新酶基因及其表达产物的制作方法

专利名称：新酶基因及其表达产物的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的具有谷氨酰胺果糖-6-磷酸氨基转移酶(在此及下文称为“GFAT”)活性的酶基因及具有该基因所编码的氨基酸序列地新蛋白(酶)。
背景技术：
GFAT是一种重要的催化果糖-6-磷酸到6-磷酸葡糖胺的酶，在活的机体中是氨基己糖生物合成途径的限速步骤。最近，McKnight等发现一个人的GFAT基因，它含有681个氨基酸残基。(McKnight，G.L，等，J.Biol.Chem.，267，25208-25212(1992))。此后Nishi等公开了一个新的人GFAT基因(US Patent No.5,876,713)。
GFAT活性抑制剂被认为能够提高细胞对葡萄糖的摄取，从而降低血糖浓度。因此这些抑制剂有希望作为治疗糖尿病的药物。胰岛素促进细胞对葡萄糖的摄取，细胞中的葡萄糖通过糖酵解的途径进行代谢，借此聚积作为能源的ATP。然而，当葡萄糖过度摄取时，葡萄糖的代谢物果糖-6-磷酸进入氨基己糖生物合成途径。在氨基己糖生物合成途径中，经GFAT的作用，果糖-6-磷酸转化成6-磷酸葡糖胺。
有报道，6-磷酸葡糖胺的代谢产物能阻止葡萄糖转运体转移到细胞膜上，从而抑制细胞对葡萄糖的摄入。(FASEB J.，5，3031-3036(1991)；Diabetogia，38，518-524(1995)；J.Biol.Chem.，266，10155-10161(1991)；J.Biol.Chem.，266，4706-4712(1991)；及Endocrinology，136，2809-281(1995)。
在葡萄糖代谢途径中，氨基己糖生物合成途径被认为在葡萄糖的过度摄取的反馈机制中起作用。在氨基己糖代谢途径中，GFAT是一个重要的限速酶，已知GFAT的活性在非胰岛素依赖性(2型)的糖尿病患者中通常较高，并且有报道，GFAT的活性是引起高血葡糖水平的一个因素。(Diabetes，45，302-307(1996))。
除了人的GFAT外(J.Biol.Chem.，267，25208-25212(1992)US Patent No.5，876，713)，小鼠GFAT，酵母GFAT，大肠杆菌GFAT也已报道。这些GFAT和人的GFAT高度同源。但是目前还未报道存在有骨骼肌-重要的葡糖代谢组织-特异的GFAT。
分离具有GFAT活性的新GFAT基因能够阐明在氨基己糖生物合成途径中GFAT的调节功能。分离组织(如骨骼肌)特异性表达的GFAT能进一步阐明葡萄糖在该组织中代谢的机制。另外，发现对GFAT蛋白-该蛋白是具有该GFAT基因编码的氨基酸序列的表达产物-有抑制活性的特异候选化合物，能够开发具有新作用机理，有利于糖尿病的预防和治疗的降糖药物。
综上所述，本发明的目的是分离这样的新的GFAT基因，特别是在骨骼肌中特异性表达的GFAT基因。
本发明的公开
为了达到上述的目的，本发明的发明者进行了广泛的研究。并成功从人骨骼肌cDNA文库中克隆到新的能编码具有GFAT活性的蛋白的核苷酸序列cDNA。本发明就是在该成功克隆的基础上完成的，它涉及能在人骨骼肌和心脏中特异性表达的目的蛋白和基因。
因此，本发明提供
(1)基因，它包含下列(a)、(b)、(c)或(d)的多核苷酸
(a)能编码由SEQ ID NO1所示氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸，或者该多核苷酸的互补链；
(b)和能编码由SEQ ID NO1所示氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸至少有98％同源性的多核苷酸，或者该多核苷酸的互补链；
(c)能编码多肽的多核苷酸或该多核苷酸的互补链，该多肽由根据(a)的氨基酸序列组成，其中一个或多个氨基酸被缺失，替代，或增加，并且该多肽有GFAT的活性；或
(d)能编码多肽的多核苷酸或者该多核苷酸的互补链，该多肽由和依照(a)的氨基酸序列至少有98％的同源性的氨基酸序列组成；
(2)基因，它包含下列(a)或(b)的多核苷酸
(a)由SEQ ID NO2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，或者该多核苷酸的互补链；或
(b)在高度严格的条件下，能和由依照(a)的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交的多核苷酸；
(3)依照(2)的基因，它包含SEQ ID NO2所示的核苷酸序列；
(4)基因表达产物，它通过(1)或(2)中所述基因表达而产生；
(5)重组表达载体，它含有(1)或(2)中所述基因；
(6)宿主细胞，它含有(5)中所述的重组表达载体；
(7)转化体，它由(5)中所述的重组表达载体转化而来；
(8)由下列(a)、(b)或(c)所示的蛋白
(a)由SEQ ID NO1所示氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)由依据(a)的氨基酸序列组成的蛋白质，其中一个或多个氨基酸被缺失，替代，或增加，并且该多肽有GFAT的活性；或
(c)由和(a)中氨基酸序列至少有98％的同源性的氨基酸序列组成的蛋白质；
(9)一种治疗或预防低血糖的组合物，它包含作为活性成分的(1)或(2)中所述的基因，或(4)中所述的基因表达产物；
(10)一种治疗或预防低血糖的组合物，它包含作为活性成分的(8)中所述的蛋白；
(11)一种抗体，特别是单克隆抗体，它能和从(4)中所述的基因表达产物，(8)中所述的蛋白以及该产物和蛋白的片段中选择的任何一个结合。
(12)一种筛选候选化合物的方法，该化合物能抑制(1)中所述基因，(4)中所述基因表达产物或(8)中所述蛋白的酶活性，此方法包括(i)以竞争的方式将(11)中所述的抗体和含有候选化合物的待测液体，及标记的(8)中所述蛋白或该蛋白之部分肽进行反应；并测量和抗体结合的被标记的蛋白或部分肽的量；(ii)把含有候选化合物的待测液体同时或先后和上述的抗体及另外一个标记的抗体进行反应，抗体固定在载体上；并测量载体上标记物的活性；或(iii)测量当(8)中所述的蛋白或该蛋白的部分肽与底物接触时该蛋白或部分肽的酶活性，及当蛋白或部分肽和底物及候选化合物接触时该蛋白或部分肽的酶活性，并比较各种情况的酶活性；和
(13)(12)所述筛选方法使用的试剂盒，它包括用于测量的缓冲液，(8)中所述的蛋白或该蛋白的部分肽及作为底物的果糖-6-磷酸和谷氨酰胺。
本发明还提供
(14)一种在待测液体中定量测定由SEQ ID NO1所示氨基酸序列所组成的蛋白或该蛋白的片段的方法(下文中该蛋白可以称为“GFAT1L蛋白”)。该方法包括将待测液体与标记的GFAT1L蛋白或该蛋白的片段，以竞争的方式和针对以下基因的基因表达产物的抗体或针对GFATIL蛋白或该蛋白的片段(即部分肽)的抗体反应，所述基因是含有能编码由SEQ ID NO1所示氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸的基因或含有由SEQ ID NO2所示核苷酸序列组成的多核苷酸的基因(下文中，这里每一个基因可以称为“GFAT1L基因”)；并测量和抗体结合的标记的GFAT1L蛋白或该蛋白的片段的量。
(15)一种在待测液体中定量测定本发明蛋白或该蛋白的片段的方法。该方法包括把待测液和固定在载体上的(14)所述的抗体反应，并且同时或先后与抗另一个标记的GFAT1L蛋白的抗体进行反应；并测量载体上标记物的活性；
(16)一种药物，特别是治疗和预防糖尿病的药物，这种药物含有抗GFAT1L蛋白的抗体(优选的抗GFAT1L蛋白的抗体具有中和GFAT1L蛋白活性的功能)；和
(17)一种筛选能抑制GFAT酶活性的化合物的方法，该方法包括，测量当GFAT1L或该蛋白的片段和底物接触时，和当该蛋白或片段与底物及待测化合物接触时，GFAT1L蛋白或该蛋白的片段的酶活性，并比较各种情况的酶活性。
本发明还提供
(18)一种反义DNA，它含有和GFAT1L基因的DNA互补或基本上互补的核苷酸序列并且能抑制该DNA的表达；
(19)一种GFAT1L基因的反义DNA，含有基本上和GFAT1L基因的DNA互补的核苷酸序列，该核苷酸序列全部和该DNA互补或和该DNA的互补核苷酸序列至少有约98％(优选至少约99％)的同源性；和
(20)一种药物组合物，特别是治疗和预防糖尿病的组合物，包括GFAT1L基因的反义DNA。
在本发明的说明书中，氨基酸，肽，核苷酸序列及核酸的缩写参照 IUPAC-IUB 说明[IUPAC-IUB communication on BiologyNomenclature，Eur.J.Biochem.，1389(1984)]，“Guideline forpreparation of a specification containing a nucleotidesequence or an amino acid sequence”(the Japanese Patent Office编.)，及本领域采用的常规符号。
附图的简要说明


图1的照片显示本发明基因在器官中的表达模式，表示为通过RT-PCR得到的产物按照实施例2进行琼脂糖凝胶电泳的图。
图2是按照实施例4获得Km值和GFAT活性的抑制模式的图，这是以F-6-P为底物时，本发明GFAT1L的酶学特点。
图3是按照实施例4获得Km值和GFAT活性的抑制模式的图，这是以谷氨酰胺为底物时，本发明GFAT1L的酶学特点。
图4的图显示了按照实施例4获得的GFAT1L(GFAT的激活状态)的酶反应曲线。
实施本发明的最佳方式
本发明中的蛋白和基因将在下面进行更详细的描述。
本发明蛋白的一个特征性特点是该蛋白包含SEQ ID NO1所示的氨基酸序列或包含与SEQ ID NO1所示的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列。例如本发明的蛋白可以是来源于人的细胞，特别是人的横纹肌细胞，或来源于人的组织，特别是骨骼肌或心脏的蛋白。或者，本发明的蛋白可以是合成的蛋白。
和SEQ ID NO1所示氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列实例包括这样的氨基酸序列，它和SEQ ID NO1所示的氨基酸序列有至少98％，优选至少99％同源性；以及SEQ ID NO1所示序列中一个或多个氨基酸被缺失，替代或加入后的氨基酸序列。由和SEQ ID NO1所示氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列所组成的蛋白质的实例包括这样的蛋白它由和SEQ ID NO1所示氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列组成并且具有GFAT活性，该活性和本发明中由SEQ ID NO1氨基酸序列所组成的蛋白的活性在性质上基本相同。具体的实例包括下文所述GFAT1L基因的同源物的基因产物(GFAT1L的同源基因包括等位基因)，和哺乳动物如人，马，绵羊，牛，狗，猴子，猫，熊，大鼠和兔的具有相同的GFAT活性的蛋白质。
在此所使用的术语“性质上基本相同”指的是蛋白之间的GFAT活性在特征上(例如，生理的，化学的或药理的)是相同的。因此，蛋白之间的定量参数如GFAT活性的程度以及分子量可以有差别。
GFAT的活性可以用已知的方法进行测量；例如Marshall等的方法(Marshall，等，J.Biol.Chem 266(8)，4706-4712(1991))。
在此所使用的术语“GFAT活性”指的是如下文实施例所描述，以果糖-6-磷酸为底物，当GFAT活性被UDP-N-乙酰氨基葡萄糖抑制时，在混合抑制模式中所显示的GFAT活性。因此，这种GFAT活性和拮抗抑制模式中所显示的GFAT活性有明显区别。在下文中，本发明所特指的在混合抑制模式中所显示的GFAT活性就简称为“GFAT活性”。
上文所述的氨基酸缺失，替代或增加，可以在氨基酸序列的任意位点进行，只要含有改造后氨基酸序列的蛋白具有GFAT活性即可。类似的，所缺失，替代或增加的氨基酸的数目也是任意的，只要含有改造后氨基酸序列的蛋白具有GFAT活性。
本发明的基因编码骨骼肌及心脏特异的蛋白(GFATIL蛋白)，该蛋白由SEQ ID NO1所述氨基酸序列组成，有699氨基酸残基。该基因的具体实例包括从称为“GFAT1L”的PCR产物DNA序列推断而来的基因，下文的实施例要对它进行描述。该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO2所示，含有2097个核苷酸。
本发明的GFAT1L基因已证实具有新的核苷酸序列，其在McKnight等(McKnight，G.L.，等，J.Biol.Chem.，267，25208-25212(1992))克隆的GFAT基因的第684和685位核苷酸之间插入了54个核苷酸。
因此，本发明的基因所编码的氨基酸序列在McKnight等所报道的基因推断的氨基酸序列的第228和229位氨基酸中插入了18个氨基酸。
本发明的蛋白具有GFAT活性，可以作为例如减缓低血糖症的药物。针对本发明基因的反义DNA或该基因表达产物的抗体预期可以在糖尿病治疗中发挥作用，同时该抗体可以用于筛选作为治疗糖尿病药物的候选化合物。
在此所使用的术语“基因”包括双链DNA和单链DNA，如组成双链DNA的正义链和反义链。基因的长度没有特别的限制。因此，除非有特别的说明，本发明中的基因(DNA)包括含有双链DNA的人基因组DNA，含有单链DNA(正义链)的cDNA，和正义链互补的单链DNA(反义链)以及它们的片段。
本发明的基因(DNA)可以含有前导序列，编码区，外显子和内含子。该多核苷酸的实例包括RNA和DNA。DNA包括cDNA，基因组DNA及合成的DNA。具有特定氨基酸序列的多肽包括多肽的片段，多肽的同源物，多肽的衍生物，以及多肽的变体。
基因变体的实例包括自然发生的等位基因变体，非自然发生的变体，及发生缺失，替代，增加及插入的变体。这些变体所编码的多肽的功能没有实质变化。
多肽包括这样的多肽，它和该多肽的等位基因变体，同源物，或自然存在的多肽变体至少有98％，优选是99％的同源性。
本发明的基因表达产物的生物学活性即GFAT活性指的是，例如催化果糖-6-磷酸转化成6-磷酸葡萄糖胺的功能。GFAT活性还指的是提高人或哺乳动物血葡糖水平的功能。通过序列分析软件采用FASTA程序的测量，可以对DNA和多肽的同源性进行分析。(Cluster，V.，Method Mol.Biol.，25，307-318(1994))。
本发明的基因变体包括可引起氨基酸缄默或保守替代的变体。也就是说，这种基因变体的特征是，变体核苷酸序列所编码的氨基酸残基没有发生变化。
保守替代的氨基酸残基的类型如下所述。原始氨基酸残基保守替代的氨基酸残基丙氨酸 丝氨酸精氨酸 赖氨酸天冬酰胺谷氨酰胺，组氨酸天冬氨酸谷氨酸半胱氨酸丝氨酸谷氨酰胺天冬酰胺谷氨酸 天冬氨酸甘氨酸 脯氨酸组氨酸 天冬酰胺或谷氨酰胺异亮氨酸亮氨酸或缬氨酸亮氨酸 异亮氨酸或缬氨酸赖氨酸 精氨酸或谷氨酸甲硫氨酸亮氨酸或异亮氨酸苯丙氨酸甲硫氨酸亮氨酸，或酪氨酸丝氨酸 苏氨酸苏氨酸 丝氨酸色氨酸 酪氨酸酪氨酸 色氨酸或苯丙氨酸缬氨酸 异亮氨酸或亮氨酸
通常，一个或多个编码半胱氨酸的密码子影响特定多肽的二硫键，从而这样的半胱氨酸残基被缺失，且该氨基酸残基可以用另一个氨基酸残基代替。
和在上述列表的基础上进行的保守替代相比，当一个氨基酸残基被任意替代时，所得到的蛋白的特征有微小的变化。
通常预期会引起蛋白特征最大变化的替代类型如下所述
a)亲水的氨基酸残基如丝氨酸或苏氨酸被疏水氨基酸残基如亮氨酸，异亮氨酸，苯丙氨酸，缬氨酸或丙氨酸所替代；
b)半胱氨酸或脯氨酸被其他任何一种氨基酸残基所替代；
c)具有正电荷侧链的氨基酸残基如赖氨酸，精氨酸或组氨酸被具有负电荷侧链的氨基酸残基如谷氨酸或天门冬氨酸所替代；
d)有非常大侧链的氨基酸残基如苯丙氨酸被没有侧链的氨基酸残基如甘氨酸所替代。
本发明中的基因和基因表达产物提供了非常有用的信息和方法，用于阐明，了解，诊断，预防及治疗糖尿病。本发明的基因适用于开发新的药物用于抑制或诱导该基因的表达，该药物可用于上文所述治疗。检测能抑制或诱导本发明基因表达的基因产物在个体或组织中的表达，或者检测该基因突变(缺失或点突变)或异常表达，可以用于阐明或诊断糖尿病。
本发明中编码前面所述的经修饰氨基酸序列的基因可以用于检测本发明中编码未经修饰的氨基酸序列的基因。
本发明基因的具体实例包括但不仅限于GFAT1L基因，它的核苷酸序列编码的蛋白由SEQ ID NO1所示氨基酸序列组成。本发明的基因还包括了GFAT1L基因的同源物。
在此所使用的术语“GFAT1L基因的同源物”指的是被认为是一个基因家族的一系列相关基因，这些基因和本发明的GFAT1L基因(或基因产物)具有序列同源性，并和GFAT1L基因具有类似的上文所述的结构特征、基因表达模式及上文所述的生物学功能(比如，用FASTA程序获得的同源性)。GFAT1L基因同源物的实例包括这样一些多核苷酸，这些多核苷酸和具有编码由SEQ ID NO1所示氨基酸序列组成的蛋白的核苷酸序列的多核苷酸有至少98％同源性，优选至少有99％同源性。
上文所述的氨基酸序列的修饰(变异)可以通过如突变或翻译后的修饰自然发生。一个天然发生的基因(如，本发明的GFAT1L基因)可以进行人工修改。本发明包含具有上文所述特征的所有经修饰的基因，不管这些修饰或变异的原因和方法。本发明的基因包括编码蛋白的基因的等位基因，该蛋白由SEQ ID NO1所示氨基酸序列组成。
上文所述的人工方法的实例包括基因工程方法如定点诱变[Methods in Enzymology，154，350，367-382(1987)；Methods inEnzymology；100，468(1983)；Nucleic Acids Res.，12，9441(1984)；Zoku Seikagaku Jikken Koza 1″Idenshi Kenkyu-ho II，″NipponSeikagakkai ed.，p 105(1986)]；化学合成的方法，如磷酸三酯法和亚磷酰胺法[J.Am.Chem.Soc.，89，4801(1967)；J.Am.Chem.Soc.，93，3350(1969)；Science，150 178(1968)；TetrahedronLett.，22，1859(1981)；Tetrahedron Lett.，24，245(1983)]；以及上述各种方法的联合使用。更具体的是，利用亚磷酰胺法或磷酸三酯法，通过化学合成的方法合成DNA。或者，可以用商业化的自动化寡核苷酸合成仪合成DNA。双链DNA片段可以在合适的条件下，由化学合成的单链产物通过退火合成的互补链来产生，或者用合适的引物序列及DNA聚合酶增加互补链来产生。
本发明基因的特定实施方案包括具有SEQ ID NO2所示核苷酸序列的基因。核苷酸序列(编码区)显示了以下密码子组合的一个实例，这些密码子相应于SEQ ID NO1所示氨基酸序列中单个氨基酸残基。本发明的基因不限于这种具有特定核苷酸序列的基因；本发明的基因可以具有从与各个氨基酸残基相对应的任意密码子的组合中所选择出来的核苷酸序列。可用常规的方法进行密码子的选择。比如，密码子的选择可以考虑宿主的密码子使用频率来进行。[Nucleic Acids Res.，9，43(1981)]。
如上所述，本发明的基因包括由和SEQ ID NO2所示的核苷酸序列有一致同源性(consistent homology)的核苷酸序列组成的基因。
由和SEQ ID NO2所示核苷酸序列有一致同源性的核苷酸序列所组成的基因指的是由和SEQ ID NO2所述核苷酸序列有至少98％，优选的是至少99％同源性的核苷酸序列所组成的多核苷酸，或者是该多核苷酸的互补多核苷酸。
这种基因的实例包括其核苷酸序列在高度严格条件下，比如，在60℃，含有0.1％SDS的0.2×SSC或者60℃，含有0.1％SDS的0.1×SSC的条件下，和具有SEQ ID NO2所示核苷酸序列的DNA杂交的基团。
用常规的基因工程的方法很容易生产或获得本发明的基因，这些方法可基于与此处所公开的基因的特定实例有关的序列信息。[见Molecular Cloning 2d Ed，Cold Spring Harbor Lab.Press(1989)；Zoku Seikagaku Jikken Koza“Idenshi Kenkyu-ho I，II，III，”Nippon Seikagakkai ed.(1986)]。
具体而言，利用常规方法，从有本发明基因表达的合适来源中制备cDNA文库。并用本发明基因特异的合适的探针或抗体选择目的克隆[如，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，78，6613(1981)；Science，222，778(1983)]。
前面所述cDNA的来源的实例包括许多有本发明基因表达的组织和细胞，及从该细胞或组织来源的培养细胞。可用常规的方法从这些来源中分离RNA或mRNA，纯化mRNA，或获得和克隆cDNA。在本发明中，可以使用了商业化的mRNA或cDNA文库(如，Clontech Lab公司的产品)。
用于从cDNA文库中筛选本发明基因的方法没有特别的限制，可以用常规的方法进行筛选。筛选方法的特定实例包括，利用针对在cDNA基础上产生的蛋白的特异性抗体，通过免疫筛选，筛选和该蛋白相对应的cDNA克隆的方法；用和目的DNA序列特异结合的探针进行噬菌斑杂交；菌落杂交；及各种方法的联合使用。
用于筛选的探针可以是根据本发明基因核苷酸序列相关信息化学合成的DNA，或者是已获得的本发明的基因或基因片段。或者，用于筛选的探针还可以是在本发明基因核苷酸序列相关信息基础上设计的正义引物或反义引物。
用作上述探针的核苷酸序列是和SEQ ID NO2相对应的部分核苷酸序列，它具有15个或更多连续的核苷酸，优选是20个连续的核苷酸，较优选的是30个连续的核苷酸，更优选的是50个连续的核苷酸，这些核苷酸至少包含54个核苷酸的插入序列位点的部分核苷酸。或者，具有前述核苷酸序列的阳性克隆也可以用作探针。
本发明基因优选采用利用PCR的DNA/RNA扩增方法获得[Science，230，1350(1985)]。如果全长cDNA不易从库中获得，那么，优选采用RACE法[Rapid amplification of cDNA ends；JikkenIgaku，12(6)，35(1994)]，特别是5’-RACE法[M.A.Fronman等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，8，8998(1988)]。
该PCR使用的引物是在本发明所阐明的GFAT1L基因序列信息的基础上恰当设计的，能够采用常规的方法合成。扩增的DNA/RNA片段能够通过上述常规的方法分离、纯化；如凝胶电泳。
上述获得的本发明基因或DNA片段的核苷酸序列可以通过常规的方法确定，如双脱氧法[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，74，5463(1977)]或者Maxam-Gilbert法[Methods in Enzymology，65，499(1980)]。或者，也可以使用商业化的测序试剂盒方便地确定核苷酸序列。
当使用这样得到的本发明基因的部分或全部核苷酸序列时，可以特异地检测该基因在个体或不同组织中的表达。
基因表达的检测可以通过常规的方法进行。检测方法的实例包括利用RT-PCR[反转录PCR；E.S.Kawasaki，等，Amplification of RNA.In PCR Protocol，A Guide to Method and ApplicationS，AcademicPress，Inc.，San Diego，21-27(1991)]进行的RNA扩增；Northern杂交分析[Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Lab，(1989)]；原位RT-PCR[Nucl.Acids Res.，21，3159-3166(1993)]；采用细胞大小水平上的原位杂交测定；NASBA方法[Nucleic acid sequence-basedamplification，Nature，350，91-92(1991)]；以及其他各种方法。优选RT-PCR进行检测。
PCR反应中使用的引物并没有特殊限制，只要能够特异地扩增本发明的基因即可。引物可以根据本发明基因的核苷酸序列信息进行适当的设计。引物的实例包括这样的引物，它包含本发明基因的部分核苷酸序列，通常为约10至35个核苷酸，优选是约15到30个核苷酸。
本发明的基因包含用作检测该基因的特异性引物和/或特异性探针的DNA片段。
这些DNA片段的实例可以是和由SEQ ID NO2所示核苷酸序列组成的DNA在高度严格条件下杂交的DNA。高度严格条件没有特别限制，只要DNA片段能够作为引物或探针。例如，杂交能够在上文所述的条件下进行，即，60℃，含有0.1％SDS的0.2×SSC中，或者60℃，含有0.1％SDS的0.1×SSC中。
利用本发明基因，通过常规的基因工程技术，可以容易，持久，大量地获得基因产物(GFAT1L蛋白)或含有该基因产物的蛋白。
本发明也提供了蛋白，如本发明基因编码的GFAT1L蛋白；含有用于生产该蛋白的基因的载体；该载体转化的宿主细胞；以及通过培养该宿主细胞来生产蛋白的生产方法。
通过常规的基因拼接技术，根据本发明GFAT1L基因的核苷酸序列信息可以制备本发明的蛋白[例如，Science，224，1431(1984)；Biochem.Biophys.Res.Comm.，130，692(1985)；Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，80，5990(1983)]。
更具体的，按照下文所述生产这种蛋白制备能够在宿主细胞中表达编码目的蛋白的基因的重组DNA(表达载体)；重组DNA导入宿主细胞从而转化细胞；培养获得的转化体；从培养产物中回收目的蛋白。
原核细胞或真核细胞可以作为上述的宿主细胞。原核宿主细胞的实例包括广泛使用的大肠杆菌和枯草芽孢杆菌，优选的是大肠杆菌，特别优选的是大肠杆菌K-12株。真核宿主细胞的实例包括脊椎动物细胞和酵母细胞。优选的脊椎动物细胞包括猴COS细胞[Cell，23175(1981)]，中国仓鼠卵巢细胞及二氢叶酸还原酶缺陷的中国仓鼠卵巢细胞系[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，77，4216(1980)]。优选的酵母细胞包括酵母属(Saccharomyces)细胞。宿主细胞并不仅限于上述的实例。
当原核细胞作为宿主细胞时，使用能够在原核细胞中复制的载体。优选载体的实例包括表达质粒，该质粒包括本发明基因上游的启动子，SD(Shine-Dalgarno)序列，和对于起始蛋白合成必需的起始密码子(例如ATG)，以便使基因能够在宿主细胞中表达。通常，大肠杆菌来源的质粒如pBR322，pBR325，pUC12或pUC13，可以广泛作为上述载体。载体不仅限于上述实例，许多已知载体可以使用。可用于表达该基因的大肠杆菌来源的商业化表达载体的实例包括pGEX-4T(Amersham Pharmacia Biotech产品)；pMAL-C2和pMAL-P2(NewEngland Biolabs产品)；pET21，pET21/lacq，pBAD/His(Invitrogen产品)。
当脊椎动物细胞作为宿主细胞时，所使用表达载体的实例包括这样的载体，它含有位于将表达的本发明基因的上游的启动子，RNA拼接位点，多聚A位点，和转录终止序列。如有必要，载体可以包含复制原点。表达载体的特定实例包括具有SV40起始启动子的pSV2dfhr[Mol.Cell.Biol.，1854(1981)]。此外，也可使用多种商业化载体。用于该基因表达的脊椎动物细胞来源的商业化载体的实例包括动物细胞载体，如pEGFP-N和pEGFP-C(Clontech产品)，pIND(Invitrogen产品)和pcDNA3.1/His(Invitrogen产品)，以及昆虫细胞载体，如pFastBacHT(Gibco BRL产品)，pAcGHLT(PharMingen产品)，pAc5/V5-His，pMT/V5-His，pMT/Bip/V5-His(Invitrogen产品)。
当以酵母细胞作为宿主细胞时，采用的表达载体的特定实例包括具有相应于酸性磷酸酶基因的启动子的pAM82[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，80，1(1983)]。商业化酵母表达载体的实例包括pPICZ(Invitrogen产品)和pPICZα(Invitrogen产品)。
使用的启动子的类型没有特殊的限制。例如，当使用大肠杆菌作为宿主细胞时，优选采用色氨酸(trp)启动子，lpp启动子，lac启动子，recA启动子或者PL/PR启动子。当使用芽孢杆菌作为宿主细胞时，例如优选采用SP01启动子，SP02启动子，或penP启动子。当使用酵母作为宿主细胞时，优选采用例如pH05启动子，PGK启动子，GAP启动子，或者ADH启动子。当使用动物细胞作为宿主细胞时，优选采用例如源于SV40的启动子，逆转录病毒启动子，金属硫蛋白启动子，热休克启动子，megalovirus(巨病毒)启动子，或者SRα启动子。
优选常用的融合蛋白表达载体作为表达本发明基因的表达载体。融合蛋白表达载体的特定实例包括pGEX(Promega产品)，它用于表达该基因和谷胱甘肽S-转移酶(GST)形成融合蛋白。
增强表达和促进多肽从宿主细胞中分泌的多核苷酸序列包括分泌序列和前导序列。例如，当采用细菌作为宿主细胞时，可以使用用于纯化融合的成熟多肽的标记序列(六个组氨酸标签)。当利用哺乳动物细胞作为宿主时，采用血凝素(HA)标签。
将目的重组DNA(表达载体)导入宿主细胞并转化宿主细胞的方法并没有特别的限制，多种常规方法都可以采用。
这样获得的转化体可以采用常规方法培养。通过培养，由预先设计的基因所编码的本发明的目的蛋白获得表达，产生(聚集和分泌)于转化细胞的内侧或外侧，或者在转化细胞的质膜上。
和所使用的宿主细胞相对应，培养用的培养基可以从常规使用的多种培养基中选择。可以在适合宿主细胞生长的条件下培养。
如有需要，这样获得的本发明的重组蛋白可以通过基于该蛋白物理和化学性质的多种分离技术进行分离纯化[参见“BiochemistryData Book II，”pp.1175-1259，第一版，第一次印刷，1980年6月23日，Tokyo Kagaku Dojin出版；Biochemistry，25(25)，8274(1986)；Eur.J.Biochem.，163，313(1987)]。
分离技术的具体实例包括常规的重建处理(reconstructiontreatment)，蛋白沉淀(盐析)处理，离心，渗透压休克法，超声，超滤，分子筛层析(凝胶过滤)，吸附层析，离子交换层析，亲和层析，高效液相色谱(HPLC)，透析，及各种方法的组合。更优选用结合有本发明蛋白特异性抗体的亲和层析柱来分离。
当设计编码本发明蛋白的目的基因时，优选采用SEQ ID NO2所示的GFAT1L基因的核苷酸序列。如有必要，可以合适地选择及修饰相应于该蛋白氨基酸残基的密码子来进行基因设计。
本发明蛋白可以根据SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，通过通常的化学合成方法获得。合成方法的实例包括常规的液相或固相的肽合成方法。
肽合成方法的特定实例包括逐步延伸法，其中根据氨基酸序列信息将氨基酸顺序地彼此结合以延伸氨基酸链；以及片段缩合法，其中预先合成由几个氨基酸组成的片段，然后片段通过偶联反应彼此连接起来。本发明蛋白可以通过任何一种方法合成。
在这样的多肽合成中，利用常规方法进行缩合。缩合方法的实例包括叠氮化物法，混合酸酐法，DCC法，活性酯法，氧化还原法，DPPA(联苯基磷酰基叠氮化物)，DCC加成法(1-羟基苯并三唑，N-羟基琥珀酰胺，N-羟基-5-降冰片烷-2，3-二羧酰亚胺)法，Woodward法。
在这些方法中使用的溶剂可以从广泛用于多肽缩合反应的溶剂中适当地选择。这些溶剂实例包括二甲基甲酰胺(DMF)，二甲亚砜(DMSO)，六磷酰胺(hexaphophoroamide)，二噁烷，四氢呋喃(THF)，乙酸乙酯，以及以上溶剂的混合物。
在上述肽合成的反应中，氨基酸或肽的羧基端不参与反应，可以通过酯化反应保护，形成酯如低级烷基酯例如甲酯，乙酯，叔丁酯；芳烷基酯例如苯甲酯，对甲氧苯甲酯，对硝基苯甲酯。
氨基酸侧链的官能团例如酪氨酸残基的羟基可以通过乙酰基，苄基，苄氧羰基，叔丁基等基团来保护。然而，保护是任选的。另外，如精氨酸残基的胍基可以通过合适的保护基团如硝基，甲苯磺酰基，对甲氧苯磺酰基，亚甲基-2-磺酰基(methylene-2-sulfonyl group)，苄氧羰基，异冰片基氧羰基或金刚烷基氧羰基基团进行保护。
可以通过常规方法将上述氨基酸，多肽，本发明蛋白(终产物)的保护基团去除；例如催化还原或者使用试剂，如液氨/钠，氟化氢，溴化氢，氯化氢，三氟乙酸，乙酸，蚁酸，甲磺酸。
这样获得的本发明蛋白可以通过上述的多种方法纯化，例如，采用肽化学领域常用的方法；如，利用离子交换树脂，分配色谱，凝胶层析，逆流分配。
本发明蛋白适于作为免疫原以生产特异性抗体。通过使用这种免疫原，可以生产目的抗血清(多克隆抗体)和单克隆抗体。
生产抗体的方法本身是为本领域中技术人员所熟知的技术，因此，本发明抗体生产能通过常规方法获得[参见zoku-seikagaku jikkenkouza“method for studying immunobiology”，Japanes BiochemicalSociety编辑(1986)]。
这样获得的抗体可以方便地使用，例如用于纯化GFAT1L蛋白，通过免疫学方法分析和鉴定蛋白。更具体的是，因为已经证明本发明基因能够在骨骼肌和心肌组织中表达，所以抗体可以用于测定这些组织中GFAT的浓度。另外，以这种抗体为活性成分的药物可用于治疗和预防疾病，如糖尿病及其并发症。
这样获得的本发明的蛋白也可在药物领域用作一种药物，该药物将这种蛋白作为一种活性成分。相应的，本发明提供了一种包括这种蛋白作为活性成分的组合物。
如上文所述，本发明蛋白作为药物的优点在于，能促进作为葡萄糖代谢重要组织的骨骼肌中的特异性多肽的GFAT活性，或者起到促进缓解低血糖症的作用。这些活性能够用相应的方法证实，例如Marshall等[J.Biol.Chen.，266(8)，4706-4712(1991)]报道的方法，本说明书下文的实施例对其进行了说明。
在上述方法中，在GFAT的作用下形成的谷氨酸盐进一步与谷氨酸脱氢酶(GDH)反应时，APAD(辅酶)同时还原为APADH。测量伴随还原反应的吸光度改变，从而提供GFAT的活性。具体的，在这一方法中，适当稀释的GFAT1L大肠杆菌(E.coli)溶液的可溶性部分(50μ1)加入到放置于96孔微量反应板中的底物溶液[40mM磷酸钠缓冲液，pH7.5，50mM氯化钾，1.25mM EDTA，0.3mM APAD，6U/ml GDH，0-6mM谷氨酰胺，0-6mM果糖-6-磷酸(F6P)](200μl)中；混合物在37℃反应60分钟；使用微孔板读数仪利用分光光度测量法，在365nm处测量反应引起的吸光度的改变。
作为药物组合物中的活性成份的本发明蛋白也包括它的在药学上可接受的盐，这些盐通过本领域熟知的方法制备。这些盐的实例包括碱金属如钠、钾、锂的盐；碱土金属如钙、镁、钡的盐和铵盐。上述的盐还包括本发明蛋白与合适的有机酸或无机酸反应形成的酸加成盐，典型的酸加成盐实例包括盐酸盐、溴酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、醋酸盐、草酸盐、戊酸盐、油酸盐、月桂酸盐、硼酸盐、安息香酸盐、乳酸盐、磷酸盐、对甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、延胡索酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、磺酸盐、乙醇酸盐(glycollate)、马来酸盐、抗坏血酸盐、苯磺酸盐、萘基盐(naphthylates)。
前述药物组合物包括药学有效量的、作为活性成份的本发明蛋白，及与之组合的合适的药物载体或稀释剂。
可用于前述药物组合物(药物制剂)的药物载体的实例，包括相应于该制剂使用形式的典型稀释剂和赋形剂，特定的实例包括填充剂、疏松剂、粘合剂、增湿剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂。载体要根据待产生的制剂的单位服药形式适当选用。
优选采用用于蛋白制剂的各种典型成分制备本发明药物制剂，这类成分如稳定剂、杀菌剂、缓冲液、渗透压调节剂、螯合剂、pH调节剂和表面活性剂。
稳定剂的实例包括人血清白蛋白、典型的L-氨基酸、糖类、纤维素衍生物。这些稳定剂可单独使用或联合应用，也可与其它成分联合应用，例如表面活性剂。这些联合应用有可能增加活性成分的稳定性。
上述L-氨基酸没有特别限制，任何L-氨基酸，如甘氨酸、半胱氨酸、或谷氨酸都可用。
上述糖没有特别限制，可以用单糖，如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖；糖醇，如甘露醇、肌醇、木糖醇；二糖，如蔗糖、麦芽糖、乳糖；多糖，如葡聚糖、羟丙基淀粉、硫酸软骨素、透明质酸及它们的衍生物。
表面活性剂没有特别限制，无论离子型还是非离子型表面活性剂都可使用，实例包括聚氧乙烯二醇失水山梨醇烷酯、聚氧乙烯烷基醚、失水山梨醇单酰酯、脂肪酸甘油酯。
纤维素衍生物没有特殊限制，如甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素和羧甲基纤维素钠都可使用。
上述糖的合适用量为每微克活性成分中加入约0.0001毫克或更多，优选约0.01-10毫克；上述表面活性剂合适用量为每微克活性成分加入约0.00001毫克或更多，优选约0.0001-0.01毫克；人血清白蛋白合适用量为每微克活性成分中加入约0.0001毫克或更多，优选约0.001-0.1毫克；氨基酸的合适用量为每微克活性成分约0.001-10毫克；纤维素衍生物合适用量为每微克活性成分约0.00001毫克或更多，优选约0.001-0.1毫克。
加入到本发明药物制剂中活性成分的量在一个很大的范围内合适选择，适当控制在通常约0.00001-70wt.％，优选约0.0001-5wt.％。
本发明药物制剂可以含有各种添加剂，例如缓冲液、渗透压调节剂、螯合剂。缓冲液实例包括硼酸、磷酸、醋酸、柠檬酸、ε-氨基己酸、谷氨酸，和/或它们的盐(例如碱金属如钠、钾的盐和碱土金属如钙、镁的盐)。渗透压调节剂的实例包括氯化钠、氯化钾、糖、甘油。螯合剂的实例包括乙二胺四乙酸钠和柠檬酸。
本发明的药物制剂可以是溶液制剂形式。另外，也可以冻干制成可储藏形式的制剂，在使用的时候溶于水，含有生理盐水的缓冲液等，从而形成合适浓度的制剂。
本发明药物制剂的单位给药形式可根据治疗目的从多种形式中确定，典型的用药形式实例包括固体制剂如片剂、丸剂、散剂、粉末制剂、颗粒剂和胶囊药物；液体制剂如溶液、混悬剂、乳剂、糖浆、配剂；这些用药形式根据用药途径可分为多种形式，如口服药剂、肠胃外药剂、鼻导管药剂、阴道用药剂、栓剂、舌下剂、软膏，这些剂型可以根据相应的典型方式混合、成形和制备。
例如，要制备片剂，可以使用多种制剂载体。实例包括赋形剂，如乳糖、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、碳酸钙、高岭土、结晶纤维素、硅酸、磷酸钾；粘合剂，如水、乙醇、丙醇、简单糖浆、葡萄糖溶液、淀粉溶液、明胶溶液、羧甲纤维素、羟丙纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮；崩解剂，如羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙、低取代度的羟丙基纤维素、干淀粉、藻酸钠、琼脂粉、海带多糖粉、碳酸氢钠、碳酸钙；表面活性剂，如聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯、月桂基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯；防崩解剂，如蔗糖、硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油；促吸收剂，如季胺碱、月桂基硫酸钠；保湿剂，如甘油和淀粉；吸附剂，如淀粉、乳糖、高岭土、膨润土、胶质硅酸；润滑剂，如纯化的滑石、硬酯酸盐、硼酸粉和聚乙二醇。
另外，片剂可随意选用传统包衣材料进行包衣，从而形成包衣片剂。这些包衣片剂的实例包括糖衣片剂、胶衣片剂、肠溶衣片剂、薄衣片剂；另外，片剂可做成双层片剂或多层片剂。
当制备丸剂时，可以使用制剂载体，包括赋形剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、高岭土、滑石；粘合剂，如阿拉伯胶粉、西黄蓍胶粉、明胶、乙醇；崩解剂，如海带多糖、琼脂。
可以通过常规方法制备胶囊制剂，将本发明活性成分和上述例举的制剂载体混合，然后用硬明胶或软材料制成胶囊药物。
口服液体制剂包括药学可接受的溶液、乳剂、混悬剂、糖浆、酏剂，它们含有通常使用的无活性稀释剂，如水。液体制剂也可进一步含有佐剂，如保湿剂、乳化剂、悬浮剂，这些制剂都可通过常规方法制备。
当药物制剂制备成肠胃外使用的液体制剂时，如灭菌的水溶液或非水溶液、乳剂、混悬剂，可以使用稀释剂如水、乙醇、丙二醇、聚乙二醇、乙氧基化异硬脂醇(ethoxylated isostearyl alcohol)、聚氧化异硬脂醇、聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯；或植物油如橄榄油。另外，也可以加入可注射的有机酯如油酸乙酯。这些液体制剂还可含有典型不溶佐剂如缓冲液、保湿剂、乳化剂、混悬剂、防腐剂、分散剂。
灭菌方法包括使用细菌不能通过的滤膜过滤、加入灭菌剂、辐射、加热。另外，液体制剂可以使用灭菌水或适当灭菌介质在用前溶解灭菌的固体成分制成。
当制剂形成栓剂和阴道用药药物时，制剂的载体可用如聚乙二醇、可可脂、高级醇、高级醇酯、明胶及半合成的甘油酯。
当制剂形成软膏如膏剂、霜剂、凝胶剂时，所用的稀释剂包括白矿酯、石蜡油、甘油、纤维素衍生物、丙二醇、聚乙二醇、硅酮、膨润土，和植物油如橄榄油。
鼻导管或舌下给药的药物组合物，可采用已知的标准赋形剂通过常规的方法制备。
本发明的药物可以含有添加剂如着色剂、防腐剂、香料、香味剂、甜味剂及其他药剂。
上述药物制剂的用药方法没有特殊限制，由剂型、患者状况例如年龄、性别、疾病的严重程度等条件来确定。特别的，片剂、丸剂、液体剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、胶囊剂可口服用药。注射剂可单独静脉使用也可与常规补充剂如葡萄糖或氨基酸联合使用。如有必要，可以采用肌肉注射、皮内注射、皮下注射或腹膜内注射的方式。栓剂可直肠用药，阴道药物通过阴道给药，鼻剂用于鼻腔，舌下剂舌下含服，膏剂用于皮肤。
上述药物制剂中活性成分的量和用药剂量并没有特定限定，这些量要根据情况在一个广泛的范围适当选择，这些情况包括预期的治疗效果、给药方法、疗程及患者的情况比如年龄和性别。总之，每天的用药剂量常规为每公斤人体重0.01微克到10微克，优选0.1微克到1毫克，这些制剂可每天以单剂量用药或分开用药。
这样获得的本发明的骨骼肌特异性多肽，即本发明的蛋白，具有GFAT活性，并且该蛋白或蛋白片段本质上可用作缓解低血糖的制剂。
如下文所述实施例显示，经证实在骨骼肌组织和心肌中有本发明基因的表达。因此，通过制备包含本发明GFAT1L基因全部或部分反义DNA的任意基因表达载体，并采用该载体产生具有同骨骼肌组织细胞中mRNA互补的序列的RNA，抑制翻译，从而有目的的抑制GFAT1L的基因表达。因此骨骼肌中氨基己醣生物合成途径中GFAT活性能够被抑制，从而促进细胞摄入葡萄糖，导致血糖浓度降低。结果葡萄糖代谢得到改善，糖尿病的发展得到抑制或者缓解，本发明的基因可能用作具有抗糖尿病作用的基因治疗组合物或者具有相同活性的基因治疗剂。
本发明也提供了一种可用于基因治疗的载体，该载体包含了全部或部分的GFAT基因。还提供一种药物，该药物含有作为活性成分的，并且利用这一载体导入了GFAT基因的细胞。
因此，本发明提供了一种用于基因治疗的导入载体，该载体包括含有SEQ ID NO2所示反义基因的全部或部分序列的GFAT1L反义基因；一种细胞，其通过采用这种载体已导入GFAT1L反义基因；一种基因治疗剂，该治疗剂含有作为活性成分用于基因治疗的导入载体和采用该载体已导入了GFAT1L反义基因的细胞。
本发明也提供一种糖尿病的治疗剂，其特征是将用于基因治疗的导入载体(其含有GFAT1L的反义基因，该基因包括SEQ ID NO2所示的反义DNA序列的全部或者部分)和用该载体导入GFAT1L反义基因的细胞施用到糖尿病患者的骨骼肌细胞或肌肉组织位点，从而提高这些组织的葡萄糖代谢和抑制糖尿病的发展或改善糖尿病患者的葡萄糖代谢。
此外，本发明提供一种药物，该药物含有作为活性成分的病毒导入载体，载体含有上述提到的GAFT1L反义基因，以用于基因治疗；特别是例如用于治疗以改善骨骼肌的葡萄糖代谢的这样的药物。
依照本发明的基因治疗将随后描述。除非特别指出，常规的化学、分子生物学、微生物学、重组DNA技术，遗传学和免疫学技术都可以用来进行下文描述的基因治疗。这些方法的实例见Maniatis，T.等，分子克隆实验指南(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，New York(1982))；Sambrook，J.等，分子克隆实验指南第二版(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York(1981))；Ausbel，F.M.等，当代分子生物学方法，JohnWiley and Sons，New York，New York，(1992)；Glover，D.，分子克隆I和II(Oxford Press)(1985)；Anand，复杂基因组的分析技术，(Academic Press(1992))；Guthrie，G.等，酵母遗传学和分子生物学指南，(Academic Press(1991))；和Fink，等，Hum.gene Ther.3，11-19(1992)。
本发明提供一种基因治疗方法来抑制GFAT的活性或者抑制血葡萄糖水平的增高。此方法通过提供反义药物，在有本发明基因表达的细胞中产生与mRNA序列互补的RNA序列，抑制翻译和抑制GFAT1L基因的表达。
上述基因治疗方法是通过抑制转录或者翻译步骤来抑制目的基因表达的一种方法，例如在含有GFAT1L基因的GFAT表达细胞中结合合适的mRNA或者在DNA双螺旋中结构中插入形成一个三链而达到抑制。这种方法被认为是产生与基因mRNA互补的反义寡核苷酸，并且反义寡核苷酸转移到靶细胞中的一种方法。
如果提供抑制GFAT1L基因表达功能的作用，则可以抑制受体细胞/靶细胞中GFAT的活性和血葡萄糖水平的升高。采用含有反义寡核苷酸的载体或者质粒，寡核苷酸可以导入靶细胞中而仍位于染色体外。
采用前述的反义寡核苷酸对糖尿病进行基因治疗，将反义寡核苷酸整合入逆转录病毒，腺病毒或者来自腺相关病毒的载体中，表达GFAT活性的细胞用这些病毒或者载体转染，由此超量表达反义寡核苷酸。这样，能够达到理想的血葡萄糖水平降低的效果。
在反义寡核苷酸导入含有GFAT1L基因的细胞以抑制GFAT1L蛋白表达的情况中，反义寡核苷酸不必等同于相应GFAT1L基因的全长。例如，也可以使用上述改造物和含有保持特定功能的部分序列的基因，只要这些种类核酸具有的功能实质上等同于抑制GFAT1L基因表达的功能。
这些用于导入目的基团以便重组和在染色体外维持的载体，在本领域中是已知的，任何已知的这类载体都可以用于本发明。载体的实例包括病毒载体和质粒载体，它们包含GFAT1L反义寡核苷酸的拷贝，该拷贝被连接到表达控制元件上，可以在靶细胞中表达反义寡核苷酸产物。虽然前述的表达载体可以用作上述的载体，但是优先使用原始载体如美国专利出版号No.5,252,479和PCT国际出版号WO93/07282所公开的(例如，pWP-7A，pWP-19，pWU-1，pWP-8A，pWP-21，和/或RSVL)或者采用pRC/CMV(Invitrogen公司产品)制备的载体。更优先使用的是下面所描述的多种病毒载体中的任何一种。
至于在基因转移治疗载体中使用的启动子，应优先使用病患部位组织特异的启动子，这些组织是疾病治疗的靶标。
启动子的特定实例将随后描述。与骨骼肌有关的启动子实例包括骨骼肌肌动蛋白，肌球蛋白重链和肌酸激酶。心脏有关的启动子实例包括心钠素，心室特异的肌球蛋白轻链、心房特异的α-肌球蛋白重链和心室特异的α-肌球蛋白重链。涉及肝脏的启动子实例包括白蛋白，甲胎蛋白，α1-抗胰蛋白酶，转铁蛋白，苯乙烯转移蛋白(transstyrene)。涉及结肠的启动子实例包括抗原如羧酸脱水酶I和癌胚抗原。涉及子宫和胎盘的启动子实例包括雌激素、芳香化酶细胞色素P450，胆固醇侧链裂解酶P450和17α-羟基化酶P450。
涉及前列腺的启动子实例包括前列腺抗原、gp91-fox基因和前列腺特异的激肽释放酶。涉及乳腺的启动子实例包括erb-B2，erb-B3，β-酪蛋白，β-乳球蛋白和乳蛋白。涉及肺的启动子实例包括激活蛋白C尿球蛋白(uroglobulin)。涉及皮肤的启动子实例包括K-14角蛋白、人角蛋白1或6，和leukorin。
涉及脑的启动子实例包括胶质原纤维酸性蛋白，成熟星形胶质细胞特异蛋白，髓鞘碱性蛋白，酪氨酸羟化酶。与脾有关的启动子的实例包括villin，胰高血糖素，胰岛淀粉样多肽、淀粉酶和PAP1。涉及甲状腺的启动子实例包括thioglobulin和降钙素。涉及骨的启动子实例包括α1胶原，骨钙蛋白和骨唾液酸糖蛋白。涉及肾的启动子实例包括肾素、肝/骨/肾碱性磷酸酶和促红细胞生长素
在制备用于导入反义寡核苷酸的载体时，如前所描述，基于本发明基因的核苷酸序列信息上，可以很容易的用常规基因工程方法制备和收集将要导入的反义寡核苷酸(相应于GFAT1L基因序列的互补序列的全部或者部分)。
可以采用在DNA导入细胞领域中众多已知方法中的任何一种将用于导入反义寡核苷酸的载体导入细胞。这些方法的实例包括电穿孔、磷酸钙共沉淀和病毒转导。可以使用实质上被转化了GFAT1L基因的反义寡核苷酸的细胞以分离状态作为药物，抑制GFAT的活性或者提高血葡糖水平或者作为一种模型用于研究它的治疗效果。
在基因治疗时，用于导入上述反义寡核苷酸的载体可通过局部注射到组织位点或者常规注射以导入患者的靶细胞。当常规注射载体时，载体可以到达在其他部位表达GFAT mRNA的任何一个细胞。如果每一个靶细胞不能永久摄取转导的基因以进入染色体，那么可以定期重复注射。
本发明的基因治疗既包括体内方法，即将用于导入上述反义寡核苷酸的材料(用于导入反义寡核苷酸的载体)直接用于人体，又包括离体方法，即从患者的体内取出靶细胞，基因在体外导入细胞，然后细胞再转移到体内。
或者，通过直接将GFAT1L基因的反义寡核苷酸导入细胞和使用核酶-切割RNA链的活性分子-的基因治疗也是可行的。
下面描述了本发明的基因治疗药物，该药物包含作为活性成分的基因导入载体和通过该载体将人GFAT1L基因的反义寡核苷酸导入其中的细胞。其中，所导入的基因含有其序列相应于本发明GFAT1L基因的反义寡核苷酸的全部序列或部分序列。这种药物尤其适用于糖尿病。然而，除了糖尿病，上述基因治疗(处理)也可以用于治疗糖尿病并发症，例如糖尿病性神经病、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病，或者进行遗传学标记。
反义寡核苷酸导入的靶细胞可以根据基因治疗(处理)的靶标进行适当的选择。除了骨骼肌组织和心肌组织外，靶细胞的实例——证实有GFAT表达的细胞——包括淋巴细胞、成纤维细胞、肝细胞、造血干细胞。
与上述基因治疗有关的反义寡核苷酸导入方法包括采用病毒的方法和不采用病毒的方法。
采用病毒的方法的实例包括将逆转录载体用作载体的方法，该方法基于这样一个标准，GFAT1L基因的反义寡核苷酸是在正常细胞中表达的外源物质。其他病毒载体的实例包含腺病毒载体、HIV(人免疫缺陷病毒)载体、AAV(腺相关病毒)、疱疹病毒载体、HSV(单纯疱疹病毒)载体和EBV(Epstein-Barr病毒)载体。
不采用病毒的方法的实例包括磷酸钙共沉淀方法；膜融合脂质体方法，其中包含DNA的脂质体和事先通过UV射线照射灭活的仙台病毒融合在一起，这样产生一个膜融合的脂质体，然后这样形成的脂质体直接与细胞膜融合，由此将DNA导入细胞[Kato，K.，等，J.Biol.CHem.，266，22071-22074(1991)]；物理导入DNA的方法，其中将被金包被的质粒DNA置于一个高压放电场中[Yang，N.S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.，87，9568-9572(1990)]；裸DNA方法，其中将质粒DNA直接注射到器官或者靶组织中[Wolff，J.A.，等，Science，247，1465-1467(1990)]；阳离子脂质体方法，它是将置于正电荷多层脂质体中的基因导入细胞[Kunio Yagi，Igaku noAyumi，第175卷，No.9，635-637(1995)]；配体-DNA复合物方法，其中为了将基因完全导入特定的细胞中，而不是其它细胞，将DNA连接到和在靶细胞表达的受体相结合的配体上，并施用这样形成的复合物[Frindeis，等，Trends Biotechnol.，11，，202(1993)；Miller，等，FASEB J.，9，190(1995)]。
上述配体-DNA复合物方法的实例包括这样一种方法，它采用无唾液酸糖蛋白作为配体，并采用肝细胞表达的无唾液酸糖蛋白受体作为靶标[Wu，等，J.Biol.CHem.266，14338(1991)；Ferkol，等，FASEB J.，7，1081-1091，(1993)]；还包括另一种方法，它采用靶细胞强烈表达的转铁蛋白受体作为靶受体，转铁蛋白作为配体[Wagner，等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，87，3410(1990)]。
本发明采用的基因导入细胞的方法包括上述的生物学和物理学基因导入方法的适当组合。这种组合方法的实例包括这样的方法，它将特定大小的质粒DNA和偶联多聚赖氨酸的针对腺病毒六邻体蛋白的特异抗体进行组合。在该方法中，形成的复合物连接到腺病毒载体上，然后将形成的三分子复合物转染细胞，籍此导入本发明的反义寡核苷酸。该方法中，可以在偶联到腺病毒载体的DNA破坏之前获得有效的连接、形成内源包涵体以及分解核内体。上述的脂质体/DNA复合物可以直接在体内介导基因导入。
制备用于导入本发明反义寡核苷酸的病毒载体的方法和将反义寡核苷酸导入靶细胞和靶组织的方法随后将明确描述。
逆转录病毒载体系统包含病毒载体和辅助细胞(包装细胞)。“辅助细胞”一词指的是表达基因——如逆转录病毒的结构基因gag(病毒颗粒中的结构蛋白)，poi(逆转录酶)， 或者env(包膜蛋白)——但没有形成病毒颗粒的细胞。病毒载体包括包装信号和LTR(长末端重复序列)，但是不包括病毒复制的结构基因，如gag，pol或env。包装信号是在病毒颗粒组装过程中作为标签的一段序列，而选择标记(基因)(neo，hyg)以及插入克隆位点中的需导入的目的反义寡核苷酸(总的反义寡核苷酸相应于GFAT1L或其片段)插入病毒中代替病毒基因。为了得到高滴度的病毒颗粒，很重要的是要限制插入片段的长度为尽可能的短，扩大包括部分gag基因在内的包装信号，以及防止gag基因的ATG仍残留在那个位置。
通过把含目的GAFTlL基因反义寡核苷酸的载体DNA转移到辅助细胞，载体基因组RNA由辅助细胞产生病毒的结构蛋白包装，由此在辅助细胞中形成病毒颗粒，并且从辅助细胞中分泌出病毒颗粒。在作为重组病毒颗粒的该病毒颗粒转染靶细胞后，病毒基因组RNA逆转录形成DNA，并整合到靶细胞的核中，籍此表达插入在载体中的反义基因。
为增强基因导入的效率，可以使用利用了具有细胞黏附结构域的纤溶酶片段、肝素结合位点、和连接片段[Hanenberg，H.，等.Exp.Hemat.，23，747(1995)]的方法。
用于上述逆转录病毒载体系统的载体实例包括源于鼠白血病病毒的逆转录病毒[McLachlin，J.R.，等，Proc.Natl.Acad.Res.Molec.Biol.，38，91-135(1990)]。
采用腺病毒载体的方法将随后详述。腺病毒载体可以根据Berkner，K.L.[Curr.Topics Microbiol.Immunol.，158，39-66(1992)]；Setogμchi，Y.，等[Blood，84，2946-2953(1994)]；Hiromi Kanegae，等[Jikken Igakμ，L2，28-34(1994)]；或Ketner，G.，等［Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，91，6186-6190(1994)]所描述的方法进行制备。
例如，为制备非增殖型腺病毒载体，去除腺病毒启始基因的El和/或E3区。然后，用包含有所需的目的外源基因表达单元(包含要导入的反义寡核苷酸，如本发明GAFT1L基因的反义寡核苷酸；用于转录反义寡核苷酸的启动子；用于保证转录基因稳定性的多聚A(poly-A))和部分腺病毒基因组DNA的质粒载体以及包含腺病毒基因组的质粒共转染细胞，如293细胞。两种质粒进行同源重组，E1替代基因表达单元，或者相反，从而制备非增值型腺病毒载体—该载体包含有目的GFAT1L基因的反义寡核苷酸。另外，将腺病毒基因组DNA整合入粘粒中，也可以制备加入3’-端末端蛋白的腺病毒载体。此外，酵母人工染色体载体可以用于制备重组腺病毒载体。
腺相关病毒载体(AAV)的生产将概括描述。腺相关病毒是作为混杂在腺病毒培养体系中的小病毒被发现的。在腺相关病毒中，已经证实存在以下两组病毒Parvoviridae以自调控的方式在宿主细胞中增殖，复制时不需要辅助病毒，Dependoviridae复制时需要辅助病毒。腺相关病毒是具有广泛宿主范围的普通病毒，很容易感染多种细胞。每一个病毒的基因组包含一个4680个核苷酸的线性单链DNA，每个末端145个核苷酸具有特征序列，称为ITR(末端反向重复)。末端反向重复序列作为复制的起点并且具有引物的功能。另外，末端反向重复区对于腺相关病毒包装成病毒颗粒，并整合到宿主细胞的染色体是至关重要的。至于病毒蛋白，基因组的左侧由非结构蛋白组成。这样，该病毒蛋白编码Rep——负责复制和转录的调节蛋白。
重组腺相关病毒可以根据腺相关病毒进入细胞染色体DNA的特点来产生，由此产生用于基因导入的目的载体。更具体的是，在这种方法中产生一个质粒(腺相关病毒载体质粒)，其中有目的导入的反义寡核苷酸(GFAT1L基因的反义寡核苷酸)插在野生型腺相关病毒5’和3’端之间，而保留每一末端的ITR序列。相反，对于病毒的复制和形成病毒颗粒必须的病毒蛋白由另一个辅助质粒提供。必须提供这样两个没有共有核苷酸序列的质粒，因此，没有重组野生型病毒产生。随后这些质粒通过转染导入细胞，如293细胞。转染的细胞进一步被作为辅助病毒的腺病毒感染(如果采用293细胞，可以采用非增殖型病毒)，由此产生目的非增殖型重组腺相关病毒。由于这样产生的腺相关病毒仍旧保留在细胞核中，通过冻融相关的细胞收集重组的腺相关病毒，56℃加热灭活混杂其中的腺病毒。任选地，可以使用氯化铯通过超速离心分离及浓缩重组的腺相关病毒。以上述的方式，可以得到理想的用于基因导入的腺相关病毒。
EB病毒载体可以根据相应的方法产生，例如Norio SHIMIZU等所描述的。[Cell Engineering，14(3)，280-287(1995)]。
用于产生EBV载体以导入本发明的反义寡核苷酸的方法将概括描述。EB病毒(Epstein-Barr病毒EBV)是属于疱疹病毒科的一种病毒，在1964年，首先由Epstein等从来源于Burkitt淋巴瘤的培养细胞中分离出来[Kieff，E和Liebowitz，D.Virology，2nd ed.，Raven Press，New York，1990，第1889-1920页]。由于EB病毒具有转化细胞的活性，必须制备缺乏转化活性的病毒以获得导入基因的载体。可以按下述方式进行制备。
具体地，首先克隆EB病毒基因组于目的外源基因导入区附近的靶DNA中。导入外源基因DNA片段和药物抗性基因到克隆的基因组中，由此形成一个用于制备重组病毒的载体。随后，用载体转染EB病毒阳性的Akata细胞，以产生重组病毒，而后用合适的限制酶进行酶切。通过同源重组形成的重组病毒接受刺激——通过抗表面免疫球蛋白的处理进行—以生产病毒，而后与野生型Akata EB病毒一同收集。用病毒混合物转染EB病毒阴性的Akata细胞，在药物存在时筛选药物抗性株，这样得到只被目的重组病毒感染的Akata细胞，而不包含野生型EB病毒。而且，通过给予重组病毒感染的Akata细胞以病毒活性，目的重组病毒载体可以大量生产。
非病毒病毒载体可以导入目的反义寡核苷酸进入靶细胞中，而不需要重组病毒载体，它们可以通过例如使用膜融合脂质体进行基因导入的方法来制备。该方法通过给膜脂质体(形成脂双层的小泡)赋予与细胞膜融合的活性，将脂质体的内容物直接导入细胞。
在采用前述的膜融合的脂质体进行反义寡核苷酸导入时，例如可以采用Nakanishi，M.，等[Exp.Cell Res.，159，388-499(1985)；和Gene Introduction into Animal Tissues，in Trends and FuturePerspectives in Peptide and Protein Drug Delivery(ed.By Lee，V.H.等).，Harwood Academic Publishers Gmbh.Amsterdam，1995，第337-349页]描述的方法。
采用膜融合的脂质体将反义寡核苷酸导入的方法将随后概述。具体地，基因经紫外线灭活的仙台病毒和脂质体在37℃融合，脂质体包含着多聚体物质如目的反义寡核苷酸和表达蛋白。这样形成的膜融合的脂质体内部包括源于非融合脂质体的腔，外部包括类似于病毒包膜的突起。这样，膜融合的脂质体具有一个假病毒结构。膜融合的脂质体进一步通过蔗糖密度离心纯化，随后在4℃吸附到靶培养细胞或者组织细胞上。通过提高温度到37℃，脂质体的内容物导入细胞。这样，目的反义寡核苷酸可以导入靶细胞中。优选用作脂质体的脂是合成的磷脂，含有50％(摩尔)胆固醇和卵磷脂，并带负电荷，并且优选形成直径300nm的单层脂质体。
为采用其他的脂质体把反义寡核苷酸导入靶细胞，可采用使用了阳离子脂质体的反义寡核苷酸导入方法。该方法主要参照Yagi等的方法实行[B.B.R.C.，196，1042-1048(1993)]。此方法基于下列事实质粒和细胞都带负电荷，因此给脂质体膜的内表面和外表面都赋予正电荷，可以通过静电促进质粒的摄取，以增强与细胞的相互作用。此处优选采用的脂质体是带正电荷的大的多层脂质体(多层大微囊MLV)。然而，目的反义寡核苷酸也可以通过制备质粒和大的单层脂质体(大单层微囊LUV)或小的单层脂质体(小单层微囊SUV)的复合物来导入。
将概述制备包含质粒的阳离子MLV的方法。具体地，TMAG脂(N-(α-三甲基氨乙酰基)-二月桂酰基-D-谷氨酸氯化物)，DLPC(二月桂酰基磷脂酰胆碱)和DOPE(二油基磷脂酰乙醇胺)融于氯仿中，以制备三种成分摩尔比为1∶2∶2的溶液(脂浓度为1mM)。随后，总量包含1μmol脂的部分溶液置于Spitz待测管中，并在旋转蒸发仪中通过减压蒸馏的方法去除氯仿，由此制备脂薄膜。进一步减压去除残留的氯仿，干燥膜，而后将含有导入基因的质粒(20μg)的Dulbecco磷酸盐缓冲液(含Mg，Ca)(0.5ml)加到脂膜上，空气经过氮气净化。混合物用涡旋混合器搅拌两分钟，籍此产生包埋有质粒的阳离子MLV悬液，其含有目的反义寡核苷酸。
这样得到的含质粒的阳离子MLV可以用作基因治疗药物。例如，将导入了待表达的目的反义寡核苷酸的表达质粒包埋在前述的阳离子MLV中，使得DNA和脂质体的量分别控制在0.6μg和30nmol，这样得到的含质粒的阳离子MLV悬于磷酸盐缓冲液中(2μl)。每隔一天将悬液给药到取自患者的靶细胞或者患者的靶组织中。
卫生与福利部(日本)指南中“基因治疗”一词定义为“一个基因或者基因转移的细胞施用给人体以治疗疾病”。然而，除了指南中的上述定义外，根据本发明所指的基因治疗包含转移反义寡核苷酸到前述的靶细胞以治疗糖尿病及其并发症，反义寡核苷酸的特征是GFAT1L基因的抑制GFAT-表达的反义DNA。基因治疗也包括将标记基因或者将含有标记基因的细胞导入人体。
本发明所述的基因治疗中，转移目的基因进入靶细胞或靶组织的典型方法实例包括下述两种方法。
第一种方法是基因转移方法，它通过含有目的反义寡核苷酸(GFAT1L基因的反义寡核苷酸)的病毒载体如腺病毒载体直接转染患者的靶细胞或者靶组织。
或者，作为第一种方法的另一种变化形式，可以采用体外方法，其中，将患者来源的细胞用含有目的反义寡核苷酸(GFAT1L基因的反义寡核苷酸)的病毒载体转染或者与含有病毒载体的产病毒细胞共培养，由此将目的反义寡核苷酸导入靶细胞，然后将细胞移植到患者体内。
第二种方法是直接的基因转移方法(直接方法)，其中将反义寡核苷酸(GFAT1L基因的反义寡核苷酸)整合到合适的靶动物细胞表达载体质粒DNA中，再直接注射到患者的靶位点，例如身体或者骨骼肌。注射可以按照这些方法进行，如HVJ脂质体方法，阳离子脂质体方法，直接DNA注射，电穿孔或者基因枪方法。
当实施上述的方法时，优选事先证实目的反义寡核苷酸(GFAT1L基因的反义寡核苷酸)是否真正导入，特别是通过体外初步测定，如PCR获得载体基因cDNA或者原位PCR。或者，优选确定特异活性的增加和减少——由目的反义寡核苷酸(GFAT1L基因的反义寡核苷酸)的转移而产生的期望的治疗效果——和对靶细胞的效果。勿用多说，当采用病毒载体实施基因治疗时，重要的是在PCR反应获取增殖的病毒的基础上，证实与反义寡核苷酸导入有关的安全性，
本发明也提供一种药物组合物或者药物制剂(基因治疗制剂)，它包含药学有效量的作为活性成分的用于转移本发明的反义寡核苷酸的载体或者导入了目的反义寡核苷酸(GFAT1L基因的反义寡核苷酸)的细胞，和合适的非毒性的药物载体或者稀释剂。
可以用于上述药物组合物(药物制剂)的药物载体的实例包括按照制剂的使用形式，常用的稀释剂和赋性剂。特定的实例包括填料、增量剂、粘合剂、加湿剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂，所需要载体要按照所生产的制剂的给药形式进行适当的选择和使用。
制剂给药形式的实例包括与上述GFAT1L蛋白抗体制剂有关而描述的那些形式，而且该形式可根据治疗目的，从不同的形式适当选择。
例如，将含有用于导入本发明反义寡核苷酸的载体的药物制剂制成包在脂质体中的载体或制成被含有目的反义寡核苷酸的病毒感染的培养细胞。
这些制剂可以加入到磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中，林格液，用于注射的胞内成分流体等。另外，这些制剂可以和例如鱼精蛋白的一类物质联合使用以增强基因转移的效率。
上述的药物制剂的给药方法没有特殊的限制，根据各种情况如药物制剂类型、年龄、性别及患者的其他状况和病情的严重程度来定。
活性成分加入到上述的药物组合物中的量和该组合物的剂量没有特殊限制。它们根据所需的治疗效果、服用方式、治疗周期、患者的年龄和性别以及其他状况等在广泛的范围内决定。
药物组合物可以一天施用一次，或者将每天的剂量分成多次。这些组合物也可以以一周或者多周的间隔使用。优选鱼精蛋白或者类似的可以增强基因转移效率的物质，或者含有这些物质的组合物，和该药物组合物联合使用。
当按照本发明的基因治疗用于治疗糖尿病时，上述描述的不同类型的基因治疗可以适当地联合使用(联合基因治疗)。同样，上述的基因治疗可以和常规的胰岛素治疗、营养疗法等方法联合使用。此外可以参照NIH指南进行本发明的基因治疗，包括治疗的安全性。(Recombinant DNA Advisory Committee，Human Gene Therapy，4，365-389(1993))。
根据本发明，可以通过制备生物样品如血液和血清，必要时抽提核酸，并证实GFAT1L-敏感基因的存在来检测GFAT1L基因——引起细胞GFAT活性——的存在。同样，根据本发明，细胞或组织中GFAT活性水平和GFAT mRNA表达水平，以及氨基己醣生物合成途径调节紊乱的病程或者预后指标，都可以通过制备涉及氨基己醣生物合成途径调节紊乱的生物样品并检测GFAT1L基因的存在或者确定GFAT1L基因mRNA的量来确定。采用本发明的这种方法使检测组织或者细胞GFAT活性水平和GFATE mRNA表达水平成为可能，也可以鉴定氨基己醣合成途径调节紊乱的病程或者预后指标，因而实现所提到的功能紊乱的诊断(如糖尿病)，确定对于糖尿病的治疗效果，预测糖尿病治疗的预后。
根据检测方法，采用以前已证明具有GFAT活性的患者样品，以这些样品中的GFAT1L基因有关的信息为基础，设计并且制备DNA片段用于筛选GFAT1L基因和/或扩增该基因。更具体的，可以设计和制备片段作为探针，用于噬斑杂交，菌落杂交，southern印迹、northern印迹等，或者制备片段作为探针，用于获得通过聚合酶链式反应(PCR)(其中用聚合酶扩增核酸序列)扩增的GFAT1L DNA的完整或者部分片段。为达到该目的，第一步是制备具有同GFAT1L序列一致的引物，所得的引物用作筛选探针和与生物样品(核酸样品)反应。这样，可以证实存在具有GFAT1L序列的基因。可以通过多种有利于检测目的序列的方法来制备核酸样品，如变性、限制酶消化、电泳、点杂交等。
按照敏感性的观点，筛选方法优选PCR。只要能采用GFAT1L片段作为引物，PCR没有特别的限制。可以采用通常的已知方法(Science，230，1350-1354(1985))或者最近发展的改进(或者将在未来使用)的PCR(″Jikken Igaku″special issμe，8(9)(1990)，YoshiyukiSakaki等编，Yodosha出版；″Tanpakushitu，Kakusan，Koso″35(17)(1990)，extra edition，by Kyoritsu Shuppan K.K出版)。
作为引物的DNA片段是化学合成的寡DNA，也可以通过自动DNA合成仪合成，如DNA合成仪″Pharmacia LKB Gene Assembler Plus″(Pharmacia产品)。
这样合成的引物长度优选10-50个核苷酸(正向引物或者反向引物)，更优选15-30核苷酸。在这方面，合成的引物序列优选能区别于其他任何已知的GFAT DNA序列。通常，用于上述筛选的探针是标记的探针。然而，探针也可以不标记，根据与标记配体的特异接合，直接或者间接检测。用于标记探针或者配体的合适的标记物和方法在本发明的技术领域中是已知的。例如，可以用放射性标记物、生物素、荧光基团、化学发光基团、酶、抗体、或者类似物，这些物质可以通过已知的方法，如切口翻译、随机引物、或者激酶处理，掺入探针或者配体中。
用于这种检测目的的PCR方法可以被称为RT-PCR，也可以采用各种改进的PCR方法。
此外，利用检测样品中GFAT1L基因的试剂盒，本发明的分析方法能够容易而且方便地进行。
相应的，本发明提供用于检测GFAT1L的试剂盒，其特征是试剂盒中含有前述的GFAT1L DNA片段。
试剂盒包括作为其基本部分的DNA片段，该片段可以和完整或者部分SEQ ID NO2的核苷酸序列或其互补的核苷酸序列杂交。该试剂盒含有其他部分，例如标记试剂和PCR必须试剂(如Taq DNA聚合酶、脱氧核糖三磷酸、引物等)，这些部分是可选的。
标记试剂的实例包括化学修饰物如放射性同位素和磷。本质上DNA片段可以事先同标记试剂偶联。此外，出于分析便利，试剂盒可以包含合适的试剂，如稀释液、标准抗体、缓冲液、洗涤液和反应终止液。
本发明也提供采用上述的分析方法诊断葡萄糖代谢失调，尤其是氨基己糖生物合成失调的方法；该方法中采用的诊断试剂和诊断试剂盒。
当采用以上描述的分析方法时，从待测样品中获得的GFAT1L可以直接或者间接测序，从而有利于鉴别相关的基因，即与新的GFAT1L基因相关的基因，同野生型的GFAT1L基因具有很高的同源性。
这样，本发明也提供一种在待测样品中筛选人GFAT1L相关基因的方法，该方法包括上面描述的分析方法和对待测样品中的GFAT1L DNA测序。
通过采用由人GFAT1L基因编码的本发明SEQ ID NO1所示多肽，一个或者多个氨基酸被缺失、替代、或者插入的SEQ ID NO1的氨基酸序列或者其片段，可能合成多肽或者多肽的抗体，能够用于分析野生型GFAT1L和/或突变的GFAT1L。
因此，本发明为抗野生型GFAT1L抗体和/或抗突变型GFAT1L抗体以及相应的抗原提供分析方法。通过采用本发明的分析方法，在野生型GFAT1L多肽的变化的基础上可以确定下述情况GFAT活性水平，葡萄糖调节失调的程度、氨基己醣生物合成途径失调的严重程度、糖尿病的严重程度、糖尿病并发症如糖尿病性神经症、糖尿病性视网膜病、糖尿病性肾病等的严重程度。尽管这些变化可以通过前述本领域中的常用技术对GFAT1L测序来确定，但优选采用抗体(或者多克隆或者单克隆的)来检测GFAT1L多肽存在的任何变化，或者是否存在GFAT1L多肽。在本发明分析方法的特定实例中，GFAT1L抗体可以与下述液体中的GFAT1L蛋白免疫沉淀，该液体包含采集自人的生物样品，如血液和血浆，而且该抗体可以在聚丙烯酰胺凝胶上进行western印迹或者免疫印迹时与GFAT1L多肽反应。采用免疫组化技术，GFAT1L抗体也可以用于检测石蜡包埋切片或者冰冻组织切片中的GFAT1L多肽。用于产生和纯化抗体的技术在本领域中是众所周知的，因此可以从中适当选择合适的技术。
可用于检测野生型GFAT1L或者其变异体的优选方法的特定实例包括酶联免疫吸附分析(ELISA)，放射性免疫分析(RIA)，放射性免疫测量分析(IRMA)和免疫酶测量分析(IEMA)。这些方法基于夹心方案，采用单克隆和/或多克隆抗体。
在本发明筛选方法用于筛选作为GFAT活性抑制药物的候选化合物的一个可能的实施方案中，可以定量确定GFAT1L蛋白或者它的部分肽。简要地说，抗GFAT1L基因表达产物或者GFAT1L蛋白(下文这两个合称GFAT1L蛋白)或者它的片段的抗体竞争性地与含有候选化合物的待测液和标记的GFAT1L蛋白或者其部分肽反应，并测定与抗体结合的标记的GFAT1L蛋白或者其部分肽的量。
下述分析也可能用于定量确定待测液中含有的GFAT1L蛋白或者它的部分肽含有候选化合物的待测液先后或同时和固定在载体上的抗体反应及与其他抗GFAT1L蛋白的标记抗体反应。
根据筛选可抑制GFAT1L蛋白或者它的部分肽的酶活性(如GFAT活性)的另一个可能方法，对于下面两种情况，即底物和GFAT1L蛋白或它的部分肽接触，及底物和待测化合物两者与GFAT1L蛋白或它的部分肽接触，测量GFAT1L蛋白或它的部分肽的酶活性，比较两种情况的结果。
在上述的方法中，底物没有特定的限制，只要它可以作为本发明的蛋白或者GFAT1L蛋白部分肽的底物。典型采用果糖-6-磷酸或者谷氨酰胺。当采用果糖-6-磷酸时，优选采用放射性同位素标记的(如14C，3H等)果糖-6-磷酸。待测化合物的实例包括但不限于肽、蛋白、非肽化合物、合成化合物、发酵产物、细胞抽提物、植物抽提物、动物组织抽提物和血液。所述化合物可以是新化合物或者已知的化合物。
在实施上述描述任一筛选方法时，本发明的蛋白或者GFAT1L蛋白的部分肽悬于适合筛选目的的缓冲液中，由此制备含有该蛋白或者该部分肽的样品。可以使用任何一种pH在约4和10之间的缓冲液(优选约6到8)，例如磷酸盐缓冲液，Tris-HCl缓冲液等，只要这些缓冲液不抑制本发明的蛋白或者GFAT1L蛋白的部分肽与底物的结合。
可以通过已知的方法来测量本发明的蛋白或者GFAT1L蛋白的多肽片段(部分肽)的GFAT活性，例如根据Marshal等提供的方法。(Joμrnal of Biological Chemistry，vol.266，No.8，4706-4712(1991))。
例如，适当稀释的表达GFATI-L的大肠杆菌裂解物(50μL)加到200μL底物溶液(400mM磷酸钠缓冲液(pH7.5)，50mM氯化钾，1.25mM EDTA，0.3mM APAD，6U/ml谷氨酸脱氢酶(GDH)，0-6mM谷氨酰胺，0-6mM果糖-6-磷酸(F-6-P))中，最终的溶液置于96孔微量反应板的孔中，在37℃反应60分钟。用微量板阅读仪测量365nm吸光度的变化。按照这样进行的GFAT活性分析，GFAT产生的谷氨酸进一步与谷氨酸脱氢酶(GDH)反应。反应同时产生APAD(一种辅酶)，伴随着APAD到APADH的还原反应的吸光度变化被认为代表了GFAT活性。
或者，也可以采用Smith等描述的方法(AnalyticalBiochemistry，98，478-480，1979)。该方法如下进行。简要地，本发明的蛋白或者GFAT1L蛋白的部分肽加入到如下混合物中，混合物中含有12μM的果糖-6-磷酸，5μM谷氨酰胺和0.2M磷酸缓冲液(pH8.0)，最终的溶液在25℃孵育30分钟。在溶液中加入0.5M HCl，反应在98℃持续2小时。然后依次加入2.5％NaNO2和12.5％NH4O3NH2，然后加入0.25％2-甲基-2-苯并噻唑啉酮(thiazolone)。随后，加入0.5％FeCl3，分析最终的溶液在650nm的吸光度值，由此定量测定产生的氨基葡萄糖-6-磷酸的量。
在上述的每一个方法中，可以按照下述方法选择候选药物化合物。例如，如果与加入待测化合物的情况相比，不加上述待测化合物时测量的GFAT活性抑制约20％或者更多，优选约30％或者更多，更优选约50％或更多，则选择此待测化合物作为可以抑制本发明的蛋白或者GFAT1L蛋白部分肽的GFAT活性的化合物。
根据本发明，在此提供了一个筛选试剂盒用于筛选可以作为药物抑制前述GFAT活性的候选化合物。
本发明的筛选试剂盒包括作为其构成成分的本发明的蛋白或者GFAT1L蛋白的部分性肽，本发明的筛选试剂盒的特定实例将在下文描述。
1.筛选试剂盒I
1)GFAT1L样品50μl表达GFAT1-L的大肠杆菌裂解物(GFAT1L蛋白的部分性肽)
2)含辅酶的缓冲液400mM磷酸钠缓冲液(pH 7.5)，50mM氯化钾，1.25mM EDTA，0.3mM APAD，6U/ml谷氨酸脱氢酶(GDH)
3)底物0-6mM果糖-6-磷酸，0-6mM谷氨酰胺
检测时，测量365nm的吸光度值适当稀释的表达GFAT1-L的大肠杆菌裂解物(50μl)，加入到200μl底物溶液(400mM磷酸钠缓冲液(pH 7.5)，50mM氯化钾，1.25mM EDTA，0.3mM APAD，6U/ml谷氨酸脱氢酶(GDH)，0-6mM谷氨酰胺，0-6mM果糖-6-磷酸(F-6-P))中，所得的溶液置于96孔微量反应板的孔中，而后在37℃反应60分钟。采用微量板阅读仪确定365nm处的吸光度变化。
2.筛选试剂盒II
1)蛋白样品本发明的蛋白(GFAT1L蛋白的部分肽)或其盐
2)缓冲液0.2M磷酸钠缓冲液(pH 8.0)
3)底物12μM果糖-6-磷酸，5μM谷氨酰胺
检测时，测定650nm的吸光度值待测化合物加入到含有12μM果糖-6-磷酸，5μM谷氨酰胺，本发明的蛋白(或其盐)，和0.2M磷酸钠缓冲液(pH 8.0)的反应混合物中，最终的混合物在25℃孵育30分钟。而后加入0.5MHCl，并在98℃水解2小时。而后加入2.5％NaNO2和12.5％NH4O3NH2，随后加入0.25％2-甲基-2-苯并噻唑啉酮。最后加入0.5％FeCl3，所得溶液在650nm分析吸光度。
可以采用本发明的筛选方法或者本发明的筛选试剂盒获得的化合物或者它的盐是从上述的待测化合物(例如，多肽，蛋白，非多肽化合物，合成化合物，发酵产物，细胞抽提物，植物抽提物，动物组织抽提物)中选择的化合物，可以抑制本发明的蛋白(GFAT1L蛋白的多肽片段)的酶活性(例如，GFAT活性)。这些化合物可以为新化合物或者已知化合物。候选的改善低血糖症的化合物是可以促进本发明蛋白(GFAT1L蛋白的多肽片段)的酶活性(如GFAT活性)的化合物。
这种化合物的盐的实例包括在该化合物和生理可以接受的酸(如无机或者有机酸)形成的盐，或者在该化合物和碱(如碱金属)之间形成的盐。特别优选生理可接受的酸形成的酸加成盐。盐的实例包括但是不限于化合物和无机酸(如盐酸、磷酸、氢溴酸、硫酸)之间形成的盐和化合物和有机酸(如乙酸、甲酸、 丙酸、延胡索酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、安息酸、甲磺酸、苯磺酸)之间形成的盐。
可以抑制本发明蛋白(包括GFAT1L蛋白的部分肽，下文指的是相同的意思)的酶活的化合物和它的盐可以作为一种治疗或预防糖尿病及糖尿病并发症等的药物。
可以促进本发明蛋白的酶活的化合物和它的盐可以作为一种治疗和预防低血糖和低血糖并发症等的药物。
根据本发明，可能制备多肽或者其结构的类似物——例如GFAT1L促效剂，GFAT1L拮抗剂，GFAT1L抑制剂——用于开发药物来增强或者降低GFAT1L蛋白，或者GFAT1L蛋白的活性和稳定性增强的衍生物的体内活性。结构类似物可以通过这种方式确定，例如对GFAT1L和另一个蛋白之间形成的蛋白复合体的三维结构进行X-光晶体分析，计算机模拟或者结合两者使用。关于结构类似物的结构信息也可以根据同源蛋白的结构通过蛋白的模拟获得。
丙氨酸扫描是获得活性更高或者稳定性更好的GFAT1L蛋白衍生物的一个方法实例。依据丙氨酸扫描，某些氨基酸残基可以被丙氨酸代替，测量其对肽活性的效应。这样，对肽的各个氨基酸残基进行类似的分析有助于确定对于肽的活性和稳定性起关键作用的区域。通过采用这种方法，可以设计活性或者稳定性更好的GFAT1L蛋白衍生物。
也可能采用功能性分析分离标记特异的抗体，并分析这些抗体的晶体结构。这种策略通常提供药核(pharmacore)，药核可以作为随后药物设计的基础。生产针对这些具有功能和药学上的活性的抗体的抗独特性抗体，使从化学或者生物学产生的肽的肽库中鉴别和分离多肽成为可能。这样，预期所选择的肽也可以作为药核。
因此，可能设计和开发提高GFAT1L的活性和稳定性，并具有不同的功能的药物，例如作为抑制剂、增效剂、拮抗剂。
GFAT1L序列的克隆使GFAT1L蛋白的分析研究，如X-射线晶体学分析，在获得足量的GFAT1L蛋白时成为可能。而且由SEQ ID NO1所示的氨基酸序列形成的GFAT1L蛋白可应用于计算机模拟技术以取代X射线晶体学分析或者补充X射线晶体学分析。
进一步，根据本发明，可以培育GFAT1L基因敲除鼠或者GFAT1L-基因敲入(knock in)鼠(突变鼠)，这种老鼠用于鉴别GFAT1L基因序列内的如下位点，这些位点影响上述的各种不同GFAT1L活性；或者换句话说，影响GFAT1L基因产物或者GFAT1L基因产物变异体在生物体内所展现的功能。
该方法引出一项技术，该技术利用基因的同源重组，有目的地修改活生物体的遗传信息，在一个范例方法中，采用了鼠胚胎干细胞(ES细胞)(Capeccchi，M.R.，Science，244，1288-1292(1989))。
在这一点上，建立上述的突变鼠的方法已经成为本领域中熟练技术人员的常规方法。通过将人类野生型GFAT1L基因或者突变型GFAT1L基因与该技术的改进方案(参见″Jikken Igaku，″special issue，14(20)，1996；edited by Testuo Noda，published by Yodosha)相结合，可以容易地建立突变鼠。这样，可以设计和开发提高GFAT1L活性或者稳定性，并具有不同的功能的药物，例如抑制剂、增效剂或者拮抗剂。
实施例
下面将以举例的方式更详细描述本发明。
实施例1 GFATIL的克隆和表达载体的构建
为构建已知的人GFAT(G.L.MeKnight等，J.Biol.Chem.，267，25208-25212(1992))的表达载体，参照该人GFAT cDNA序列合成P1-P44个引物，这些引物的核苷酸序列如SEQ ID NO3-6所示。
P1相应的核苷酸序列从SEQ ID NO2的第34位到第66位核苷酸，P2相应的核苷酸序列从SEQ ID NO2的第16位到第48位核苷酸，P3相应的核苷酸序列从SEQ ID NO2的第1位到第30位核苷酸，P4相应的核苷酸序列从SEQ ID NO2的第2077位到第2097位核苷酸。为了增加在大肠杆菌细胞中表达效率和增强密码子置换效率，在正向引物P1-P3下列位点引入突变。P1SEQ ID NO3的第6位、第9位、第12位、第13位、第15位、第18位核苷酸。P2SEQ ID NO4的第7位、第9位、第18位、第24位、第27位、第30位、第31位、第33位核苷酸。P3SEQ ID NO5的第22位、第32位、第34位核苷酸。
加入了P3核苷酸序列相应于SEQ ID NO5的第一位到第十位核苷酸的部分，以便引入Ndel位点(CATATG)，该位点是有效插入pET载体所必须的。
P4是一个包含C端氨基酸残基之后的Xho I位点(CTCGAG；指SEQID NO6的第1位到第11位的核苷酸序列)的反向引物。引物设计时恰在Xho I位点前插入一个终止密码子(TAA)。
使用上述四个引物，按下述的方法构建载体，载体中的一些密码子被替换，使得有利于N-端氨基酸残基在大肠杆菌细胞中合成。
逆转录反应在人骨骼肌mRNA(购自Clontech Co.，Ltd.)上，采用引物P4和逆转录酶进行。人骨骼肌mRNA(2μg/μl)在100℃变性5分钟，随后迅速在冰上冷却。在混合物中加入Tris-CL(pH＝8.3；50mM)、氯化钾(40mM)、氯化镁(6mM)、1mM DTT、引物4(0.1mM)、BSA(0.1mg)、MMLV逆转录酶(GIBCO BRL Co.Ltd.产品400单位/2μl)和去离子水(DDW)，终体积为50μl，混合物在37℃反应10分钟。
反应产物(5μl)100℃变性5分钟，随后用引物P1和P4按照下述方式进行PCR反应。在逆转录反应的产物(5μl)中加入10x缓冲液(5μl)、2mM dNTPs混合物(5μl)、两种引物(每种0.4μM)、氯化镁(1mM)、KOD dash(2.5单位)和DDW，因此终体积为50μl。10x缓冲液含有Tris-CL(pH＝8.0；1.2mM)、氯化钾(100mM)、硫酸铵(60mM)、Triton X-100(1％)和BSA(0.1mg/ml)。这样得到的混合物反应30个循环，每循环条件为95℃，30秒；65℃，2秒和74℃，60秒；随后74℃5分钟。
这样得到的产物(5μl)进行PCR，除了使用引物为P2和P4外，条件与上面描述相似。
这样得到的产物(5μl)进一步进行PCR反应，除了使用引物为P3和P4外，条件与上面描述相似。
最终的产物克隆到pET23b中(Novagen Co.，Ltd.产品)，采用ABI377DNA测序仪(PE-ABI Co.，Ltd.产品)证实它的DNA序列。
终产物用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，随后溶于TE缓冲液中。用限制酶NdeI和XhoI切下DNA两端。
采用限制酶NdeI和XhoI获得的DNA片段通过连接插入pET23b载体中。
这样得到的基因序列通过测序证实是一个新序列。该基因被命名为″GFAT1L基因″。
这样得到的基因的编码区全长由2097个碱基组成，如SEQ ID NO2所示。碱基序列编码的氨基酸序列由699个氨基酸残基组成，如SEQ IDNO1所示。该基因是一个编码氨基酸序列的人类cDNA(全长2097个碱基)
本发明的GFAT1L基因证实是一个新基因，其序列在下述人GFAT基因的第684和第685位碱基间插入了54个碱基，所述人GFAT基因由McKnight等克隆(McKnight，G.L.，等，J.Biol.Chem.，267，25208-25212(1992))。由本发明GFAT1L基因序列编码的蛋白的氨基酸序列具有这样的结构，序列在第228位和第229位氨基酸残基之间包含18个氨基酸残基的插入序列。
在以后描述的实验中，本发明人分离的该新基因称作″GFAT1L基因″，McKnight等的人GFAT基因称为″GFAT1S基因″。
实施例2
采用RT-PCR研究了不同组织器官中GFAT1L基因的表达模式，并比较了GFAT1L基因和GFAT1S基因的表达模式。
采用快速克隆(QUICK-Clone)cDNAs(Clontech Co.，Ltd.产品；心、脑、肝、骨骼肌、小肠、肾、胰腺和脂肪)作为待测样品。
引物序列如SEQ ID NO7和8所示，合成并使用这些引物，同时使用ExTaq(Takara Shμzo Co.，Ltd产品)。
PCR首先在95℃反应1分钟，随后进行40个反应循环，每循环包括95℃，30秒，55℃，30秒和72℃，45秒。部分反应产物在4％琼脂糖凝胶上电泳，从而得到每一个基因的表达型式。
结果见图1。
图1中各泳道给出的图例和相应的组织器官如下(在括号中位于相应的图例后)
分子量标准(分子量标准)，心脏(心脏)，脑(脑)，肝(肝)，骨骼肌(骨骼肌)，肾(肾)，胰腺(胰腺)，小肠(小肠)和脂肪(脂肪)。
如图1所示，证明GFAT1L基因在心脏和骨骼肌中表达很强，在脑中表达很弱。也证明只有GFAT1S基因在所测的其他器官中表达。
因此，本发明基因的表达是组织特异性控制的。
实施例3
制备GFAT1L重组蛋白
人GFAT1L基因或者GFAT1S基因(出于比较目的)插入pET23b载体(Novagen Co.，Ltd.产品)中，使用这样得到的载体转化BL21-CodonPlus(DE3)RIL(Stratagene Co.，Ltd.产品)。转化体在37℃含氨苄青霉素的LB培养基中培养过夜。第二天，将液体培养物(50ml)加入至含氨苄青霉素的LB培养基(1L)中，在37℃继续培养90分钟。向这样得到的混合物中加入1M异丙基β-D-(-)-硫代吡喃型半乳糖苷(IPTGWako Pure Chemicals Industries，Ltd.产品2ml)，在20℃培养过夜，由此诱导重组蛋白的表达。
这样得到的液体培养物于7000rpm离心5分钟，收集大肠杆菌细胞，大肠杆菌细胞用Dulbecco’s PBS(-)于0℃洗一次(NihonPharmaceutical Co.，Ltd.产品；50ml)。随后，用二硫苏糖醇(DTT5mM)和含20％甘油的磷酸盐缓冲液(pH＝8.0；50mM)重旋沉淀，终体积为40ml。超声处理悬液，以裂解细胞。裂解物于4℃30，000rpm超离30分钟，并从中移去不溶成分。
按照前述的方式，得到含有目的重组蛋白的上清。上清分成不同的份(每份1ml)，采用液氮迅速冰冻，储存在-80℃备用。
实施例4
GFAT1L和GFAT1S特性差别的研究
1. GFAT活性分析方法
GFAT的活性参照Marshall等的方法，按照下述方式采用微量反应板(96孔)进行分光光度测量法来确定(Journal of BiologicalChemistry，vol.266，No.8，4706-4712(1991))。将GFAT产生的谷氨酸盐同谷氨酸脱氢酶(GDH)反应，在此过程中，辅酶APAD生成APADH的还原反应同时进行。伴随着APAD到APADH的还原反应所产生吸光度的变化被认为代表了GFAT的活性。
简要地，适当稀释导入了GFAT1L或者GFAT1S的大肠杆菌的裂解液(50μl)，并加入到底物溶液中(200μl)，底物液含有磷酸钠缓冲液(pH＝7.5；40mM)，氯化钾(50mM)，EDTA(1.25mM)，APAD(0.3mM)，GDH(6U/ml)，谷氨酰胺(0-6mM)和果糖-6-磷酸(F-6-P0-6mM)，混合物在37℃反应60分钟。采用微量反应板阅读器测量在365nm与反应有关的吸光度变化。
2.GFAT1L和GFAT1S酶学特征的差别
为研究GFAT1L和GFAT1S酶学特点的差别，采用谷氨酰胺和果糖-6-磷酸作为底物，测定Km值。Km根据S/v-S作图和v-v/S作图计算，这些图参照了酶的底物浓度(S)和酶的活性(反应速率(v))而作出的。采用S/v-S作图，Km值根据X-轴和作图所得到的线的交叉点来计算(交叉点相应于″-Km″)，而采用v-v/S作图，Km值根据线的斜率计算(斜率＝-Km)。
由于已经报道尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)可以抑制GFAT的活性(Journal of Biological Chemistry vol.241，1705-1712(1966))，也分析了它的抑制类型。通过作图获得的线的外观确定抑制型式，方法类似上述方法。
结果见图2、3及表1。
图2显示在以果糖-6-磷酸为底物的条件下，UDP-N-GlcNac对GFAT1S和GFAT1L的GFAT活性的抑制型式。Y-轴代表酶的反应速率(v)，X-轴代表(反应速率(v))/(酶底物的浓度(s))。
在图2中，左侧的图显示GFAT1S的结果，而右侧的图显示GFAT1L的结果。两个图中，线1代表没有UDP-GlcNAc加入时的结果，线2代表加入UDP-GlcNAc(30μM)时的结果，线3代表加入UDP-GlcNAc(100μM)时的结果，
如图2所示，对于GFAT1S，Km值是90μM，对于GFAT1L，为478μM，两者对GFAT活性的抑制型式分别为″竞争性抑制″(GFAT1S的情况)和″混合抑制″(GFAT1L的情况)。
图3显示在以谷氨酰胺为底物的条件下，UDP-GlcNAc对GFAT1S和GFAT1L的GFAT活性的抑制型式。Y-轴代表酶的反应速率(v)，X-轴代表比率(反应速率(v))/(酶底物浓度(s))。
在图3中，左侧的图显示GFAT1S的结果，而右侧的图显示GFAT1L的结果。图3的图中，线1代表没有UDP-GlcNAc加入时得到的结果，线2代表加入UDP-GlcNAc(10μM)时得到的结果，线3代表加入UDP-GlcNAc(30μM)时得到的结果，线4代表加入UDP-GlcNAc(100μM)时得到的结果。
如图3所示，GFAT1S的Km值为822μM，而GFAT1L为804μM，对GFAT活性的抑制类型分别为″非竞争性抑制″(对于GFAT1S)和″混合型抑制″(对于GFAT1F)
表1
图2、图3和表1表明当采用果糖-6-磷酸时，GFAT1S(约100μM)和GFAT1L(约500μM)的Km值差异显著；当采用谷氨酰胺时，GFAT1S(约800μM)和GFAT1L(约800μM)的Km值没有显著差异。
UDP-GlcNAc表现下面的抑制类型当采用果糖-6-磷酸作为底物时，GFAT1S的抑制是竞争性抑制，而GFAT1L的抑制是混合抑制，其中竞争性和非竞争性抑制同时存在；然而，当采用谷氨酰胺作为底物时，GFAT1S的抑制是反竞争性抑制，GFAT1L的抑制是混合型抑制，其中反竞争性抑制和另一种抑制类型同时存在。
根据上述的结果，证明本发明的GFAT1L和人GFAT的酶学特征存在下述的差别(1)对于果糖-6-磷酸，本发明的GFAT1L的Km值为人GFAT1的约5倍；(2)UDP-GlcNA的抑制类型是不同的。
3.GFAT1L对胰岛素耐药的影响的研究
在体内和体外实验中，已经报道GFAT可以影响胰岛素的耐药性。然而，本发明人发现的新基因揭示存在两种亚型的GFAT；即GFAT1L和人GFAT(GFAT1S)。下文将讨论GFAT1L和人GFAT(GFAT1S)对胰岛素耐药性的影响程度。
通常，经过胰岛素刺激，健康人约70％的血糖在骨骼肌中代谢。相反，据报道在II型糖尿病患者骨骼肌中葡萄糖利用率低至30％，而在其他的组织器官中，葡萄糖的利用率与健康人相同(Journal ofClinical Investigation，76(1)，149-155(1985))。这样，认为骨骼肌主要体现了胰岛素抗性。已经发现本发明的GFAT1L在骨骼肌中表达，而GFAT1S不在其中表达。因此认为本发明的GFAT1L是影响骨骼肌中胰岛素抗性的主要因素。
对GFAT1S和GFAT1L的酶学性质研究表明(1)对于果糖-6-磷酸，本发明的GFAT1L的Km值是GFAT1S的约5倍高，(2)由于细胞内的谷氨酰胺浓度是4-5mM，GFAT活性依赖于胞内的果糖-6-磷酸浓度，联系以前的报道(3)在II型糖尿病患者红细胞中果糖-6-磷酸浓度是几十μM(Horm.Metabol.Res.，14，233-236(1982))，可以有下述的推测。
简要地，如图4所表明，参照文献中报道的果糖-6-磷酸浓度，推测GFAT活性，GFAT1S稳定地在接近于Km值的浓度起作用，而GFAT1L几乎不被激活。
图4是GFAT1S和GFAT1L(GFAT激活状态)的酶反应曲线图。Y轴代表酶的反应速率(v)，X轴代表胞内果糖-6-磷酸浓度(μM)。浓度越高，流进细胞的葡萄糖量越多。在图4中，粗线代表文献中报道的非胰岛素依赖型糖尿病患者红细胞中果糖-6-磷酸浓度，粗箭头代表胰岛素耐药性的影响。
而且，需要注意下述事实。在胰岛素刺激时，细胞摄入葡萄糖增加。在这种情况下，对于GFAT1S，由于酶反应达到了Vmax，当葡萄糖进一步流入细胞时，GFAT活性达到饱和，不会有进一步的激活。相反，对于本发明的GFAT1L，随着流入细胞的葡萄糖量的增多，GFAT激活，代谢物的量也相应增加，由此抑制葡萄糖转运体通过细胞膜的转运，导致血糖增高(假定GFAT1L和GFAT1S的Vmax几乎相同)。
因此，和GFAT1S相比较，认为本发明的GFAT1L密切参与胰岛素耐药性。这样，可以确定本发明的GFAT1L在胰岛素耐药性机制中发挥重要的作用。工业应用
本发明提供的GFAT1L基因编码一个新的和人GFAT同源的人蛋白。
本发明的基因在骨骼肌和心脏中高表达，这些组织对于糖代谢非常重要。该基因被认为可以增强这些组织和外周组织的GFAT活性，或者糖酵解系统中的氨基己糖生物合成途径的活性。此外，该基因推测能够防止葡萄糖转运体转移到细胞膜上。因此，由于该基因可以有效作用于糖代谢中的血葡萄糖水平调节，分析该基因的表达水平或GFAT活性可以用于研究与该基因相关的基因的功能和糖代谢相关疾病的关系。尤其该基因可以用于诊断具有低血糖症或者糖尿病的患者，用于如下抗体的药学应用研究，这些抗体针对基因的表达产物或者表达产物的反义DNA。
采用本发明的基因，可以研究该基因在不同组织中的表达，也可以分析该基因在活的生物体内的功能。
采用该基因，可以使用基因工程技术大量生产此基因编码的GFAT1L蛋白。提供该蛋白使研究GFAT1L活性和GFAT1L蛋白结合活性成为可能。
本发明的蛋白可以用于阐明、诊断和治疗与GFAT1L基因和其表达产物相关的疾病(例如，与GFAT活性或者糖酵解系统中氨基己糖生物合成途径调节相关的疾病；与低血糖和血葡萄糖水平调节相关的疾病；低血糖；糖尿病；糖尿病并发症如糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病和糖尿病性神经病变)。
本发明也提供一种基因导入载体，它含有本发明基因的反义寡核苷酸，该载体可以于基因治疗；还提供基因治疗剂，其包括作为活性成分的，导入GFAT1L基因的反义寡核苷酸的细胞和载体或细胞；还提供采用该治疗剂进行基因治疗的方法。
本发明也提供药物，其含有作为活性成分的本发明基因的反义寡核苷酸，可以结合GFAT1L的抗体或者该抗体的片段，这些药物可预防骨骼肌，尤其是骨骼肌的平滑肌细胞中GFAT mRNA的表达，这样可以用于治疗疾病和疾病状态，如糖尿病和糖尿病并发症。
本发明也提供方法和试剂盒，用于筛选可以抑制GFAT1L蛋白和GFAT1L基因表达产物的酶活性的候选化合物，以用于治疗糖尿病。
序列表<110>Otsuka Pharmaceutical Co.Ltd.<120>新酶基因及其表达产物<130>OP0036<150>JP P2000-176631<151>2000-06-13<150>JP P2000-290679<151>2000-09-25<160>7<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>699<212>PRT<213>人骨骼肌mRNA<400>1Met Cys Gly Ile Phe Ala Tyr Leu Asn Tyr His Val Pro Arg Thr Arg 1 5 10 15Arg Glu Ile Leu Glu Thr Leu Ile Lys Gly Leu Gln Arg Leu Glu Tyr
20 25 30Arg Gly Tyr Asp Ser Ala Gly Val Gly Phe Asp Gly Gly Asn Asp Lys
35 40 45Asp Trp Glu Ala Asn Ala Cys Lys Ile Gln Leu Ile Lys Lys Lys Gly
50 55 60Lys Val Lys Ala Leu Asp Glu Glu Val His Lys Gln Gln Asp Met Asp 65 70 75 80Leu Asp Ile Glu Phe Asp Val His Leu Gly Ile Ala His Thr Arg Trp
85 90 95Ala Thr His Gly Glu Pro Ser Pro Val Asn Ser His Pro Gln Arg Ser
100 105 110Asp Lys Asn Asn Glu Phe Ile Val Ile His Asn Gly Ile Ile Thr Asn
115 120 125Tyr Lys Asp Leu Lys Lys Phe Leu Glu Ser Lys Gly Tyr Asp Phe Glu
130 135 140Ser Glu Thr Asp Thr Glu Thr Ile Ala Lys Leu Val Lys Tyr Met Tyr145 150 155 160Asp Asn Arg Glu Ser Gln Asp Thr Ser Phe Thr Thr Leu Val Glu Arg
165 170 175Val Ile Gln Gln Leu Glu Gly Ala Phe Ala Leu Val Phe Lys Ser Val
180 185 190His Phe Pro Gly Gln Ala Val Gly Thr Arg Arg Gly Ser Pro Leu Leu
195 200 205Ile Gly Val Arg Ser Glu His Lys Leu Ser Thr Asp His Ile Pro Ile
210 215 220Leu Tyr Arg Thr Ala Arg Thr Gln Ile Gly Ser Lys Phe Thr Arg Trp225 230 235 240Gly Ser Gln Gly Glu Arg Gly Lys Asp Lys Lys Gly Ser Cys Asn Leu
245 250 255Ser Arg Val Asp Ser Thr Thr Cys Leu Phe Pro Val Glu Glu Lys Ala
260 265 270Val Glu Tyr Tyr Phe Ala Ser Asp Ala Ser Ala Val Ile Glu His Thr
275 280 285Asn Arg Val Ile Phe Leu Glu Asp Asp Asp Val Ala Ala Val Val Asp
290 295 300Gly Arg Leu Ser Ile His Arg Ile Lys Arg Thr Ala Gly Asp His Pro305 310 315 320Gly Arg Ala Val Gln Thr Leu Gln Met Glu Leu Gln Gln Ile Met Lys
325 330 335Gly Asn Phe Ser Ser Phe Met Gln Lys Glu Ile Phe Glu Gln Pro Glu
340 345 350Ser Val Val Asn Thr Met Arg Gly Arg Val Asn Phe Asp Asp Tyr Thr
355 360 365Val Asn Leu Gly Gly Leu Lys Asp His Ile Lys Glu Ile Gln Arg Cys
370 375 380Arg Arg Leu Ile Leu Ile Ala Cys Gly Thr Ser Tyr His Ala Gly Val385 390 395 400Ala Thr Arg Gln Val Leu Glu Glu Leu Thr Glu Leu Pro Val Met Val
405 410 415Glu Leu Ala Ser Asp Phe Leu Asp Arg Asn Thr Pro Val Phe Arg Asp
420 425 430Asp Val Cys Phe Phe Leu Ser Gln Ser Gly Glu Thr Ala Asp Thr Leu
435 440 445Met Gly Leu Arg Tyr Cys Lys Glu Arg Gly Ala Leu Thr Val Gly Ile
450 455 460Thr Asn Thr Val Gly Ser Ser Ile Ser Arg Glu Thr Asp Cys Gly Val465 470 475 480His Ile Asn Ala Gly Pro Glu Ile Gly Val Ala Ser Thr Lys Ala Tyr
485 490 495Thr Ser Gln Phe Val Ser Leu Val Met Phe Ala Leu Met Met Cys Asp
500 505 510Asp Arg Ile Ser Met Gln Glu Arg Arg Lys Glu Ile Met Leu Gly Leu
515 520 525Lys Arg Leu Pro Asp Leu Ile Lys Glu Val Leu Ser Met Asp Asp Glu
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610 615 620Gln Gln Val Val Ala Arg Gln Gly Arg Pro Val Val Ile Cys Asp Lys625 630 635 640Glu Asp Thr Glu Thr Ile Lys Ash Thr Lys Arg Thr Ile Lys Val Pro
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690 695<210>2<211>2097<212>DNA<213>人骨骼肌mRNA<220><221>CDS<222>(1)..(2097)<400>2atg tgt ggt ata ttt gct tac tta aac tac cat gtt cct cga acg aga 48Met Cys Gly Ile Phe Ala Tyr Leu Asn Tyr His Val Pro Arg Thr Arg 1 5 10 15cga gaa atc ctg gag acc cta atc aaa ggc ctt cag aga ctg gag tac 96Arg Glu Ile Leu Glu Thr Leu Ile Lys Gly Leu Gln Arg Leu Glu Tyr
20 25 30aga gga tat gat tct gct ggt gtg gga ttt gat gga ggc aat gat aaa 144Arg Gly Tyr Asp Ser Ala Gly Val Gly Phe Asp Gly Gly Asn Asp Lys
35 40 45gat tgg gaa gcc aat gcc tgc aaa atc cag ctt att aag aag aaa gga 192Asp Trp Glu Ala Asn Ala Cys Lys Ile Gln Leu Ile Lys Lys Lys Gly
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115 120 125tac aaa gac ttg aaa aag ttt ttg gaa agc aaa ggc tat gac ttc gaa 432Tyr Lys Asp Leu Lys Lys Phe Leu Glu Ser Lys Gly Tyr Asp Phe Glu
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165 170 175gtt atc caa caa ttg gaa ggt gct ttt gca ctt gtg ttt aaa agt gtt 576Val Ile Gln Gln Leu Glu Gly Ala Phe Ala Leu Val Phe Lys Ser Val
180 185 190cat ttt ccc ggg caa gca gtt ggc aca agg cga ggt agc cct ctg ttg 624His Phe Pro Gly Gln Ala Val Gly Thr Arg Arg Gly Ser Pro Leu Leu
195 200 205att ggt gta cgg agt gaa cat aaa ctt tct act gat cac att cct ata 672Ile Gly Val Arg Ser Glu His Lys Leu Ser Thr Asp His Ile Pro Ile
210 215 220ctc tac aga aca gct agg act cag att gga tca aaa ttc aca cgg tgg 720Leu Tyr Arg Thr Ala Arg Thr Gln Ile Gly Ser Lys Phe Thr Arg Trp225 230 235 240gga tca cag gga gaa aga ggc aaa gac aag aaa gga agc tgc aat ctc 768Gly Ser Gln Gly Glu Arg Gly Lys Asp Lys Lys Gly Ser Cys Asn Leu
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260 265 270gtg gag tat tac ttt gct tct gat gca agt gct gtc ata gaa cac acc 864Val Glu Tyr Tyr Phe Ala Ser Asp Ala Ser Ala Val Ile Glu His Thr
275 280 285aat cgc gtc atc ttt ctg gaa gat gat gat gtt gca gca gta gtg gat 912Asn Arg Val Ile Phe Leu Glu Asp Asp Asp Val Ala Ala Val Val Asp
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370 375 380cgg cgt ttg att ctt att gct tgt gga aca agt tac cat gct ggt gta 1200Arg Arg Leu Ile Leu Ile Ala Cys Gly Thr Ser Tyr His Ala Gly Val385 390 395 400gca aca cgt caa gtt ctt gag gag ctg act gag ttg cct gtg atg gtg 1248Ala Thr Arg Gln Val Leu Glu Glu Leu Thr Glu Leu Pro Val Met Val
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权利要求
1.包含下列(a)、(b)、(c)或(d)的多核苷酸的基因
(a)编码由SEQ ID NO1所示氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸，或者该多核苷酸的互补链；
(b)和编码由SEQ ID NO1所示氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸有至少98％同源性的多核苷酸，或者该多核苷酸的互补链；
(c)编码多肽的多核苷酸或该多核苷酸的互补链，该多肽由根据(a)的氨基酸序列组成，其中一个或多个氨基酸被缺失、替代或增加，并且该多肽有GFAT的活性；或
(d)编码多肽的多核苷酸或者该多核苷酸的互补链，该多肽由与根据(a)的氨基酸序列有至少98％同源性的氨基酸序列组成。
2.包含下列(a)、或(b)的多核苷酸的基因
(a)由SEQ ID NO2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，或者该多核苷酸的互补链；或
(b)在高度严格的条件下，能和由依照(a)的核苷酸序列所组成的多核苷酸杂交的多核苷酸。
3.根据权利要求2的基因，包含SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
4.基因表达产物，通过权利要求1或2所述基因的表达而产生。
5.重组表达载体，包含权利要求1或2所述基因。
6.宿主细胞，含有权利要求5所述的重组表达载体。
7.由权利要求5所述的重组表达载体转化的转化体。
8.由下述(a)、(b)或(c)表示的GFAT1L蛋白
(a)由SEQ ID NO1所示氨基酸序列组成的蛋白；
(b)由依据(a)的氨基酸序列组成的蛋白质，其中一个或多个氨基酸被缺失、替代、或增加，并且该多肽有GFAT的活性；或
(c)由和依据(a)的氨基酸序列有至少98％同源性的氨基酸序列组成的蛋白质。
9.用于治疗或预防低血糖症的组合物，包含作为活性成分的权利要求1或2所述的基因，或者权利要求4所述的基因表达产物。
10.用于治疗或预防低血糖症的组合物，包含作为活性成分的权利要求8所述的蛋白。
11.抗体，能和从权利要求4所述的基因表达产物，权利要求8所述的蛋白以及该产物和蛋白的片段中选择的任一种结合。
12.筛选候选化合物的方法，该化合物能够抑制权利要求1所述基因、权利要求4所述的基因表达产物、或者权利要求8所述的蛋白的酶活性，此方法包括(1)以竞争的方式将权利要求11所述的抗体和含有候选化合物的待测液体，及被标记的权利要求8所述蛋白或该蛋白的部分肽进行反应；并测量和抗体结合的被标记的蛋白或部分肽的量；(2)把含有候选化合物的待测液体同时或先后和上述抗体及另一标记的抗体进行反应，抗体固定在载体上；测量载体上标记物的活性；或(3)测量当权利要求8所述的蛋白或该蛋白的部分肽和底物接触时该蛋白或部分肽的酶活性，以及当该蛋白或部分肽和底物及候选化合物接触时该蛋白或部分肽的酶活性，并比较各种情况的酶活性。
13.权利要求12所述筛选方法中使用的试剂盒，包括用于测量的缓冲液，权利要求8中所述的蛋白或该蛋白的部分肽及作为底物的果糖-6-磷酸和谷氨酰胺。
全文摘要
本发明提供含有能编码由SEQ ID NO1所示氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸的基因；通过表达该基因获得的基因表达产物；包含该基因的重组表达载体；含有该载体的宿主细胞(转化体)；用于治疗或预防低血糖症的组合物，它包括作为活性成分的，由SEQ ID NO1所示的氨基酸序列组成的蛋白，上述的基因或者蛋白；能够结合上述蛋白的抗体，等。使用该基因和它的表达产物，可能阐明糖尿病的病理和开发药物等，以在新的功能机制的基础上预防或治疗糖尿病。
文档编号A61K38/45GK1436239SQ0181111
公开日2003年8月13日 申请日期2001年6月12日 优先权日2000年6月13日
发明者藤原力, 冈本考史, 新美正史, 急式弘之, 山本惠史, 植山笃则 申请人:大塚制药株式会社