性腺，11为脾，12为肾，13为头肾，14为肝脏，15为胃，16为前肠，17为中肠，18为后肠；图11中，1为未受精卵，2为受精卵，3为多细胞期，4为高囊期，5为囊胚期，6为原肠期，7为胚体形成，8为晶体形成，9为出膜前，10为刚出膜，11为1天，12:11天，13为52天，14为100bp Marker；图12中，1为未受精卵，2为受精卵，3为多细胞期，4为高囊期，5为囊胚期，6为原肠期，7为胚体形成，8为晶体形成，9为出膜前，10为刚出膜，11为1天，12为5天，13为11天，14为15天，15为36天，16为52天。
具体实施例方式
实施例1斜带石斑鱼生长抑素基因PSSI的合成首先进行PSS I中间片段的克隆。比较金鱼等多种鱼类和其它物种的PSS I序列，设计并合成上游简并引物S1F15’TCT CCA CGCGKA TCC AGT GC3’和下游特异引物S1R15’GTG AAA GTT TTCCAG AAG AA3’。使用GeneRacerTMKit(Invitrogen公司，下同)获得的斜带石斑鱼下丘脑cDNA第一链作模板扩增PSS I中间片段。PCR反应条件为94℃预变性3min，然后进入循环94℃ 50s，56℃1min，72℃ 90s，共30个循环，最后一个循环结束后72℃延伸10min。扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，胶回收纯化特异片段。特异片段连接到pGEM-T Easy Vector Systems的T载体上并转化DH5α感受态细胞。用含X-gal和Amp抗性的LB平板筛选阳性克隆，并用PCR扩增方法和酶切检测目的片段的插入。提取重组质粒并进行DNA序列测定。用DNA分析软件和NCBI网上的BLAST程序进行序列分析。
根据PSS I中间片段测序结果设计合成下游引物以克隆PSS I 5’端序列。下游引物为S1UP15’ATG GAG GCG GTG AGG GAG AG3’；Nest引物S1UP25’GGA GGA GGC ACT GGATAC GC3’。上游引物为GeneRacerTMKit提供的5’first primer5’CGA CUG GAG CAC GAGGAC ACU GA3’。以上述GeneRacerTMKit获取的斜带石斑鱼下丘脑cDNA第一链作为模板，引物S1UP1和5’first primer扩增PSS I 5’端序列。反应条件如上述。胶回收特异片段，并用Nest引物S1UP2与5’first primer作引物PCR扩增验证。特异片段连接到T载体、转化DH5α感受态细胞、重组子筛选等操作如上述。重组质粒DNA序列测定。
根据PSS I中间片段测序结果设计合成克隆PSS I 3’端序列的2个上游引物S1DP2和S1DP2S1DP15’GGC TGA AGG AGA ACCTGAAG3’；S1DP25’GGA GGA GGC ACT GGA TAC GC3’。用S1DP1和GeneRacerTMKit提供3’first primer扩增PSS I 3’端序列，模板、反应条件同上。胶回收特异带。用引物S1DP2与GeneRacerTMKit提供的3’nest primer5’CGC TAC GTAACG GCATGA CAG TG3’扩增验证。回收产物与T载体连接。转化DH5α感受态细胞，筛选重组子，重组子测序，方法同上。把PSS I 5’端序列、PSS I中间片段和PSS I 3’端序列进行拼接，获得PSS I cDNA全序列。
实施例2斜带石斑鱼生长抑素基因PSSII的合成根据鱼类和其它物种的PSS II序列设计合成引物扩增PSS II 3’端序列。上游引物S2F25’C TTC TAY TGG AAG GGC TTC3’，GeneRacerTMKit提供的3’nested primer5’CGC TAC GTA ACGGCA TGA CAG TG3’，模板及反应条件同上。回收特异片段、特异片段与T载体连接、转化DH5α感受态细胞、筛选重组质粒、重组质粒DNA测序等方法均同上。根据PSS II3’端序列测序结果设计2个引物进行PSS II 5’端序列的克隆，用S2UP15’CAG AGG GCT GCTGAT TGG TC3’与GeneRacerTMKit提供的5’first primer 5’CGACUG GAG CAC GAG GAC ACU GA3’扩增，模板同上。回收特异片段，并用S2UP2和5’nested primer扩增检测。扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，胶回收纯化特异片段。特异片段连接到pGEM-T Easy Vector Systems的T载体上并转化DH5α感受态细胞。用含X-gal和Amp抗性的LB平板筛选阳性克隆，并用PCR扩增方法和酶切检测目的片段的插入。提取重组质粒并进行DNA序列测定。用DNA分析软件和NCBI网上的BLAST程序进行序列分析。
实施例3斜带石斑鱼生长抑素基因PSSIII的合成参考金鱼和青蛙等PSSIII的序列，设计合成上游引物扩增PSSIII3’端序列。S3F15’AgC SCC MTG CAA AAA CTT CT3’，与GeneRacerTMKit提供的3’nested primer5’CGC TAC GTA ACG GCATGA CAG TG3’进行扩增，模板同上。反应条件为94预变性3min，然后进入循环94℃50s，50℃1min，72℃1min。共30cycle，最后1个循环结束后72℃延伸10min。回收特异片段、特异片段与T载体连接、转化DH5α感受态细胞、筛选重组质粒、重组质粒DNA测序等方法均同上。根据PSSIII3’端序列测定结果设计合成引物进行PSSIII 5’端序列的扩增。2个引物分别为S3UP15’AGG GAA GGA GGA CTGTAG GC3’和S3UP25’GGT TTT GGG CAC TGT TAG CA3’。用S3UP1与GeneRacerTMKit提供的5’first primer 5’CGA CUG GAG CAC GAGGAC ACU GA3’扩增，反应条件如下首先94℃变性5min，接着进入循环，94℃30s，57℃30s，72℃1min。共30个cycle，最后1个循环结束后72℃延伸10min。胶回收特异片段，分别用S3UP2与5’firstprimer以及S3F1与S3UP1作PCR扩增检测。扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，胶回收纯化特异片段。特异片段连接到pGEM-T Easy Vector Systems的T载体上并转化DH5α感受态细胞。用含X-gal和Amp抗性的LB平板筛选阳性克隆，并用PCR扩增方法和酶切检测目的片段的插入。提取重组质粒并进行DNA序列测定。采用DNA分析软件、NCBI网上的BLAST程序以及TechnicalUniversity of Denmark的SignalP 3.0 Server(new version)进行全序列的结构分析、信号肽分析以及同源性分析。
实施例4斜带石斑鱼三种生长抑素基因在脑组织中表达的分析用Trizol Reagent(Invitrogen公司)提取斜带石斑鱼不同脑区的总RNA，经1.5％琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色后从28s rRNA与18s rRNA条带的浓度及相对浓度判断总RNA的完整性。EppendoffBiophotometer微量紫外分光光度计测定样品在260nm和280nm波长下的光密度值以判断总RNA纯度和计算浓度。用高灵敏的RT-PCR的方法检测三种生长抑素基因在斜带石斑鱼脑组织的表达情况，其中引物S1P15’CTC TCC CTC ACC GCC TCC AT3’和S1P25’TCTTGC AGC CAG CTT TCC TC3’用于扩增PSS I；引物S2P15’TCCAGG TGT TTT CTC ACA GCC C3’和S2P25’GGT TCA TCC TTCCCC CTG TTG C3’用于扩增PSS II；引物S3P15’GCC ACC AACTGC ACT GCA CTT T3’和S3P25’GCG GCT GCT CTA ACG CTGAAC A3’用于扩增PSSIII。先进行模板浓度和循环数及反应条件的优化扩增试验，根据预扩增结果确定cDNA扩增产物以1∶10稀释后作为PCR扩增模板，反应体系为模板浓度为2ul，buffer with(NH)2SO42ul，MgCl21.6ul，dNTP 0.4ul，P10.4ul，P20.4ul，Taq 0.2ul，加ddH2O至20ul。根据3个PSS基因以及18s rRNA的扩增情况，选取各基因处于对数增长期的循环数。扩增反应条件为94℃预变性4min后进入循环94℃30’，58℃30’，72℃45’，共34个循环，最后一个循环结束后72℃延伸7min。每管各取5ul的扩增产物2.5％的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，Bio-Rad凝胶成像仪拍照，并用其Quantity One软件进行半定量分析，取3个样品的平均值。
结果发现，在嗅球、端脑、上丘脑、下丘脑、小脑、延脑、脊髓和垂体这八个区域中，斜带石斑鱼3种PSS基因在脑部各分区均有表达，但表达水平不同，在下丘脑、端脑、小脑等的表达量较高，另外垂体中也检测到斜带石斑鱼PSSIII的转录。在此过程中，作为参照的18s rRNA基因的表达水平则保持稳定，无显著变化。以上结果表明，本发明中的3种PSS均能在斜带石斑鱼的脑中作为神经递质或神经调质，在脑中有着不同的作用，同时也作为促垂体神经激素，调节鱼类的生长速度。
实施例5斜带石斑鱼三种生长抑素基因在机体外周组织中表达的分析检测方法与上述实施例4相同。
结果发现在外周组织中，石斑鱼生长抑素基因PSSI在皮肤、红肌、胸腺、卵巢、肾、前肠和后肠这7种组织中有表达，其中PSSI在性腺的表达量最高；生长抑素基因PSS II在皮肤、红肌、血、心、胸腺、卵巢、脾、头肾、肝、胃、前肠、中肠和后肠等13种组织有表达信号，其中胃的表达量最高；生长抑素基因PSSIII则在视网膜、胸腺、卵巢、胃、前肠、中肠和后肠7种组织中均可检测到相应前体的表达，中肠的信号最强。
以上结果表明，本发明中的斜带石斑鱼的生长抑素PSS II和PSSIII分别在胃、肠道中有较高的表达量，具有调节胃肠激素分泌的功能，通过使胃液维持一定的酸碱度，保证胃蛋白酶的活性，调节鱼体对食物的消化和吸收，控制鱼体的生长。
实施例6斜带石斑鱼三种生长抑素基因在胚胎及个体早期发育各阶段表达的分析从斜带石斑鱼胚胎及幼体各不同发育阶段的样品中提取总RNA(方法与实施例4相同)，包括未受精、刚受精、多细胞期、高囊期、囊胚期、原肠期、胚体形、晶体形、出膜前、出膜、1天、2天、11天、15天、36天、52天。检测方法与实施例4相同。
结果发现本发明中的石斑鱼生长抑素基因PSSI在自受精卵开始至仔鱼孵化出膜、PSSII从胚体形开始至孵化出膜、PSSIII自原肠期起至孵化出膜各阶段可检测到基因的表达，三个基因均在出膜前达到最高表达量，孵化出膜后明显下降。在仔鱼孵出后的1天、2天、11天、15天、36天、52天均可检测三个PSS基因的表达，且保持一定的表达量。这一结果证明生长抑素PSS自受精卵开始便参与生长发育调控，维持各种生长因子的平衡，因此在鱼类个体发育中具有重要作用。
Untitled1.ST25SEQUENCE LISTING<110>中山大学<120>三种石斑鱼生长抑素基因及其应用<130>
<160>6<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>644<212>DNA<213>斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)<220>
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<221>CDS<222>(215)..(544)<220>
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Untitled1.ST25Ala Pro Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys100 105 110
权利要求
1.三种石斑鱼生长抑素基因，分别为PSS-I，PSS-II和PSS-III，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，SEQ ID NO5所示。
2.如权利要求1所述的三种石斑鱼生长抑素基因，分别为PSS-I，PSS-II和PSS-III，其核苷酸序列编码的氨基酸序列分别如SEQ IDNO2，SEQ ID NO4，SEQ ID NO6所示。
3.权利要求1所述的三种石斑鱼生长抑素基因在鱼类生长发育中的应用。
4.如权利要求3所述的三种石斑鱼生长抑素基因在石斑鱼生长发育中的应用。
5.如权利要求4所述的三种石斑鱼生长抑素基因在斜带石斑鱼生长发育中的应用。
全文摘要
本发明公开了三种石斑鱼生长抑素基因，它们是通过以石斑鱼下丘脑总RNA为模板，经RT－PCR和Gene RACER方法而得到的具有石斑鱼生长抑素基因cDNA序列的基因片段；这三种基因在石斑鱼生长发育中有着重要的应用。
文档编号C07K14/46GK1597955SQ20041005160
公开日2005年3月23日 申请日期2004年9月24日 优先权日2004年9月24日
发明者李文笙, 叶星, 林浩然 申请人:中山大学