专利名称：一种鱼类生长抑素成熟肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种鱼类生长抑素成熟肽及其应用。
背景技术：
生长抑素(Somatostatin，缩写为SS)是一类抑制动物生长的多肽类激素，最早是 从羊的下丘脑提取液中分离得到。研究发现，这类多肽广泛存在于脊椎动物中，主要分布于 中枢及外周神经系统、肠、胃、胰腺和甲状腺等组织。生长抑素主要具有抑制机体生长激素 分泌的作用，也具有抑制胃、肠、胆、胰腺的内、外分泌和抑制胃肠运动等作用，是生物体内 重要的神经递质和神经调质。生长抑素家族由结构类似的一类SS多肽所组成，这些多肽在分子组成上也存在 某些差异，具有不同的氨基酸链长度和氨基酸组成。这种差异主要源于两个方面一是生物 体内存在某一较长的SS前体，加工的场所不同，形成的SS多肽的组成和结构不同；二是生 物体内存在多种SS基因，可编码出不同形式的(pr印rosomatostatin，缩写为PSS)。生长 抑素需经过信号肽酶和前激素转化酶等对前体蛋白进行组织特异性的加工而成活性肽。SS 存在两种生物活性类型，一种为具有14个氨基酸的SS14，另一种在其N端多带有14个氨基 酸的SS28。SS14在所有已知的脊椎动物代表种中高度保守，具有相同的氨基酸序列。目前鱼类生长抑素的研究结果表明，硬骨鱼类至少含有2种编码SS的基因，硬骨 鱼类体内至少含有2种SS前体，分别由不同的PSS mRNA编码。PSS都是较长的蛋白质多 肽，其C末端都含有某一特征性的肽段，这些PSS序列中包含一些特别位点，可自身断裂，包 含C末端的那段多肽就是一种SS形式，或经进一步剪切加工形成SS。因此，在硬骨鱼类体 内存在多种形式的SS多肽。鱼类的生长主要由生长激素GH调控，SS在垂体水平对GH进行调节。SS14对垂体 GH释放的体内体外抑制作用已在许多硬骨鱼类中得到证明。金鱼3种类型的SS均能抑制 金鱼垂体GH体外释放，金鱼脑SS28对GH释放的抑制作用更强些。SS14抑制虹鳟或罗非鱼 GH的释放，但不抑制GH基因的转录，表明SS通过翻译后调节作用影响GH蛋白的合成和分 泌。SS能抑制斜带石斑鱼脑垂体GH的释放，并呈剂量依存关系，同时斜带石斑鱼与虹鳟、罗 非鱼一样，SS同样也不抑制GH的转录。因此，采用生物工程的方法制备高活力的生长抑素 抗体作为饵料添加剂，可以有效地促进动物个体的生长，而目前在鱼类中尚未有相关的报 道。
发明内容
本发明的目的在于根据现有的生长抑素基因具有不同生物学功能的特点，提供鱼 类中第一例生长抑素成熟肽。本发明另一目的在于提供上述鱼类生长抑素成熟肽的应用。本发明上述目的通过以下技术方案予以实现通过分析鱼类基因组和EST数据库，我们在多种鱼类中发现编码生长抑素的基因
3序列。用这些序列构建进化树，如图1所示，SS共聚为五大分枝，每个分枝都包括已知的直 系同源基因，表明进化树分析可用于识别SS直系同源基因。根据这些序列设计简并引物 (其核苷酸序列如SEQ ID NO 6 15所示)，结合RACE技术，我们在鱼类中分离得到五种 生长抑素基因，其蛋白质前体经断裂得到的成熟肽为SS1、SS2、SS3、SS4和SS5，其氨基酸序 列分别如 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 5 所示。SS蛋白前体序列比对显示，在五种硬骨鱼类中，由SSl和SS2的蛋白前体产生的 SS完全保守，由SS3和SS5的蛋白前体产生的SS存在2-3个氨基酸的变异，而由SS4蛋白 前体产生的SS变异较大。采用RT-PCR检测五种SS基因在斑马鱼的组织中组织表达情况如图3所示，它们 呈现出不同的表达模式SS1，SS2和SS3主要在脑中表达，如端脑、下丘脑和视顶盖等区域； SS4主要在外周组织表达；SS5主要在卵巢，视顶盖和后脑中表达。本发明鱼类生长抑素成熟肽可用于鱼类生长发育中，例如，根据本发明成熟肽制 备疫苗，该疫苗作用于鱼类时，可以抑制鱼类的生长抑素的产生，从而促进鱼类的生长发 育。本发明鱼类生长抑素成熟肽可用于制备鱼类人工饲料。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果本发明鱼类生长抑素成熟肽具有抑制生长激素释放的功能，在鱼类生长发育中有 着重要的作用，可以通过化学合成的方法进行利用或开发，使用方便，效果显著。
图1是本发明的五种鱼类生长抑素蛋白前体进化树分析，进化树用MEGA3. 0软件 邻接法(neighbor-oining method)构建,进行 1000 次自举重复(bootstrap replicates) 检验；图2是本发明鱼类SS1(A)、SS2(B)、SS3(C)、SS4(D)和SS5 (E)蛋白前体氨基酸序 列比对。序列比对用Clastal W进行。信号肽用虚线显示；成熟肽用阴影显示；蛋白酶切割 位点用实线显示；图3是本发明的五种鱼类RF神经肽基因在斑马鱼各个组织的表达分析，以管家基 因18s为内参。0 卵巢；I 肠；S 脾脏；L 肝脏；H 心脏；G 鳃；Hy 下丘脑；HB 后脑；OTT 视顶盖-丘脑；TE 端脑。
具体实施例方式以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。实施例11.斑马鱼脑总RNA的提取取健康斑马鱼，解剖后立即分离出脑组织。采用Trizol试剂法提取获得斑马鱼脑 总RNA，其0D26(1/28(1 = 1.85,电泳结果显示，28S rRNA, 18S rRNA条带清晰，28S条带亮度为 18S的两倍，表明所得总RNA未被蛋白质、酚和基因组DNA污染，纯度高。2. cDNA第一链的合成
4
取5 μ g斑马鱼脑总RNA样品进行DNA酶处理以去除基因组DNA的污染，与RNA Oligo dT(序列如SEQ ID N0:16所示)混合，进行反转录，所的产物置于_20°C保存备用。3.斑马鱼SS基因cDNA全序列的克隆通过分析鱼类基因组和EST数据库，我们根据在斑马鱼(zebrafish，Danio rerio)、中发现编码SS蛋白前体序列。根据这些序列设计引物(其核苷酸序列如SEQ ID NO 6 15所示)，进行PCR扩增。所得PCR产物上样至1. 8wt%琼脂糖凝胶，以低电压电泳 分离DNA片段，从凝胶中纯化回收目的产物。将纯化后的目的产物连接至pGEM-T Easy 载体，转化DH5a大肠杆菌，挑选阳性克隆测序。Blast同源分析表明，目的产物为SS基因 (其核苷酸序列如SEQ IDNO 17 21所示)。实施例2斑马鱼SS基因的序列比对分析通过序列比对分析，SS蛋白前体序列比对显示，由SSl和SS2蛋白前体产生的SS 完全保守，由SS3和SS5产生的SS存在2-3个氨基酸的变异，而由SS4蛋白前体产生的SS 变异较大(图2)。实施例5斑马鱼SS基因的组织表达采用RT-PCR检测五种SS基因在斑马鱼的组织中组织表达情况如图3所示，它们 呈现出不同的表达模式SS1，SS2和SS3主要在脑中表达，如端脑、下丘脑和视顶盖等区域； SS4主要在外周组织表达；SS5主要在卵巢，视顶盖和后脑中表达。
权利要求
一种鱼类生长抑素成熟肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4或SEQ ID NO5所示。
2.权利要求1所述鱼类生长抑素成熟肽在鱼类生长发育中的应用。
3.权利要求1所述鱼类生长抑素成熟肽在制备鱼类人工饲料中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种鱼类生长抑素成熟肽及其应用。本发明鱼类生长抑素成熟肽的氨基酸序列如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4或SEQ ID NO5所示。本发明鱼类生长抑素成熟肽具有抑制生长激素释放的功能，在鱼类生长发育中有着重要的作用，可以通过化学合成的方法进行利用或开发，使用方便，效果显著。
文档编号A61P43/00GK101948527SQ20101026589
公开日2011年1月19日 申请日期2010年8月27日 优先权日2010年8月27日
发明者刘云, 刘晓春, 卢丹琪, 张勇, 张海发, 李水生, 林浩然, 蒙子宁, 陈华谱 申请人:中山大学