专利名称：一种Exendin-4的18F标记产物及制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及放射性药物领域。
背景技术：
胰岛素瘤的定位诊断的方法主要有功能性试验和影像学检查等。功能性试验包括经动脉钙剂刺激肝静脉取血测胰岛素(ASVS)、经皮经肝门脉分段取血测胰岛素(PTPC)、经脾门静脉穿刺置管分段取血快速胰岛素测定(PVS)，以及超声内镜、DSA等方法虽然敏感性高，但均为有创性检查，临床难于广泛应用。常规的影像学定位方法有CT、MRI等，但灵敏度不闻。生长抑素受体(SSTR)显像最早应用到胰岛素瘤的定位研究，应用最多的是111In标记Octreotide,但对于胰岛素瘤的检出率低于50%。这是因为111In-Octreotide主要与SSTR的两个亚型SSTR2和SSTR5结合，而胰岛素瘤P细胞中这两种受体亚型分布不多，因此敏感性减低。由于胰岛素瘤高表达GLP-I受体，因此，通过放射性核素标记GLP-I及其类似物可进行胰岛素瘤的特异性显像和定位。GLP-I是由30个氨基酸组成的小分子多肽，通过胰岛P细胞表面特异的GLP-I受体可介导胰岛素的分泌作用。但GLP-I可在二肽基肽酶-IV (dipeptidyl peptidase-IV,DPP-IV)的作用下快速降解，体内半衰期仅2min左右，因此，极大限制了其在临床上的应用。GLP-I类似物，如Exendin-4和Exendin-3，具有与GLP-I相似的生物活性，能抵抗二肽基肽酶-IV (dipeptidyl peptidase-IV)的降解,体内半衰期长。因此,通过放射性核素标记GLP-I类似物进行胰岛细胞瘤的显像及胰岛P细胞移植的监测得到较快的发展。早期,Gotthardt等通过123I标记的GLP-I及其类似物Exendin-3进行了大鼠胰岛素瘤模体内显像研究。研究显示，胰岛素瘤可特异性与123I标记的Exendin-3结合。但由于Exendin-3的一级结构中缺乏酪氨酸,放射性碘标记较困难。之后Wild等通过111In标记 GLP-1 类似物 Exendin-4,即[Lys4。(Ahx-DTPA-111In) NH2] exendin-4,通过针孔(pinhole)SPECT/MRI和SPECT/CT进行了转基因鼠RiplTag2的胰岛素瘤显像，显示肿瘤明显摄取，且高于肺及胰腺组织。考虑到mIn标记的Exendin-4可能会对患者造成相对较高的辐射吸收剂量，之后Wild等分别通过68Ga和99mTc标记Exendin-4，SPECT和PET显示肿瘤的靶/本比高，可显示较小的胰岛素瘤。但68Ga为发生器制备的正电子核素，空间分辨率低，临床应用受到限制。99mTc虽为常用放射性核素，但临床SPECT显像的灵敏度低于PET显像。PET显像具有空间分辨率和灵敏度高的特点，更适合胰岛素瘤的临床诊断。18F为PET/CT显像的最常用的正电子核素，来源方便，因此我们尝试通过18F标记Exendin-4进行胰岛素瘤显像的可行性研究。由于多肽相对复杂的分子结构不可能直接进行亲核氟化或者亲电氟化，因此，18F标记多肽类药物必须经过中间体才能实现。目前，18F标记中间体已经得到快速的发展和广泛应用，如通过酰基化、酰胺化、亚胺化、烷基化、光化连接、点击化学、硅化、硼化和固相合成等方法进行中间体的18F标记。但不同的标记方法均有其优点和局限性，其中，通过酰基化途径标记合成的N-琥珀酰亚胺4-[18F]氟苯甲酸酯([18F] SFB)，依其合成及纯化方法、放化产率以及标记探针的体内稳定性，被认为最适宜用作18F标记中间体。而且[18F]SFB已广泛应用于单克隆抗体、RGD (精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)、Annexin — V等多种生物分子的连接。Kiesewetter 等(Eur J Nucl Med Mol Imaging 2012 ;39:463 - 473)通过标记中间体[18F]FBEM 进行了多肽 Exendin-4 的合成([18F]FBEM-[Cys4°]-exendin_4)，并进行了INS-I胰岛素瘤模型鼠小动物PET显像，研究显示，[18F]FBEM-[Cys40] -exendin-4放化产率为6. 4%(以18F_为起始物计算)，放化纯度〉96% ;胰岛素瘤清晰显像。文献报导的Exendin-4类似物是在Exendin-4基础上进行结构修饰而得，也就是在Exendin — 4羧基段加上了Cys，含有Cys的多肽容易被氧化，稳定性要差于不含Cys的多肽；其次，文献报导的标记方法，综合放化产率比较低，仅为6. 4%。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种体外稳定性好、放化产率高的Exendin-4的18F标记产物。本发明所要解决的第二个技术问题是，提供一种Exendin-4的18F标记产物的制备方法。本发明所要解决的第三个技术问题是，提供[18F]FB- Exendin-4在制备胰岛素瘤显像诊断药物中的应用。为实现本发明第一个目的，本发明公开一种Exendin-4的18F标记产物，所述标记产物为[18F]FB- Exendin-4。为实现本发明第二个目的，本发明公开[18F]FB- Exendin-4的制备方法，包括以下步骤
(1)1卞_与4_三甲胺苯甲酸乙酯三氟磺酸盐反应，制备中间体N-琥珀酰亚胺4-[18F]氟苯甲酸酯[18F] SFB ；
(2)[1卞]5 8与￡以也11-4偶联得到[18FjFB- Exendin-4。作为一个优选方案，步骤(I)包括通过回旋加速器PET trace制备[18F]F_，向盛有活化[18F]F—的反应瓶中加入4-三甲胺苯甲酸乙酯三氟磺酸盐，依次与NaOH、HCl反应，反应液通过活化的S印-Pak C18柱盐酸淋洗、N2吹干，再用乙睛洗脱得到4-[18F]氟苯甲酸；加入氢氧化四丙基胺，共沸干燥，加人0-(N-琥珀酰亚胺)-1，I, 3，3-四甲基脲四氟硼酸酯TSTU反应，然后用醋酸酸化；将上述溶液通过活化的S印-Pak C18柱，依次用K: K= I/7的乙睛/水淋洗，用N2吹干Sep-Pak C18柱，用二氯甲烷洗脱；TLC、HPLC测放射化学纯度，活度计测活度，计算放化产率。步骤(2)包括将[18F] SFB溶解在乙腈中，加入Exendin-4, Exendin-4溶于pH值为8. 5的0. IM硼砂一硼酸缓冲液,室温下反应30min ;反应液过滤后通过HPLC分离,所用色谱柱为 ZORBAX SB C18, 5 u m, 9. 4 mm X 150 mm, HPLC 系统采用如下梯度以 3 mL/min的速度淋洗其中A相为含0. 1%三氟乙酸的乙腈、B相为含0. 1%三氟乙酸的水；0-20 min,A从16%升到90% ；20-30 min, A为90% ;收集tE=18-19. 5 min的峰，所得产物溶液，旋转蒸干，重新用0. 9%的NaCl注射液溶解，得目标产物化合物[18F]FB-Exendin-4经Radio-TLC，选用展开剂为乙酸乙酯和二氯甲烷，两者体积比为3:1，Radio-HPLC表征，Radio-HPLC分析方法与制备方法相同，不过流速为lmL/min,色谱柱为ii Bondapak C18, 5 u m, 300 mmX 3. 9 mm。本发明的优点在于，本发明成功进行了 [18F]SFB与多肽Exendin-4 ([18F]FB-Exendin-4)的合成，标记产物的放化纯度大于98%，标记率为35% (以18F_为起始物计算)，体外稳定性好。
图I为[18F] SFB的合成路线。
图2为标记多肽[18F]FB-Exendin-4的放射性TLC图谱。图3为标记多肽[18F]FB-Exendin-4的放射性HPLC分析图谱。图4为体外竞争结合曲线，Graphpad Prism5分析exendin-4的IC50值为
0.99nmol/L0图5为饱和曲线，125I-exendin_4和GLP-1受体的平衡解离常数Kd值为56. 64，最大结合常数Bmax为4. 651 X 107。图6为18F-FB-Exendin-4胰岛素瘤裸鼠模型30min和120min小动物PET/CT显像。图7为各个脏器30min和120min的SUV值。图8为各个脏器60min未阻断和阻断的SUV值。图9为120min后裸鼠各脏器的％ID/g值。
具体实施例方式下面结合附图对本发明提供的关于[18F]FB- Exendin-4的制备方法和应用的具体实施方式
做详细说明。实施例I、制备[18F]FB- Exendin-4 材料
Exendin-4由上海强耀生物科技有限公司(上海，中国)，按照标准FMOC化学过程合成。4-氟苯甲酸(SB)购自瑞士 Fluka公司。18F由科兴药业有限公司加速器中心提供，通过质子辐射富氧18O-H2O获得。高性能液相系统Dionex P680 summit HPLC分析系统(美国Dionex公司)，配有Bioscan flow-count detector(美国Bioscan公司)；回旋加速器(GE,Waukesha, Wisconsin, USA)生产。(I) N-琥珀酰亚胺4-[18F]氟苯甲酸酯([18F]SFB)的合成
[18F]氟化物由回旋加速器 PET trace (GE，Waukesha, Wisconsin, USA)生产。利用180(p, n) 18F核反应,通过质子福照盛于I. 5ml银祀(silver target)中的[180]H20,入射的质子能为18MeV，电子束电流为36 u A。由回旋加速器制备[18F]F_后，吸附到S印-Paklight QMA 柱(Sigma)上待洗脱。[18F] r经 I. 51111含 K2CO3和 Kryptofix 222 (K222; Sigma)组成的混合溶液洗脱到V型反应瓶中(美国ALTECH公司)，通过共沸蒸干得到无水18F_。标记前体[18F] SFB的合成参考文献方法(Kirchhoff TD, Merkesdal S，Frericks B，et al. Intraarterial calcium stimulation (ASVS) for pancreaticinsulinoma: comparison of preoperative localization procedures. Radiologe,2003 (43):301-305. ；Suzuki K, Takahashi S, Aiura K, et al. Evaluation ofthe usefulness of percutaneous transhepatic portal catheterization forpreoperatively diagnosing the localization of insulinoma. Pancreas,2002,24:96-102. ；ffang GJ, Dou JT, Wang ZQ, et al. Comparison of endoscopicultrasonography and digital subtract ion angiography in localization ofinsulinomas. Chinese Journal of practical International Medicine, 2006,26(22) :1829-1830.)，合成过程参见图I。 简单描述为向盛有活化的无水18F_的反应瓶中加入4-三甲胺苯甲酸乙酯三氟磺酸盐(5 mg, 16 iimol,溶于0.3 mL无水乙腈)，90°C加热10 min。反应液冷却后,加人Imol/L的NaOH 0. 7 mL, 100。。反应5 min，冷却后加入I mol/L的HCl 0. 9 mL,反应液通过一活化的S印-Pak C18柱，先用2 mL的0. 01 mol/L盐酸淋洗，用N2吹干S印-Pak C18柱，再用3 mL乙腈洗脱得到4-[18F]氟苯甲酸。将20 UL氢氧化四丙基胺的水溶液加入其中，100°C共沸干燥，加人12 mg 0-(N-琥珀酰亚胺)-1，1，3，3_四甲基脲四氟硼酸酯(TSTU)(溶于0. 25 mL乙腈中)，90°C反应5 min。然后用3 mL的5%醋酸酸化，再用6 mL水稀释。将上述溶液通过一活化的S印-Pak C18柱，依次用10 mL乙腈/水(K: K= I/7)淋洗，用N2吹干S印-Pak C18柱，用2 mL 二氯甲烷洗脱。TLC、HPLC测放射化学纯度，活度计测活度，计算放化产率。(2) [18F] SFB 与 Eexdin-4 偶联
将[18F] SFB溶解在50 ML乙腈中，加入IOOyg Exendin-4 (溶于200 ML pH值为8. 5的0. IM硼砂一硼酸缓冲液)，室温下反应30 min。反应液过滤后通过HPLC分离，所用色谱柱为 ZORBAX SB C18, 5 u m, 9. 4 mm X 150 mm, HPLC 系统采用如下梯度以 3 mL/min 的速度淋洗其中A相为含0. 1%三氟乙酸的乙腈、B相为含0. 1%三氟乙酸的水；0-20 min, A从16%升到90% ；20-30 min, A为90%。收集tE=18-19. 5 min的峰，所得产物溶液，旋转蒸干，重新用0. 9%的NaCl注射液溶解，得目标产物化合物[18F]FB-Exendin-4经Radio-TLC，选用展开剂为乙酸乙酯和二氯甲烷，两者体积比为3:1，Radio-HPLC表征，Radio-HPLC分析方法与制备方法相同，不过流速为lmL/min,色谱柱为ii Bondapak C18, 5 u m, 300 mmX 3. 9 mm。实施例2、18F-FB-Exendin_4的体外稳定性测定
将2种标记物分别置于生理盐水和胎牛血清中，并置于37°C恒温水浴，并分别于1，4，8，12 h后用HPLC方法检测标记物的放化纯。首先成功合成了标记前体乙基-4-三甲胺苯甲酸酯-三氟磺酸盐，经过三步一锅法合成，然后经S印-Pak C18柱分离得到中间体N-琥珀酰亚胺-4-[18F]氟苯甲酸酯([18F]SFB)o [18F] SFB 放化纯大于 95%。Exendin-4 与[18F] SFB 反应，即得到 18F-FB-Exendin_4。放射性TLC显示了 18F-FB-Exendin-4的Rf值为0. 0 (图2)。粗产物HPLC的纯化显示一个主要的放射性高峰，18F-FB-Exendin_4 峰,保留时间 tR=17. 2min (图 3)。18F-FB-Exendin_4的标记率为(35. 6 ±2. 3)%(n=4)，放化纯大于98%。18F-FB-Exendin_4在胎牛血清和生理盐水中均有较好的稳定性，置37°C恒温水浴中12 h以上，其放化纯达90%以上。实施例3、体外细胞竞争结合实验RIN-m5f细胞的培养
胰岛素瘤细胞系RIN-m5f细胞(中国医学科学院肿瘤医院惠赠)，用含15%FBS(Hyclone)、l%青链霉素(GBICO公司)的RPMI1640培养液(Sigma公司)培养于直径IOcm的培养皿(Corning公司)内，置于37°C、5%C02的细胞恒温培养箱(Heraeus公司)中培养。受体与配体的饱和曲线 RIN-m5f细胞培养约3天左右，细胞融合至80%左右，以0. 25%胰蛋白酶(Invitrogen公司)消化、离心，经细胞计数后，传至24孔板(Corning公司)中，每孔细胞数约为5X105个，置于37°C恒温培养箱内培养，24h后吸出细胞培养液，I XPBS洗两遍。每孔分别加入不同浓度的125I-exendin4，PBS缓冲液调至体积为500 y L，使之终浓度分别为0、0. 03,0. 05、
0.U0. 2,0. 4,0. 6,0. 8、I. OnmoI/L,每个浓度均设3个复孔。为扣除非特异性结合，分别将
0,0. 03,0. 05,0. 1,0. 2,0. 4,0. 6,0. 8、I. OnmoI/L 的 125I_exendin4 孔内均加入 g 未标记的exendin-4，体积为500 u L，每个浓度均设3个复孔。上述两组均置于37°C恒温培养箱中，孵育40min。反应结束后，以含0. 5%BSA冷的PBS洗3遍，吸出上清液，每孔加入浓度为lmol/L冷的NaOH 500 u L，反应5min后将每孔中的细胞从培养皿底吹打下来并移至Y免疫管中，通过Y计数仪(上海日环公司)测其每分放射性计数(count per minute)。所得数据，经GraphPad Prism5单位点结合饱和曲线拟合程序处理，绘制出125I_exendin4受体结合饱和曲线。竞争结合实验
将细胞传至24孔板，每孔细胞数约为5X IO5个，置于37°C恒温培养箱内培养，24h后吸出细胞培养液，I XPBS洗两遍；取1251-6找11(1111-4浓度为0.4 nmol/L，每孔中加入浓度分别为0、0. I、I、10、100 nmol/L未标记的exendin-4，置37°C恒温培养箱中孵育40min。反应结束后，同样以含0. 5%BSA冷的PBS洗3遍，吸出上清液，每孔加入浓度为lmol/L冷的NaOH 500111，反应51^11后，将细胞从培养皿吹打下来移至、免疫管中，通过Y计数仪测定其cpm。所得数据经GraphPad Prism5单位点竞争结合曲线拟合程序处理，求得exendin-4 抑制 125I_exendin4 的半抑制率 IC5tl 值。体外细胞竞争结合实验
由于胰岛素瘤细胞株RIN-m5f高表达GLP-I受体，竞争结合实验显示，exendin-4抑制125I-exendin4的半抑制率IC50值为0. 35-2. 81nmol/L (图4)，表明未标记的exendin-4与GLP-I受体有较高的亲和力。饱和曲线
通过Graphpad Prism5程序,计算出125I-exendin_4和GLP-I受体的平衡解离常数Kd值为56. 64，最大结合常数Bniax为4. 651 X 107。表明125I-SFB-exendin_4可特异的与GLP-1受体结合，具有饱和性和可逆性，以及具有高亲和力等特点(图5)。实施例4、裸鼠模型小动物PET/CT显像 胰岛素瘤裸鼠模型的建立
4-5W龄的雌性BALB/C裸鼠(购自上海实验动物研究所)，由上海交通大学医学院实验动物中心饲养，饲养条件为SPF级无菌条件。动物实验经上海交通大学医学院伦理委员会批准，符合动物保护、饲养和实验的伦理原则。
培养的RIN_m5f细胞融合至80%时，吸出培养液，0. 25%胰蛋白酶消化，转移至离心管，1500 r/min离心5min，PBS重悬，离心2次，最后用150 U I的PBS重悬，经细胞计数约1X107。共12只裸鼠，每只裸鼠于右下肢背侧皮下注射150 Ul的RIN-m5f细胞悬浮液。此后，裸鼠常规无菌饲养，饮水以5%葡萄糖注射液(上海制药公司)饲养，每2-3天血糖仪(罗氏整合型血糖仪ACXU-CHEK Integra)检测血糖水平，血糖水平测定不低于3mmol/L。饲养2-3周左右，肿瘤长至0. 5-1. 0cm，用于小动物PET/CT显像。
裸鼠模型小动物PET/CT显像
6只RIN-m5f模型鼠分别由尾静脉注射体积为IOOul含3. 7MBq (IOOuCi)的[18F]FB-exendin-4,注射后每只裸鼠显像前置于吸气盒(induction chamber)内，通入5%的异氟烷进行麻醉；麻醉后分别于30min及120min将裸鼠置于小动物PET/CT (Inveon mPET/CT, Siemens Preclinical Solution, Knoxville, Tennessee, USA)扫描床上,进行 IOmin分钟数据采集。显像采集期间，裸鼠通过定制面罩(custom face mask)通入1_2%的异氟烷进行麻醉。裸鼠模型小动物PET/CT阻断显像
3只胰岛素瘤裸鼠模型由尾静脉注射IOOiU含250 ii g的未标记的Exendin-4，然后再由尾静脉注射100 ill含3. 7MBq的[18F] FB-exendin-4。另3只RIN_m5f模型裸鼠由尾静脉注射IOOiU含3. 7MBq的[18F]FB-exendin-4，作为对照组。显像前将裸鼠置于吸气盒(induction chamber)内麻醉,注射[18F]FB-exendin_4后60min将裸鼠放置于小动物于PET/CT扫描床上固定，进行IOmin分钟图像采集，显像期间裸鼠通过呼吸面罩吸入1_2%异氟烷进行麻醉。小动物PET/CT图像处理
所有小动物PET显像通过标准子集期望最大值方法(standard ordered-subsetexpectation maximization method)重建。重建图像以横状位,冠状位,矢状位显示；共显示512张连续断层图像，层厚0. 11_，并通过视觉进行横状位，冠状位，矢状位图像的评估。将CT显像和PET显像进行图像融合，通过CT定位肝脏、肾脏、肺脏、胃、脾脏以及肿瘤等主要器官和组织，于PET图像中画出感兴趣区(ROI)，由计算机程序自动给出该组织和器官相应的最大SUV (SUVmax)值。裸鼠体外各脏器放射性分布
裸鼠动态采集120min后，立即脱臼处死，首先心脏取血，然后剪开腹膜，分离肝脏、脾脏、胃、心脏、肺、胰腺、肾脏、小肠、结肠、股骨、肌肉等脏器，称重，置于离心管中，通过Y计数仪测定每分放射性计数，结果以％ID/g(每克组织的放射性占注射剂量的百分含量)表
/Jn o统计分析
所有数据以土SD表示,平均值利用单向方差分析和Student’ s t test处理，当P
< 0. 05有显著性差异。结果
RIN-m5f模型鼠小动物PET/CT显像
RIN-m5f模型鼠尾静脉注射[18F] FB-Exendin-4后小动物PET/CT静态显像的冠状断层(图6)可见，30min肿瘤部位放射性明显浓聚，同时可见肺脏，肝脏、肾脏及膀胱等器官的明显显影(图6B); 120min肿瘤影像减淡，仍可见肺脏，肝脏、肾脏及膀胱等器官显影，但放射性降低(图6D)。图6A及6C分别为30min和120min裸鼠CT冠状断层图像，显示肿瘤于裸鼠右下肢背侧。
静态显像30min和120min时，通过CT定位，由PET图像分别勾画各脏器兴趣区，并得到相应的SUVmax值(图7)。可见，30min肾脏、肝脏SUV最高，其次为肺、胃、小肠及肿瘤；肿瘤与肌肉组织SUV之比为4. 57。120min后肾脏、肝脏SUV降低，其中肾脏降低最明显，但肾脏、肝脏仍有较高的SUV值；肺脏、胃及小肠SUV有不同程度的降低。120min内骨骼肌肉组织内SUV均很低。由于CT图像中胰腺难于清晰显示，因此，未进行胰腺SUV值测定。以上结果表明[18F]FB-Exendin_4可有效的靶向肿瘤，与肿瘤细胞GLP-I受体结合而显像，同时[18F]FB-Exendin-4也与小鼠肺组织结合，验证小鼠肺组织含有GLP-I受体，也同时进一步验证了 [18F]FB-Exendin_4与GLP-1受体的结合；[18F] FB-Exendin-4主要通过肾脏及肝脏排泄，符合多肽的体内药代动力学特性。模型鼠Exendin-4阻断的小动物PET/CT显像
模型鼠尾静脉注射 250 V- g Exendin-4 后 IOmin 注射[18F] FB-Exendin-4,60min 后行小动物PET/CT显像，PET图像可见肿瘤部位未见明显的放射性摄取，肺脏未见显影，肝脏显影减淡，双肾明显显影(图6F)。裸鼠CT冠状断层图像可清晰定位肿瘤部位，箭头指示肿瘤部位(图6E)。通过Exendin-4阻断前及阻断后60min的PET显像进行肿瘤及各脏器的SUVmax值测定(图8)，可见肾脏、肝脏、胃、小肠、肺以及肿瘤均有不同程度的降低，其中肿瘤降低最为明显，肺脏其次，表明未标记Exendin-4可特异性阻断[18F]FB-Exendin_4与肿瘤细胞结合，[18F]FB-Exendin_4的生物学特性与Exendin-4相同。模型鼠各脏器放射性生物分布的体外测定
RIN-m5f模型鼠尾静脉注射3. 7MBq的[18F]FB-Exendin-4 120min后，分离各脏器，测得的结果表示为％ID/g，如图9所示。可以清晰地看到2h后，肾脏中放射性计数最高，为
0.27，其次是肝脏为0. 18 ;肿瘤为0. 15，分别高于肺、胰腺、小肠、大肠、胃和脾脏；肌肉组织中％ID/g最低，为0. 037 ;肿瘤与肌肉组织比为7. 1，裸鼠各脏器120min体外放射性测定结果与显像结果相一致。我们通过合成18F标记多肽常用的中间体N-琥珀酰亚胺-4-[18F]氟苯甲酸酯([18F] SFB)，进行了的间接标记。研究显示，[18F] SFB作为中间体标记的Exendin_4( 18F-SB-Exendin-4)，其放化纯度大于98%，标记率35%，体外稳定性好。体外结合实验显示IC50值为0. 35-2. 81nmol/L ;平衡解离常数Kd值为56. 64 ;最大结合常数Bmax为4. 651 X 107，表明18F-SB- Exendin-4与GLP-I受体结合具有较高的特异性。我们建立了 RIN-m5F BALB/c裸鼠胰岛素瘤模型，通过小动物PET/CT显像可见肿瘤清晰显像，且肿瘤显像可被未标记的Exendin-4所阻断,表明[18F]FB-Exendin_4可与胰岛素瘤细胞特异性结合。同时显像可见肾脏和肝脏明显显影，Exendin-4阻断显像仍可见肝脏和肾脏显影，可见，[18F]FB-Exendin-4主要通过肾脏及肝脏代谢。从[18F]FB-Exendin-4裸鼠PET/CT显像的SUVmax分析可以看出，除了肝肾等器官外，肺、胃以及小肠等器官的SUVmax较高，Exendin-4阻断显像可见上述器官SUVmax明显降低。Gotthardt等通过小鼠及大鼠的体内生物分布及显像研究表明，肺、胃、胰腺等器官均有GLP-I受体表达。但对于人类，除了胰岛和十二指肠(Brunner腺)有较高的GLP-I受体表达，回肠、结肠、肾、肺及胰腺(腺泡)等器官内仅有少量GLP-I受体表达，而肝、脾、骨骼肌和脂肪等组织内则未见GLP-I受体表达。同时，通过PET/CT显像可避免脏器之间的重叠的影响，特别是通过CT的准确定位，减少了周围器官的放射性影响，具有良好的临床应用前景。 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种Exendin-4的18F标记产物,其特征在于,所述标记产物为[18F]FB- Exendin_4。
2.权利要求I所述[18F]FB-Exendin-4的制备方法,包括以下步骤 (1)1卞_与4_三甲胺苯甲酸乙酯三氟磺酸盐反应，制备中间体N-琥珀酰亚胺4-[18F]氟苯甲酸酯[18F] SFB ； (2)[1卞]5 8与￡以也11-4偶联得到[18FjFB- Exendin-4。
3.根据权利要求2所述的[18F]FB-Exendin-4的制备方法，其特征在于，步骤(I)包括通过回旋加速器PET trace制备[18F]F_，向盛有活化[18F]F_的反应瓶中加入4-三甲胺苯甲酸乙酯三氟磺酸盐，依次与NaOH、HCl反应，反应液通过活化的Sep-Pak C18柱盐酸淋洗、N2吹干，再用乙睛洗脱得到4-[18F]氟苯甲酸；加入氢氧化四丙基胺，共沸干燥，加人0-(N-琥珀酰亚胺)_1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸酯TSTU反应，然后用醋酸酸化；将上述溶液通过活化的S印-Pak C18柱，依次用K: K= I/7的乙睛/水淋洗，用N2吹干S印-Pak C18柱，用二氯甲烷洗脱；TLC、HPLC测放射化学纯度，活度计测活度，计算放化产率。
4.根据权利要求2所述的[18F]FB-Exendin-4的制备方法，其特征在于，步骤(2)包括将[18F] SFB溶解在乙腈中，加入Exendin-4, Exendin-4溶于pH值为8. 5的0. IM硼砂一硼酸缓冲液，室温下反应30min ;反应液过滤后通过HPLC分离，所用色谱柱为ZORBAX SB C18,5 V- m, 9. 4 mm X 150 mm, HPLC系统米用如下梯度以3 mL/min的速度淋洗其中A相为含0. 1%三氟乙酸的乙腈、B相为含0. 1%三氟乙酸的水；0-20 min，A从16%升到90% ;20_30min，A为90% ;收集tK=18_19. 5 min的峰，所得产物溶液，旋转蒸干，重新用0. 9%的NaCl注射液溶解，得目标产物化合物[18F]FB-Exendin-4经Radio-TLC，选用展开剂为乙酸乙酯和二氯甲烷，两者体积比为3:1，Radio-HPLC表征，Radio-HPLC分析方法与制备方法相同，不过流速为 1mT,/min,色谱柱为 u Bondapak C18, 5 u m, 300 mm X3. 9 mm。
5.权利要求I所述的[18F]FB-Exendin-4在制备胰岛素瘤显像诊断药物中的应用。
全文摘要
本发明公开一种[18F]FB-Exendin-4标记产物及其制备方法和应用，通过18F-与4-三甲胺苯甲酸乙酯三氟磺酸盐等一系列反应，制备出中间体N-琥珀酰亚胺4-[18F]氟苯甲酸酯([18F]SFB)，然后与多肽Exendin-4进行结合反应，得到[18F]FB-Exendin-4标记多肽。本发明公开的标记产物放化纯度大于98%，标记率为35%，体外稳定性好。
文档编号C07K1/20GK102617728SQ20121010767
公开日2012年8月1日 申请日期2012年4月13日 优先权日2012年4月13日
发明者乌海飞, 张一帆, 梁胜 申请人:上海交通大学医学院附属瑞金医院