专利名称：人生长抑素受体2亚型和大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶共表达载体及建立和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域的分子克隆和基因治疗，具体涉及构建人生长抑素受体2亚型与大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶共表达载体及其建立和应用，利用“自杀”基因结合放射性显像和内照射等多重作用杀伤肿瘤细胞。
背景技术：
肿瘤是当今社会威胁人类健康的最严重的疾病之一，临床上常规多通过手术、放疗、化疗等方法进行治疗，但在大多数情况下，这些治疗方法不能从根本上治愈病痛，而且毒副作用大，因此疗效不尽如人意。基因治疗的出现给人们带来了新的希望，所谓基因治疗，就是将某种核酸物质(基因表达载体或其他)转移到患者体内，实现特定基因的表达，或封闭特定基因的功能，以达到治疗疾病目的的一种技术。它在治疗肿瘤、病毒性疾病(如乙肝、HIV感染等)和一些遗传、代谢类疾病等的尝试中都取得了令人鼓舞的成效，显示出良好的应用前景。
截至2003年12月，世界各国共批准基因治疗临床方案636项，涉及病人3496人，其中60％以上是针对肿瘤的。目前用于肿瘤基因治疗的基因包括细胞因子基因，肿瘤抑制基因，“自杀”基因，以及外源毒素基因等。其中，包括胞嘧啶脱氨酶(CD)基因在内的“自杀”基因是少数在临床上被证实具有确凿疗效的基因。美国食品与药品管理局(FDA)批准了多项关于“自杀”基因的临床治疗方案，但是单一“自杀”基因治疗的效果尚不令人满意。
生长抑素受体(Somatostatin Receptor，SSTR)是一种G蛋白偶联的膜受体，分布在下丘脑、脑垂体，以及胃肠道、胰腺、胆囊、肾上腺、及甲状腺等部位。SSTR在大多数生长抑素起源的肿瘤中都有高密度的表达，如垂体腺瘤、胰岛细胞瘤、类癌瘤、嗜铬细胞瘤及小细胞肺癌等，另外在乳腺、肾、结肠的腺癌，以及脑膜瘤、高分化星形细胞瘤及淋巴瘤中已有一定的表达。
SSTR存在五种不同的分子亚型SSTR1，SSTR2，SSTR3，SSTR4，SSTR5。20世纪90年代初五种亚型的SSTR分子被相继克隆出来。在同一种类的肿瘤中还存在SSTR亚型表达的差异。如在肺癌中小细胞肺癌中以SSTR2为主，而肺腺癌、肺鳞癌这两种非小细胞肺癌中以SSTR1为主。
生长抑素受体能够与生长抑素(Somatostatin)及其类似物(Somatostatinanalog，SSA)发生高特异性、高亲和力的结合，通过膜内信号传递机制产生生物活性，生长抑素的生物学活性不仅仅止于它对内外分泌腺的抑制作用，经研究还发现它可以通过多种途径作用于肿瘤，抑制肿瘤生长1.直接抗增殖作用 通过与肿瘤部位的生长抑素受体结合上调腺苷酸环化酶、磷酸蛋白激酶的活性，降低Ca2+浓度，以及抑制磷脂酰肌醇-3-激酶途径抑制促肿瘤细胞增殖的细胞因子和分子信号，并促进肿瘤细胞发生凋亡。
2.间接抗增殖作用 通过抑制促肿瘤生长的激素和生长因子如生长激素(GH)、表皮生长因子(EGF)等以及抑制血管内皮生长因子(VEGF)的促血管形成作用，抑制肿瘤的生长、修复、浸润、和血行性转移。
自上世纪80年代以来，人们开始进行SSTR肿瘤显像以及放射性靶向性治疗研究，即应用放射性核素标记SST或SSA，识别和结合SSTR阳性的肿瘤细胞，进行肿瘤的显像诊断和放射性靶向治疗，并可作为报告基因跟踪目的基因的表达，这些研究均取得了理想的结果。1994年，FDA通过临床应用111In-Octeotide进行全身显像，目前又通过了99mTc标记配基可用于肺癌显像。在SSTR家族成员中，SSTR2由于与多种配基结合时具有较高的亲和力和特异性，因此应用最为广泛。但是其应用范围限于SSTR2阳性的肿瘤细胞，并不是在所有人类肿瘤中都表达SSTR2基因，这样，SSA对SSTR2基因阴性的肿瘤不能起到抑肿瘤作用和靶向性放疗作用。
胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase，CD)是一种转换药物前体的“自杀”基因，其表达产物可以将无毒性的药物前体5-FC(5-fluorocytosine，5-氟胞嘧啶)，转变为细胞毒性化疗药物5-FU(5-fluorouracil，5-氟尿嘧啶)。其优势是人体可以耐受大剂量的5-FC而不产生明显的毒副作用，在肿瘤局部产生高浓度的杀伤作用，同时引发较强的“旁观者效应”-CD基因阴性靶细胞由于邻近细胞带有药物转变基因也被杀伤。但是单一的基因治疗目前看来难以起到满意的临床治疗效果，而且在实验中难于定位治疗转基因、难于监控疗效等问题，都限制了研究的进展。我们需要一种能够良好监控目的基因转移、表达的方法。
发明内容
本发明通过建立“自杀”基因-胞嘧啶脱氨酶(CD)与报告基因-人生长抑素受体(SSTR)2的共表达载体，利用“自杀”基因/前体药物系统，并协同SSTR2靶向的放射性显像和内照射杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤生长。
人生长抑素受体2亚型与大肠肝菌胞嘧啶脱氨酶共表达载体，其具有序列表<400>1的序列。
上述载体构建方法按以下步骤进行
(1)RT-PCR克隆人SSTR2基因培养含人SSTR2基因的细胞，待细胞生长至足够数量时，提取细胞总RNA，反转录成cDNA第一链，以str5和str3为引物，PCR扩增人SSTR2 cDNA，PCR产物经电泳回收后，用EcoR I和NotI酶切，克隆入pcDNA3载体的相应位点，得到pcDNA3-SSTR2，并进行序列测定。RT-PCR所用引物如下str55’-ttt gaattc atg gac atg gcg gat gag cca ctc aat gga-3’；str35’-ttt gcg gcc gctcag ata ctg gtt tgg agg tct cca t-3’。
(2)基因拼接与载体构建以pIRES2-EGFP载体为模板，用引物ir5和si3进行PCR，获得3’端带有SSTR2部分序列的IRES核苷酸序列，同时以pcDNA3-SSTR2为模板，用引物ist5和str3进行PCR，获得5’端带有IRES部分序列的SSTR2核苷酸序列；上述两次PCR产物混合作为模板，以ir5和str3为引物进行PCR，获得IRES-SSTR2序列串联体，并经测序证实；该串联体用BamHI/NotI酶切后，克隆入同酶切割的pIRES2-EGFP-CD，以取代其中的IRES-EGFP序列，得到pIRES-SSTR2；进一步以EcoRI和SmaI酶切pAd-CD载体，得到CD基因，并克隆入pIRES-SSTR2相应位点，最终获得CD和SSTR2双顺反子表达载体pCD-IRES-SSTR2(pCIS)；相关引物序列如下ir55’-tca agc ttc gaa ttc tgc agt cga cgg tac-3’；si35’-cgc cat gtc cat ggt tgt ggc cat att atc atc-3’ist55’-atg gcc aca acc atg gac atg gcg gat gag cca-3’。
共表达载体在制备用于肿瘤治疗的药物中的应用。
本发明将“自杀”基因CD和报告基因SSTR2通过IRES连接，内部核糖体进入位点(IRES)可以将2个基因串联起来，在同一启动子作用下使2个基因转录产生一条双顺反子mRNA，后者在翻译时，核糖体分别识别5’端的翻译起始位点和位于2个基因编码序列之间的IRES，独立地翻译产生2种蛋白。通过上述方法构建了2个基因的共表达载体，进而建立了共表达上述基因的细胞系。本发明利用报告基因SSTR2可以良好监测“自杀”基因CD的表达，提供了一种非侵入性、可重复性、定量性显像方法，将有助于人类基因治疗试验以及分子、细胞治疗动物模型的研究；通过与SSTR2配基SSA标记核素的不同，实现显像或治疗的不同效果；SSA与SSTR2结合后的抑肿瘤作用、SSA标记治疗核素起到的靶向治疗作用、CD基因的杀伤作用，三者有机的结合起来，相互促进，起到单一治疗不可达到的效果。体外和动物实验证实了CD/5-FC“自杀”基因/前体药物系统协同SSTR2介导的放射性显像和杀伤对肿瘤生长的抑制作用，为“自杀”基因联合放射性免疫杀伤和显像治疗肿瘤提供一种新途径。
图1CD和SSTR2双顺反子表达载体构建流程2RT-PCR获得hSSTR2基因电泳照片；图3pCD-IRES2-SSTR2(pCIS)EcoRI/BamHI酶切鉴定；图4间接免疫荧光检测pCIS稳定转染的SKBr3细胞；图5 5-FC对pCIS稳定转染的人乳腺癌SKBr3(SKBr3-pCIS)细胞的杀伤作用；图6移植瘤长成的裸鼠动物模型；
图7、图8、图9荷瘤小鼠注射99mTc-Octreotide后显像结果。
具体实施例方式
人生长抑素受体2亚型(SSTR-2)与大肠肝菌胞嘧啶脱氨酶(CD)共表达载体，其具有序列表<400>1的序列。其构建方法按以下步骤进行(1)RT-PCR克隆人SSTR2基因培养含人SSTR2基因的细胞如人胚肾293(HEK293)细胞、小细胞肺癌细胞株NCI-H446，待细胞生长至约8×106时，弃去培养液，加入1ml TRIZOL，按照操作说明提取细胞总RNA，溶于DEPC处理的H2O中，应用SuperScriptTM试剂盒反转录成cDNA第一链，以str5和str3为引物，PCR扩增人SSTR2 cDNA，PCR产物电泳结果显示有预期大小(1110bp)DNA片段出现，见图2 RT-PCR获得hSSTR2基因电泳照片左侧条带.DL2000 DNA markers(2000，1000，750，500，250，100bp)；右侧条带.PCR产物，可见hSSTR2在1000条带偏上位置。产物经电泳回收后，克隆入pcDNA3载体的相应位点，得到pcDNA3-SSTR2，进行序列测定并与Genbank中的人SSTR2 mRNA比较，证实序列完全正确。
RT-PCR所用引物如下str55’-ttt gaa ttc atg gac atg gcg gat gag cca ctc aat gga-3’；str35’-ttt gcg gcc gct cag ata ctg gtt tgg agg tct cca t-3’。
(2)基因拼接与载体构建应用重叠延伸基因拼接(SOE)结合PCR的方法，获得了IRES-SSTR2编码序列串联体，具体为以pIRES2-EGFP载体为模板，用引物ir5和si3进行PCR，获得3’端带有SSTR2部分序列的IRES核苷酸序列，同时以pcDNA3-SSTR2为模板，用引物ist5和str3进行PCR，获得5’端带有IRES部分序列的SSTR2核苷酸序列。上述两次PCR产物混合作为模板，以ir5和str3为引物进行PCR，获得IRES-SSTR2序列串联体，并经测序证实。该串联体用BamHI/NotI酶切后，克隆入同酶切割的pIRES2-EGFP-CD，以取代其中的IRES-EGFP序列，得到pIRES-SSTR2。进一步以EcoRI和SmaI酶切pAd-CD载体，得到CD基因，并克隆入pIRES-SSTR2相应位点，最终获得CD和SSTR2双顺反子表达载体pCD-IRES-SSTR2(pCIS)，酶切鉴定结果见图3 pCD-IRES2-SSTR2(pCIS)EcoRI/BamHI酶切鉴定MDL 2000 DNA marker，0pIRES2-EGFP空载体，1、2pCD-IRES2-SSTR2，可见酶切产物条带位于1500左右的位置(CD大小1513bp)；测序结果见序列表<400>11-1513为CD序列；1514-2121为IRES序列；2122-3231为SSTR2序列。
ir55’-tca agc ttc gaa ttc tgc agt cga cgg tac-3’；si35’-cgc cat gtccat ggt tgt ggc cat att atc atc-3’ist55’-atg gcc aca acc atg gac atggcg gat gag cca-3’。
CD和SSTR2双顺反子表达载体构建过程参见图1CD和SSTR2双顺反子表达载体构建流程图。
CD和SSTR2共表达细胞系的建立转染前24h，将人乳腺癌SKBr3细胞接种于6孔培养板中，使细胞生长至底面积60％。对于每孔细胞，将8μl脂质体和4μg pCIS载体分别溶于250μl无血清RPMI 1640培养液，并混合成为转染液，静置20min后加入进行转染。
20h后换正常培养液培养48h，加入含400μg/mL G418培养液筛选，3周后获得稳定转染的细胞克隆，挑取10个单克隆，分别扩大培养和冻存。
肿瘤细胞体外杀伤实验(1)MTT(噻唑蓝)法测定5-FC对SKBr3-pCIS细胞克隆的杀伤作用pCIS稳定转染的SKBr3细胞克隆和未经转染的SKBr3细胞培养于96孔板中，分别于掺入200μg/ml 5-FC后的0h、36h和72h进行MTT检测，每孔加入20μl 1.5mg/ml的MTT，继续培养4h后吸去培养液，加入150μl DMSO溶解结晶，用酶联免疫检测仪测定各孔490nm光吸收值，并计算相同处理样品的平均值。结果如表1所示。
表1 SKBr3-pCIS克隆200μg/mL 5-FC作用不同时间MTT检测结果(OD490nm)；时间 Con1Con2CIS1CIS2CIS3CIS4CIS5CIS6CIS7CIS8CIS9CIS100h0.420.410.420.410.400.430.390.400.440.420.410.4236h 0.760.730.480.370.770.680.460.630.280.590.580.5572h 1.321.350.770.291.331.080.350.190.190.930.610.48表1 Con1、2为未经转染的SKBr3细胞；CIS1-10为pCIS稳定转染的SKBr3细胞克隆。表中可以看出CIS7、2的敏感度较高。
(2)间接免疫荧光检测SSTR2的表达选择对5-FC杀伤敏感的7号克隆，同时随机选取1号克隆和未经转染的SKBr3细胞进行对比研究。细胞培养于6孔板中的盖玻片上，弃去培养液，PBS(pH7.4)洗2次，4％多聚甲醛固定30min，用0.01％Triton和0.3％双氧水各处理30min，5％羊血清封闭30min后，依次与稀释的兔抗人SSTR2抗体和FITC标记的羊抗兔IgG孵育，PBS洗涤，滴一滴PBS在载玻片中央，取出盖玻片，细胞面朝下轻放于载玻片液滴上，荧光显微镜下观察。间接免疫荧光结果见图4间接免疫荧光检测pCIS稳定转染的SKBr3细胞SSTR2在建系的SKBr3-pCIS 7号细胞克隆(左图)中有较高水平的表达，5号克隆(中图)表达量较低，而未经转染的SKBr3细胞(右图)检测不到SSTR2表达。
(3)5-FC对建系细胞的杀伤作用研究培养(2)中证实共表达CD和SSTR2的SKBr3细胞(SKBr3-pCIS克隆7)，分别加入10，50，150，500和1000μg/mL 5-FC，于作用后不同时间进行细胞计数，并按照下式计算细胞死亡率细胞死亡率(％)＝(SKBr3细胞数-SKBr3-pCIS细胞数)/SKBr3细胞数×100％结果显示见图5 5-FC对pCIS稳定转染的入乳腺癌SKBr3(SKBr3-pCIS)细胞的杀伤作用在10-1000μg/mL药物浓度范围内，细胞均被有效杀伤，随着药物浓度的增加和作用时间延长，杀伤率逐步增高，但在5-FC浓度在150μg/mL以上变化时，细胞杀伤率变化不大，因此可将150-200μg/mL作为研究和体内应用的参考药物浓度。
(4)hSSTR2/188Re-SSA与CD/5-FC系统的协同杀伤作用pCIS转染建系细胞中加入188Re-SSA+5-FC，由于SSA的抑肿瘤作用、188Re的放射性杀伤和CD将5-FC转化为5-Fu的化疗作用三重相结合，肿瘤细胞的死亡率大大提高。
动物实验
(1)显像实验已进行显像实验pCIS转染建系SKBr3细胞接种裸鼠皮下建立肿瘤动物模型，瘤体长至1×1×1cm时尾静脉注射99mTc-Octreotide进行肿瘤显像，见图6、图7、图8、图9。图7注射99mTc-Octreotide后12h，荷瘤小鼠肝脏、肠道显像，移植肿瘤显像(箭头所指)；图8注射后24h，荷瘤小鼠，肿瘤显像最为明显(箭头所指)；图9注射后17h、20h、24h、28h显像结果，可以看出24h肿瘤部位显像剂浓集程度最高，显像效果最好。
(2)治疗实验裸鼠双侧臀部皮下接种SKBr3细胞，建立移植瘤动物模型，瘤体内直接注射Ad-hSSTR2-CD，经尾静脉注射188Re-SSA+5-FC，由于上述的多重作用，肿瘤生长缓慢，部分瘤体出现缩小。
权利要求
1.人生长抑素受体2亚型与大肠肝菌胞嘧啶脱氨酶共表达载体，其具有序列表<400>1的序列。
2.如权利要求1所述的共表达载体构建方法按以下步骤进行(1)RT-PCR克隆人SSTR2基因培养含人SSTR2基因的细胞待细胞生长至足够数量时，提取细胞总RNA，反转录成cDNA第一链，以str5和str3为引物，PCR扩增人SSTR2 cDNA，PCR产物经电泳回收后，用EcoRI和NotI酶切，克隆入pcDNA3载体的相应位点，得到pcDNA3-SSTR2，并进行序列测定；上述的RT-PCR所用引物如下str55’-ttt gaa ttc atg gac atg gcg gat gag cca ctc aat gga-3’；str35’-ttt gcg gcc gct cag ata ctg gtt tgg agg tct cca t-3’；(2)基因拼接与载体构建以pIRES2-EGFP载体为模板，用引物ir5和si3进行PCR，获得3’端带有SSTR2部分序列的IRES核苷酸序列，同时以pcDNA3-SSTR2为模板，用引物ist5和str3进行PCR，获得5’端带有IRES部分序列的SSTR2核苷酸序列；上述两次PCR产物混合作为模板，以ir5和str3为引物进行PCR，获得IRES-SSTR2序列串联体，并经测序证实；该串联体用BamHI/NotI酶切后，克隆入同酶切割的pIRES2-EGFP-CD，以取代其中的IRES-EGFP序列，得到pIRES-SSTR2；进一步以EcoRI和SmaI酶切pAd-CD载体，得到CD基因，并克隆入pIRES-SSTR2相应位点，最终获得CD和SSTR2双顺反子表达载体pCD-IRES-SSTR2(pCIS)；相关引物序列如下ir55’-tca agc ttc gaa ttc tgc agt cga cgg tac-3’；si35’-cgc cat gtc cat ggt tgt ggc cat att atc atc-3’ist55’-atg gcc aca acc atg gac atg gcg gat gag cca-3’。
3.如权利要求1所述的共表达载体在制备用于肿瘤治疗的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及人生长抑素受体2亚型与大肠肝菌胞嘧啶脱氨酶共表达载体及其建立与应用。利用内部核糖体进入位点(IRES)串联SSTR－2与CD，使两者同步表达，建立新的报告基因系统；利用生长抑素受体介导的抑制肿瘤增殖作用、放射性杀伤和显像作用及CD的“自杀”效应，联合杀伤肿瘤。三者有机的结合起来，相互促进，起到单一治疗不可达到的效果，为“自杀”基因联合放射性免疫杀伤和显像治疗肿瘤提供一种新途径。
文档编号A61K48/00GK1563390SQ20041002596
公开日2005年1月12日 申请日期2004年3月18日 优先权日2004年3月18日
发明者汪静, 贾林涛, 王喆, 李国权 申请人:汪静