Vefr-2抑制剂用于治疗转移癌的用途的制作方法

专利名称：Vefr-2抑制剂用于治疗转移癌的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用可阻断VEGF-VEGFR通路介导生物学和病理学的新蛋白治疗转移 癌。本发明还涉及新蛋白的药物制剂、所述蛋白的衍生物、以及它们在转移癌治疗中的应用。
背景技术：
恶性肿瘤转移的形成是由体内远近不等的远端原发性肿瘤所引发的。恶性肿瘤 转移是癌症最严重的危害之一，而且目前针对恶性肿瘤转移形成尚没有令人满意的治疗方 案。由于患者会发生(succumb to)多发性肿瘤，癌症肿瘤转移是疾病治疗中多数疗法失败 的主因。转移发生的范围随着肿瘤的个体类型而变化。黑色素瘤、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、结 肠癌和前列腺癌属于特别易于转移的癌症类型。当转移发生时，可在体内许多部位形成继 发性肿瘤，肺、肝、脑和骨是最常见的部位。目前可利用的癌症治疗方法，例如手术治疗、放射线疗法(放疗)、化学疗法(化 疗)和其他免疫生物学方法，或者不能成功阻止转移，或者引起严重的不良副作用。对于许多临床诊断的实体瘤(其中肿瘤呈局限性生长)，手术切除被认为是最佳 治疗方法。然而，手术后和/或经过一段延迟期后，往往观察到原肿瘤已转移，以至于癌浸 润的继发部位蔓延全身，患者随后死于继发性肿瘤生长。在其他实施方案中，由于肿瘤的位 置(例如在脑中某些区域)，手术切除肿瘤是不可行的，放射线、化学疗法或其他免疫生物 学方法是仅有的替代手段。报道显示，在有可切除肿瘤的个体中，原发性肿瘤生长或局部复发通常不是死亡 原因。反而目前几乎40%患有可行手术的肿瘤的癌症患者在手术后最后患上(succumb to) 转移性疾病。转移在某些肿瘤中是不断发生的。然而，转移常常由手术本身诱发。在手术过程 中，恶性细胞可从肿瘤块中被移出并进入循环系统，从而增加转移的机会。虽然化学疗法在癌症治疗中广泛应用，但其是一种全身性的疗法，通常以防止细 胞增殖为基础。因此，化学疗法是非特异的治疗模式，会影响所有增殖的细胞，包括正常细 胞，从而引起不希望的且往往较严重的副作用，例如免疫抑制、全血细胞减少症(骨髓细胞 生长抑制，伴随贫血、血小板减少和白细胞减少)、腹泻、恶心或秃发(脱发)。通常，现有的全身性疗法经常对远端器官(肺、肝、骨髓或脑)中已存在的微转移 几乎无效，而且它们对于预防肿瘤播散至其他组织不是很有效。因此，人们需要有抑制肿瘤转移的方法。特别是，非常需要不引起严重副作用的抑制(微)转移的方法。

发明内容
本发明的一个方面提供通过单独施用或者与其他细胞毒剂或治疗剂联合施用本 发明的新型蛋白，来治疗患有转移癌或有转移癌发病风险的受试者的方法。所述癌症可 为例如以下癌症中的一种或多种乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、骨肉瘤、宫颈癌、前列腺癌、肺 癌、滑膜癌、黑色素瘤、皮肤癌、胰腺癌或其他尚待确定的、与非致癌细胞(non-oncogenic cell)相比VEGFR-2水平在生理学上提高、上调、突变或改变的癌症。本发明提供通过单独施用或者与其他细胞毒剂或治疗剂联合施用本发明的 新型蛋白，来治疗患有转移癌或具有转移癌发病风险的受试者的方法。特别地，优 选的细胞毒剂和治疗剂包括多西他赛(docetaxel)、紫杉醇(paclitaxel)、多柔比 星(doxorubicin)、表柔比星(印irubicin)、环磷酉先胺(cyclophosphamide) >曲妥珠单 抗(trastuzumab) (Herceptin )、卡培他滨(capecitabine)、他莫昔芬(tamoxifen)、 托瑞米芬(toremifene)、来曲唑(letrozole)、阿那曲唑(anastrozole)、氟维司群 (fulvestrant)、依西美坦(exemestane)、戈舍瑞林(goserelin)、奥沙禾丨」钼(oxaliplain)、 卡 白(carboplatin)、顺 白(cisplatin)、地塞米丰公(dexamethasone)、安月太(antide)、 贝伐单抗(bevacizumab) (bevacizumab )、5-氟尿嘧啶(5_f luorouracil)、亚叶酸钙 (leucovorin)、左方宠咪唑(levamisole)、伊立替康(irinotecan)、依托泊苷(etoposide)、 托泊替康(topotecan)、吉西他滨(gemcitabine)、长春I卷滨(vinorelbine)、雌莫 司汀(estramustine)、米托蒽醌(mitoxantrone)、阿巴瑞克(abarelix)、唑来膦 酸(zoledronate)、链佐星(str印tozocin)、利妥昔单抗(rituximab) (Rituxan )、 伊达比星(idarubicin)、白消安(busulfan)、苯丁 酸氮芥(chlorambucil)、氟达 拉滨(fludarabine)、伊马替尼(imatinib)、阿糖胞苷(cytarabine)、替伊莫单抗 (ibritumomab) (Zevalin )、托西莫单抗(tositumomab) (Bexxar )、干扰素 a_2b、美法仑 (melphalam)、硼替佐米(bortezomib) (Velcade )、六甲蜜胺(altretamine)、天冬酰胺酶 (asparaginase) > ^ # #M (gefitinib) (Iressa ) > /aIf M (erlonitib) (Tarceva ) > 抗-EGF受体抗体(CetUXimabTM、AbX-EGF)及埃博霉素。更优选地，所述治疗剂为钼剂(例 如卡钼、奥沙利钼、顺钼)、紫杉烷(例如紫杉醇、多西他赛)、吉西他滨或喜树碱。在一个实施方案中，提供了一种治疗医学状况(medical condition)的方法，包 括施用本发明的蛋白质。在另外一个实施方案中，施用的蛋白质是血管生成抑制剂。在另 一个实施方案中，还施用第二种试剂。所述第二种试剂可以是本说明书中公开的任一种细 胞毒剂或治疗剂，举例来说可选自下列治疗剂SutentTM(即苹果酸舒尼替尼(simitinib !11&1站6)，描述于美国专利6，573，293)，Tykreb (即拉帕替尼(lapatinib)，描述于美国 专利6，727，256)，Nexavar (即Bayer BAY 43-9006/索拉非尼，描述于美国专利申请 流水号 09/425，228 和 PCT/US00/00648)，AZD2171 (即 Recent in ，在 PCT 国际申请公开 号TO 00/47212中公开)，贝伐单抗(即bevacizumab ,描述于美国专利6，054，297)， VEGF Trap (例如在 Kim et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA99 11399-404 ；Holash et al. (2002)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 11393-8 中描述的，以 AVE0005 为例)，mTor 抑制 剂如雷帕霉素(rapamycin)及其衍生物(雷帕霉素羟基酯，包括CC1-779即temsirolimus，
4的制备和应用在美国专利5，362，718中公开)，作用于所述激酶的细胞质部分的激酶抑制 剂，吉西他滨(即Gemzar ，在美国专利4，808，614中公开)，替莫唑胺(temozolomide) ( BP Temodar ，其在癌症治疗中的应用在美国专利5，939，098中公开)，达沙替尼(dasatinib) (即Sprycel ，在美国专利6，596，746中公开)，西妥昔单抗(Erbitux ，例如在美国专利 6，217，866 中公开)，伊沙匹隆(ixabepilone) (Bristol-Myers Squibb，s BMS-247550)， 甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate)(即Gleevac ，在美国专利5，521，184中公开)，曲 妥珠单抗(Here印tin ，例如在美国专利5，677，171中公开)，以及紫杉烷类的成员如紫杉 醇(即Taxol ，在美国专利5，439，686中公开)和多西他赛(即Taxotere ，在美国专利 4，814，470中公开)。在一个实施方案中，本发明的蛋白质每两周施用一次。在一个实施方 案中，所述治疗医学状况的方法包括向受试者施以治疗有效量的本发明的蛋白质。在另一 个实施方案中，所述治疗方法进一步包括向受试者施以治疗有效量的第二种治疗剂。在一 个方面，接受治疗的受试者为人类。此外，可能优选使本发明的蛋白质与第二种治疗蛋白质联合作为单个分子，或者 可能与第三种治疗蛋白联合作为单个分子。这样一种治疗实体包括本发明针对VEGFR-2的 蛋白质，其通过PEG或其他聚合物(例如Cys-Cys 二硫化物或多肽)与一种或多种治疗蛋白 连接。所述治疗蛋白包括抗体衍生物(例如Fabs、骆驼抗体及其衍生物、结构域抗体(例如 大小小于约50kD)和单链(优选大小小于约50kD))，基于纤连蛋白的支架如Adnectins ， 以及优选在约5kd至约40kd范围内的蛋白质。本发明蛋白质的靶标包括下列蛋白，尤其是它们的人类版本，但某些情况下包括 模型物种例如小鼠、大鼠、猴和狗的版本FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、c_Kit、人pl85受 体样酪氨酸激酶、HER2/Her2、Her3、c_Met、叶酸盐受体、PDGFR、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、 人血管内皮生长因子(VEGF)A、VEGF C、VEGF D、人CD20、人CD18、人CDlla、人细胞凋亡受 体-2(Apo-2)、人0 40 7整联蛋白、人6 1113-111￡1整联蛋白、干细胞因子(SCF)、人表皮生 长因子受体(EGFR)以及人CD3。此外，本发明的方面包括多功能蛋白，其结合第一种靶标和 至少另一种的靶标。优选地，所述蛋白通过本说明书中描述的PEG相关发明被连接，但在许 多实施方案中，所述蛋白可通过多肽或者其他多聚体接头或非多聚体接头连接。本发明的稳定连接的蛋白可用于癌症的治疗性处理。当本发明的多特异性蛋白指 向2个、3个、4个或更多个治疗靶标或表位时，具有调节、阻断或抑制多于一种治疗靶标的 优势。我们预期，利用治疗剂的相应生物学，可以把任何类型的肿瘤和任何类型的肿瘤 抗原作为靶标。癌症可能是以下一种或多种，例如乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、骨肉瘤、宫颈癌、 前列腺癌、肺癌、滑膜癌、胰腺癌、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤和横纹肌肉瘤，或 者其他尚待确定的、与不形成肿瘤的细胞相比VEGFR-2水平在生理学上提高、上调、突变或 改变的癌症。其他可能作为靶标的例示性肿瘤类型包括急性淋巴细胞性白血病、急性髓性白血 病、胆管癌、乳腺癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、结直肠癌、子宫内膜 癌、食道癌、胃癌、头颈癌、何杰金氏淋巴瘤、肺癌、甲状腺髓样癌、非何杰金氏淋巴瘤、多发 性骨髓瘤、肾癌、卵巢癌、胰腺癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、肝癌、前列腺癌以及膀胱癌。在某些实施方案中，提供了治疗、预防或降低转移癌播散的方法，所述方法包括向有需要的患者施以治疗性VEGFR-2特异性抑制剂。在某些实施方案中，患者罹患乳腺癌。在 某些实施方案中，所述VEGFR-2特异性抑制剂包括与人VEGFR-2结合的第一种多肽，所述多 肽包含具有如下结构组织的约80个至约150个氨基酸，所述结构组织包括分布在至少两 个日-折叠片中的至少5-7个0链或类0链，以及至少一个连接两条链(它们是0链或 类3链)的环部分，所述环部分参与结合VEGFR-2，其中所述多肽以小于1X10_6M的解离 常数(Kd)结合人VEGFR-2蛋白的胞外区，抑制VEGFR-2介导的血管发生。在某些实施方案 中，所述多肽包含与SEQ NO :1具有至少80%同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所 述多肽包含选自SEQ IDNOs 2-60中的任一氨基酸序列。在某些实施方案中，所述多肽进一 步包含聚氧化烯部分。在某些实施方案中，所述聚氧化烯部分为聚乙二醇(PEG)部分。在某些实施方案中，治疗方法包括施用VEGFR-2特异性抑制剂和第二种化疗剂。 在某些实施方案中，所述第二种试剂选自下组苹果酸舒尼替尼、拉帕替尼(lapatinib)、 索拉非尼、AZD2171、贝伐单抗、阿柏西普(afliberc印t)、mTor抑制剂、雷帕霉素、吉西他 滨、替莫唑胺、达沙替尼(dastinib)、西妥昔单抗、temsirolimus、伊沙匹隆、甲磺酸伊马替 尼、曲妥珠单抗、紫杉烷、奥沙利钼、5-氟尿嘧啶。在某些实施方案中，所述VEGFR-2特异性 抑制剂进一步包括第二种多肽，所述多肽包括与SEQ NO 1具有至少80%同一性的氨基酸 序列。所述方法中应用的VEGFR-2特异性抑制剂包括小分子、聚合物、糖类和其他大分 子、多肽(包括抗体)或核酸(包括反义核酸、核酶和小干扰RNA或siRNA)。VEGFR-2特异 性抑制剂涵盖任何可调节、影响、改变、抑制或降低VEGFR-2活性的组合物，所述VEGFR-2活 性包括靶结合、酶活性或酪氨酸激酶的酪氨酸磷酸化作用，优选降低至少5%、10 %、20 %、 30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,95%,97%,98%,99%^； 100%。在例示性的实施 方案中，VEGFR-2特异性抑制剂是蛋白质。人们往往希望所述VEGFR-2特异性抑制剂与VEGFR-1和VEGFR-3相比对于 VEGFR-2具有选择性，特别是在体内应用中是如此。所述选择性优选为至少约100倍、至少 约1000倍、至少约10，000倍以及至少约100，000倍。此外，可能希望在治疗剂或蛋白质的 规定浓度或更低浓度下检测不到对VEGFR-1和VEGFR-3的结合，特别是对于有高VEGFR-2 亲和性的抑制剂是如此，这样的浓度为约100nM、约liiM或约10iiM。对于与VEGFR-2结 合优先于VEGFR-1和VEGFR-3的抑制剂，它们的选择性关系还可以通过比较Kd、IC50和 Ki’ s来表示，比较的结果可以因测定法不同通过测量或者计算得到，或者可以用相同生物 化学或生物学参数(例如Kd、IC5Q和Ki’ s)的比值来表示。所述比值优选包括VEGFR-1和 VEGFR-3结合的比值，或其他对VEGFR-2结合的测定值，或其他约100、约1，000、约10，000 或约100,000的测定值。在某些实施方案中，所述VEGFR-2特异性抑制剂包括在美国专利申请流水号 11/482，641和11/448，171，以及PCT国际申请公开号W0 05/056764中公开的VEGFR-2特 异性抑制剂，本文通过援引方式并入这些申请的全部内容。还可对序列进一步进行修饰，例 如在序列倒数第二个氨基酸处添加半胱氨酸。在一些实施方案中，可用于本发明方法中的VEGFR-2特异性抑制剂包括以约10nM 或更低的结合亲合力结合人VEGFR-2、且以约1 y M或更高的结合亲合力结合VEGFR-1和 VEGFR-3的第一种蛋白质；其中所述第一种蛋白质基本上是一单结构域，该结构域对于人VEGFR-2基本上单价结合，且基本上没有微生物污染，使其适合于体内施用。所述VEGFR-2 特异性抑制剂(VEGF-2specific inhibitors)可进一步包括第二种蛋白质，其通过肽键 与所述第一种蛋白质连接，其中所述第二种蛋白质以约lOnM或更低的结合亲合力结合人 VEGFR-2，且以约liiM或更高的结合亲合力结合VEGFR-1和VEGFR-3。VEGFR-2特异性抑 制剂可进一步包括第二种蛋白质，其通过至少一个肽键与所述第一种蛋白质连接(包括经 由另一个蛋白质结构域的连接)，其中所述第二种蛋白质以约300nM或更低的结合亲合力 结合人血清白蛋白。所述VEGFR-2特异性抑制剂(VEGF-2specific inhibitors)优选包 括以约100pM或更低的结合亲合力结合人VEGFR-2、且以约liiM或更高的结合亲合力结 合VEGFR-1和VEGFR-3的第一种蛋白质。所述VEGFR-2特异性抑制剂(VEGF-2specific inhibitors)更优选包括以约10pM或更低的结合亲合力结合人VEGFR-2、且以约liiM或更 高的结合亲合力结合VEGFR-1和VEGFR-3的第一种蛋白质。这样的第一种蛋白质优选为 基于纤连蛋白的支架(fibronectin-based scaffold)，例如Adnectin ，后者是与VEGFR-2 单价结合的单特异性蛋白质的例子，还可包括其他可操作地连接的蛋白。所述VEGFR-2特 异性抑制剂(VEGF-2specific inhibitors)可进一步包括第二种蛋白质，其通过PEG与 所述第一种蛋白质连接，其中所述第二种蛋白质以约lOnM或更低的结合亲合力结合人 VEGFR-2，且以约liiM或更高的结合亲合力结合VEGFR-1和VEGFR-3。优选的是，所述第一 和第二种蛋白质是基于纤连蛋白的支架，例如Adnectins ，后者是与VEGFR-2 二价结合的 单特异性蛋白质的例子。优选地，PEG为约5kD至约50kD。本发明方法的一个方面包括VEGFR-2特异性抑制剂 (VEGFjspecificinhibitors)，它们包括特异性结合人VEGFR-2的第一种蛋白质；其中所 述第一种蛋白质分子量为约4kD至约40kD，与人VEGF-A、VEGF-C或VEGF-D有小于约30 %的 氨基酸同一性，且基本上没有微生物污染，使其适合于体内施用。所述VEGFR-2特异性抑制 剂可进一步包括本说明书中所述的PK调节部分。所述VEGFR-2特异性抑制剂可以具有这样 的PK调节部分，其包括与所述第一种蛋白质共价连接的PEG部分。这样的连接不限于与Cys 或Lys氨基酸，但优选特别是基于纤连蛋白的支架，例如Adnectin ，作为结合VEGFR-2的蛋 白质。所述VEGFR-2特异性抑制剂可以具有这样的PK调节部分该调节部分包含第二种蛋 白质，该第二种蛋白质能结合能增加所述第一种蛋白质的半衰期的人蛋白质，并且与所述 第一种蛋白质可操作地连接。所述人蛋白质可以是人血清白蛋白。所述VEGFR-2特异性抑 制剂可适当地包含这样的PK调节部分，该调节部分包括能结合人血清白蛋白的第二种蛋 白质，所述第二种蛋白质与所述第一种蛋白质共价连接，所述第一种蛋白质对于人VEGFR-2 的解离常数为约InM或更低。所述VEGFR-2特异性抑制剂可包括所述第一种蛋白质，其对 于人VEGFR-2的解离常数约为10pM或更低。所述VEGFR-2特异性抑制剂优选在基于细胞 的测定(cellbased assay)中诱导依赖于VEGFR-2活性的细胞系的细胞凋亡。可以设计所 述VEGFR-2特异性抑制剂使它们具有如下性质所述组合物(saidcomposition ofmatter) 阻断一个或多个配体(如VEGF-A、VEGF-C或VEGF-D)与VEGFR-2结合。所述VEGFR-2特异 性抑制剂优选阻断VEGF-A、VEGF-C和/或VEGF-D与VEGFR-2的结合，且进一步包括共价搭 接于所述第一种蛋白质的、至少约10kD的PEG。PEG可用在本发明的许多方面，可按照本说明书中的记载使用不同的大小以实现 期望的治疗或其他体内作用，例如成像。优选较大的PEG以增加在体内、血液、非血液细胞
7外液或组织内的半衰期。对于体内细胞活性，优选范围在约10-60kD的PEG，也可以使用小 于约100kD，更优选小于约60kD的PEG，但大于约100kD的大小也可应用。用在本发明方法中的优选蛋白质包括基于纤连蛋白的支架，例如Adnectin 。第一 种或第二种蛋白质或者两者都可以是基于纤连蛋白的支架，例如Adnectin ，并且可用在本 说明书中所述的实施方案中。它们可包括本发明的单特异性、双特异性、三特异性和其他多 特异性形式。这包括本发明的包含PEG的方面以及本发明包含多肽接头或其他非基于PEG 的接头的方面。通常，Adnectins 是纤连蛋白的衍生物，特别是第十结构域。本发明的方法中还可以使用基于PEG的组合物，所述组合物包括以约lOOnM的结 合亲合力与结合人VEGFR-2的第一种蛋白质和可结合人蛋白质的第二种蛋白质连接的第 一 PEG ；其中所述PEG为约5kD至约100kD，所述组合物基本上没有PEG，且基本上没有微生 物污染，使其适合于体内施用。优选地，PEG通过Cys连接至所述第一种蛋白质，并通过Cys 连接至所述第二种蛋白质。或者，可能理想的是，PEG通过Cys连接至所述第一种蛋白质而 通过Lys连接至所述第二种蛋白质。可以利用异功能PEG来生成这些实施方案和本说明书 中所述的其他实施方案。基于PEG的组合物可包括可以约300nM或更低的结合亲合力结 合人血清白蛋白的第二种蛋白质。该基于PEG的组合物可包括所述第一种蛋白质，其以约 100pM或更低的结合亲合力结合人VEGFR-2，并且以约1 y M或更高的结合亲和力结合无关 受体，如人胰岛素受体、VEGFR-1和VEGFR-3。优选的是，所述第二种蛋白质以约InM或更低 的结合亲和力结合至少一种人酪氨酸受体，并且以约1 P M或更高的结合亲和力结合无关 受体，如人胰岛素受体。基于PEG的组合物可包括这样的本发明蛋白质，其结合以下蛋白配体的人源版本 中的至少一种Angl、Ang2、FGF (成纤维细胞生长因子)、EGF(表皮生长因子)、HGF (肝细 胞生长因子)、VEGF-A (血管内皮生长因子A)、VEGF-C和VEGF-D。这样的本发明蛋白质可 与本发明的其他蛋白质一起使用，来产生可用于本发明治疗方法的单特异性或多特异性蛋 白质。优选地，所述蛋白质通过PEG连接。基于PEG的组合物优选包括这样的分子，其中所述第一种蛋白质是基于纤连蛋白 的支架(如Adnectin )且所述第二种蛋白质是基于纤连蛋白的支架(如Adnectin )。或 者，基于PEG的组合物可以包括第一种或第二种蛋白质或者两者的单链抗体部分。用在本发明方法中的基于蛋白质的组合物包括结合人VEGFR-2的第一种蛋白质， 其与结合人蛋白质的第二种蛋白质可操作地连接；其中所述第一种蛋白质以约lOnM或更 低的结合亲和力结合人VEGFR-2并且以约1 y M或更高的结合亲和力结合人VEGFR-1和 VEGFR-3，且基本上没有微生物污染，使其适合于体内施用。优选地，所述第一种蛋白质和 所述第二种蛋白质总共具有1个或0个二硫键。这可能有利于提高基于细胞的系统中的 蛋白质产量。优选地，所述第一种蛋白质基本上是单个结构域，其基本上与VEGFR-2单价 结合。这对于提高基于细胞的系统中的蛋白质产量可能是需要的。优选地，所述第一种蛋 白质以约100pM或更低的结合亲和力结合人VEGFR-2，且有至少两个结构环参与所述第一 种蛋白质与人VEGFR-2的结合。优选地，所述第二种蛋白质是基于纤连蛋白的支架，例如 Adnectin ，其通过至少一个肽键与所述第一种蛋白质连接。在一些实施方案中，所述第一 种蛋白质和第二种蛋白质通过至少一个二硫键连接。这样的连接可以在细胞中实现，不过 在体外无细胞条件下进行可能是理想的。基于蛋白质的组合物可包括这样的第一种蛋白质，其以约300pM或更少的结合亲和力结合人VEGFR-2，且有至少两个结构环参与所述第一 种蛋白质与人VEGFR-2的结合。优选地，所述第一种蛋白质以约InM或更低的结合亲和力 结合人VEGFR-2，并且以约1 y M或更高的结合亲和力结合人VEGFR-1和VEGFR-3。优选地， 基于蛋白质的组合物进一步包括PEG部分，其与所述第一种蛋白质或者所述第二种蛋白质 可操作地连接。优选地，所述第二种蛋白质结合人类癌症中上调的人酪氨酸激酶受体，其中 所述第二种蛋白质以约lOnM或更低的结合亲和力结合人酪氨酸激酶受体，并且以约lyM 或更高的结合亲和力结合无关受体，如人胰岛素受体。本发明方法有用的蛋白质治疗剂包括结合人VEGFR-2的第一种蛋白质部分，其 与结合人治疗靶的第二种蛋白质部分可操作地连接；其中所述第一种蛋白质以约lOnM或 更低的结合亲和力结合人VEGFR-2，并且以约1 y M或更高的结合亲和力结合人VEGFR-1 和VEGFR-3，且基本上没有微生物污染，使其适合于体内施用；另外其中所述第二种蛋白 质以约lOnM或更低的结合亲和力结合人治疗靶，并且以约1 P M或更高的结合亲和力结 合无关受体，如人胰岛素受体，且基本上没有微生物污染使其适合于体内施用。所述蛋 白质治疗剂可包括第一种蛋白质部分和所述第二种蛋白质部分，它们总共具有至少6个 二硫键。优选地，所述第一种蛋白质和所述第二种蛋白质是由微生物表达的单一多肽(a single polypeptide) 0优选地，所述第一种蛋白质以约lOOpM或更低的结合亲和力结合 人VEGFR-2，且具有至少两个结构环参与所述第一种蛋白质与人VEGFR-2的结合。所述蛋 白质治疗剂包括这样的实施方案，其中所述第一种蛋白质部分和所述第二种蛋白质部分中 至少一者是抗体部分。优选地，所述抗体部分小于约50kD。所述蛋白质治疗剂包括这样的 实施方案，其中所述第一种蛋白质部分和所述第二种蛋白质部分中至少一者是单链抗体部 分。所述蛋白质治疗剂包括这样的实施方案，其中所述第二种蛋白质部分结合以下蛋白质 之一的人源版本受体EGFR、叶酸盐受体、Her2、Her3、c_kit、c_Met、FGFRI、FGFR2、PDGFR、 VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3和Tie2 ；以及配体Angl、Ang2、FGF (成纤维细胞生长因子)、 EGF (表皮生长因子)、HGF (肝细胞生长因子)、干细胞因子(SCF)、VEGF_A (血管内皮生长因 子A)、VEGF-C和VEGF-D。所述蛋白质治疗剂包括这样的实施方案，其中所述第一种蛋白质 部分和所述第二种蛋白质部分中至少一者是脂笼蛋白(lipocalin)的衍生物。所述蛋白质 治疗剂包括这样的实施方案，其中所述第一种蛋白质部分和所述第二种蛋白质部分中至少 一者是四连蛋白(tetranectin)的衍生物。所述蛋白质治疗剂包括这样的实施方案，其中 所述第一种蛋白质部分和所述第二种蛋白质部分中至少一者是avimer的衍生物。可用于本发明方法的蛋白质治疗剂包括结合人VEGFR-2的第一种蛋白质部分， 其与PEG可操作连接，该PEG与可结合人治疗靶的第二种蛋白质部分可操作连接；其中所述 第一种蛋白质部分以约lOnM或更低的结合亲和力结合人VEGFR-2，并且以约1 y M或更高的 结合亲和力结合人VEGFR-1和VEGFR-3，且基本上没有微生物污染，使其适合于体内施用； 另外其中所述第二种蛋白质部分以约lOnM或更低的结合亲和力结合人治疗靶，并且以约 1 u M或更高的结合亲和力结合无关受体，如人胰岛素受体，且基本上没有微生物污染，使其 适合于体内施用。所述蛋白质治疗剂包括这样的实施方案，其中所述第一种蛋白质部分和 所述第二种蛋白质部分总共具有至少约8个二硫键。所述蛋白质治疗剂包括这样的实施方 案，其中所述第一种蛋白质和所述第二种蛋白质是由微生物表达的单个多肽。所述蛋白质治疗剂包括这样的实施方案，其中所述第一种蛋白质以约100pM或更低的结合亲和力结合人VEGFR-2，且具有至少两个结构环参与所述第一种蛋白质与人 VEGFR-2的结合。所述蛋白质治疗剂包括这样的实施方案，其中所述第一种蛋白质部分和所 述第二种蛋白质部分中至少一者是小于约40kD的抗体部分。所述蛋白质治疗剂包括这样 的实施方案，其中所述第一种蛋白质部分和所述第二种蛋白质部分中至少一者是单链抗体 部分。所述蛋白质治疗剂包括如下实施方案，其中所述第一种蛋白质部分和所述第二种蛋 白质部分中至少一者是脂笼蛋白、四连蛋白、avimer和锚蛋白的衍生物。可用于本发明方法的蛋白质治疗剂包括结合人VEGFR-2的第一种蛋白质部分， 其与PEG可操作连接，该PEG与结合人治疗靶的第二种蛋白质部分可操作连接；其中所述第 一种蛋白质部分以约lOnM或更低的结合亲和力结合人VEGFR-2，并且以约1 y M或更高的结 合亲和力结合人VEGFR-1和VEGFR-3，对于人VEGFR-2的结合基本上是单价的，且基本上没 有微生物污染，使其适合于体内施用；另外其中所述第二种蛋白质部分以约lOnM或更低的 结合亲和力结合人治疗靶，并且以约1 P M或更高的结合亲和力结合无关受体，如人胰岛素 受体，且基本上没有微生物污染，使其适合于体内施用。在该实施方案及本发明的其他实施 方案中，与VEGFR-2基本上单价结合有助于降低VEGFR-2活化。在某些情况下，与VEGFR-2 多价结合，如亲合力(avidity)，的蛋白质(例如全长抗体或Fab)可能引起VEGFR-2活化。 此外，Fabs和全长抗体具有更刚性的构象，可能模拟激活性配体。这还可能引起受体二聚 化。所述蛋白质治疗剂包括这样的实施方案，其中所述PEG为至少约5kD、至少约10kD、至 少约20kD、至少约40kD以及至少约50kD。所述蛋白质治疗剂包括这样的实施方案，其中所 述第一种蛋白质通过单个Cys或Lys与PEG可操作地连接。优选地，在该实施方案和其他 实施方案中，所述第一种蛋白质至多有一个Cys。所述蛋白质治疗剂包括这样的实施方案， 其中所述第二种蛋白质通过单个Cys或Lys与PEG可操作地连接。优选地，在该实施方案 和其他实施方案中，所述第二种蛋白质至多有一个Cys。所述蛋白质治疗剂包括这样的实施 方案，其中所述单个Cys或Lys位于所述第一种蛋白质的氨基酸序列中的非野生型的部位。 所述蛋白质治疗剂包括这样的实施方案，其中所述单个Cys或Lys位于所述第二种蛋白质 的氨基酸序列中的非野生型的部位。可用于本发明方法的蛋白质治疗剂包括结合人VEGFR-2的第一种蛋白质部 分，其可与生物相容性聚合物连接，所述生物相容性聚合物与结合人治疗靶的第二种蛋白 质部分可操作连接；其中所述第一种蛋白质部分以约lOnM或更低的结合亲和力结合人 VEGFR-2,并且以约1 y M或更高的结合亲和力结合无关受体，如人胰岛素受体，且基本上没 有微生物污染，使其适合于体内施用；另外其中所述第二种蛋白质部分以约lOnM或更低的 结合亲和力结合人治疗靶，并且以约1 P M或更高的结合亲和力结合无关受体，如人胰岛素 受体，且基本上没有微生物污染，使其适合于体内施用；另外其中所述第一种蛋白质部分和 第二种蛋白质部分对它们各自的靶标的亲和力是经过优化，以使非治疗性的作用最小而使 与多于一种治疗靶结合的治疗益处最大。所述蛋白质治疗剂包括这样的实施方案，其中生物相容性聚合物接头包括多肽。 所述蛋白质治疗剂包括这样的实施方案，其中所述生物相容性聚合物是PEG。所述蛋白质治 疗剂包括这样的实施方案，其中所述PEG为至少约30kD。所述蛋白质治疗剂包括这样的实 施方案，其中所述第一种蛋白质部分诱导细胞凋亡。所述蛋白质治疗剂包括这样的实施方 案，其中所述第一种蛋白质部分在基于细胞的测定中抑制细胞增殖、阻断VEGF结合、在低
10于IC5(I浓度下不激活人VEGFR-2。在该实施方案及其他实施方案中，所述蛋白质治疗剂可 进一步包括用于IV、IP或皮下施用的药学可接受的配制剂。所述蛋白质治疗剂可包括至少约20kD或约30kD的PEG。PEG连同所述第一种蛋白 质部分一起，可有助于诱导细胞凋亡。为此目的，较大的PEG是优选的。特别优选有单特异 性活性以及与VEGFR-2多价(例如二价)结合的PEG实施方案，以阻断VEGFR-2活性，例如 控制细胞凋亡、磷酸化或二聚化。优选地，所述第一种蛋白质部分在基于细胞的测定中抑制 细胞增殖，阻断VEGF-A、VEGF-C或/和VEGF-D结合，且在低于IC5(1浓度下不激活人VEGFR-2。 所述蛋白质治疗剂可进一步包括用于IV、IP或皮下施用的药学可接受配制剂。优选地，所 述第一种蛋白质部分在基于细胞的测定中诱导细胞凋亡，其IC5(I小于约InM或约10pM。优 选地，所述第一种蛋白质部分在基于细胞的测定中抑制细胞增殖，阻断VEGF-A、VEGF-C和/ 或VEGF-D结合，在低于IC5Q浓度下不激活人VEGFR-2，其IC5(1小于约InM或约10pM。可用于本发明方法的蛋白质包括以下实施方案，其中第一种或第二种蛋白质或多 肽接头具有可被血液或靶组织中的蛋白酶剪切的蛋白酶位点。可以利用这样的实施方案来 释放两种或多种治疗性蛋白，以实现与分别产生所述蛋白质相比更好的递送或治疗学性质 或者更高效的生产。可用于本发明方法的蛋白质包括这样的实施方案，其中两种或多种蛋白质或者多 肽接头利用生物相容性聚合物(例如聚合糖)。所述聚合糖可包括可由血液或靶组织中酶 剪切的酶切位点。可以利用这样的实施方案来释放两种或多种治疗性蛋白，以实现与分别 产生所述蛋白质相比更好的递送或治疗学性质或者更高效的生产。本发明的方法包括这样的蛋白质治疗剂，包括结合人VEGFR-2的第一种蛋白质， 其与PEG可操作地连接，该PEG与结合人蛋白质的第二种蛋白质可操作地连接；其中所述第 一种蛋白质以约lOnM或更低的结合亲和力结合人VEGFR-2，并且以约1 y M或更高的结合亲 和力结合人VEGFR-1和VEGFR-3，其是人VEGFR-2的拮抗剂，且基本上没有微生物污染，使其 适合于体内施用；另外其中所述第二种蛋白以约lOnM或更低的结合亲和力结合人治疗靶， 并且以约1 P M或更高的结合亲和力结合无关受体，如人胰岛素受体，且基本上没有微生物 污染，使其适合于体内施用。所述蛋白质治疗剂包括这样的实施方案，其中所述第一种蛋白质抑制细胞增殖， Tm至少55°C，并且在其氨基酸序列的区域中具有基本上不干扰与人VEGFR-2的结合的非野 生型Cys或Lys。所述蛋白质治疗剂包括这样的实施方案，其中所述第一种蛋白质和所述 第二种蛋白质是由微生物表达的单一多肽。所述蛋白质治疗剂包括这样的实施方案，其中 所述第一种蛋白质以约50pM或更低的结合亲和力结合人VEGFR-2，且具有至少两个结构环 参与所述第一种蛋白质与人VEGFR-2的结合。所述蛋白质治疗剂包括这样的实施方案，其 中所述蛋白质治疗剂在IV施用时体内半衰期至少1天。所述蛋白质治疗剂包括这样的实 施方案，其中所述蛋白质治疗剂在啮齿类动物中施用后超过24小时的时间内，具有至少10 倍于所述第一种蛋白质与人VEGFR-2的结合亲和力的浓度的接触程度(exposure level)。 所述蛋白质治疗剂包括这样的实施方案，其中所述蛋白质治疗剂在啮齿类动物中皮下施用 后超过24小时的时间内，具有至少100倍于所述第一种蛋白质与人VEGFR-2的结合亲和力 的浓度的接触程度。所述蛋白质治疗剂包括这样的实施方案，其中所述第一种蛋白质以约 100pM或更低的结合亲和力结合人VEGFR-2，且具有至少两个结构环参与所述第一种蛋白质与人VEGFR-2的结合。优选地，所述第一种蛋白质或第二种蛋白质或者两者都是基于纤 连蛋白的支架，例如Adnectin 。另外，肿瘤相关靶标(tumor-associated targets)可以作为本发明的方法中的靶 标。在一些实施方案中，抗原靶定作用(antigen targeting)将有助于按照组织分布或以 局部浓度效应增加的方式，使治疗作用局部化到组织或所需细胞类型中。或者，其可在治疗 剂所针对的本文所述的一种靶标之外，进一步提供一种抗癌作用机制。所述抗原或靶标包 括但不限于碳酸酐酶IX、A3、特异针对A33抗体的抗原、BrE3-抗原、⑶1、⑶la、⑶3、⑶5、 CD15、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD45、CD74、CD79a、CD80、HLA-DR、 NCA95、NCA90、HCG 及其亚单位、CEA(CEACAM-5)、CEACAM-6、CSAp、EGFR、EGP-1、EGP-2、 Ep-CAM、Ba 733、HER2/neu、低氧诱导因子(HIF)、KC4-抗原、KS-1-抗原、KS1-4、Le_Y、巨 噬细胞抑制因子(MIF)、MAGE、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、PAM-4-抗原、PSA、PSMA、RS5、S100、 TAG-72、p53、生腱蛋白(tenascin)、IL_6、IL-8、胰岛素生长因子-I (IGF-I)、胰岛素生长 因子-II(IGF-II)、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、胎盘生长因子 (PIGF)、17-1A-抗原、血管生成标志物(例如ED-B纤连蛋白)、癌基因标志物、癌基因产物 以及其他肿瘤相关抗原。最近对于肿瘤相关抗原的报道包括Mizukami等(2005，Nature Med. 11 992-97) ；Hatfield 等(2005，Curr. Cancer Drug Targets5 :229_48) ；Vallbohmer 等(2005，J. Clin. Oncol. 23 :3536-44)以及 Ren 等(2005，Ann. Surg. 242 :55_63)，分别在此 通过援引并入本文。在其他实施方案中，血管生成抑制剂可形成治疗剂的一部分，并且可与VEGFR-2 特异性抑制剂可操作地连接。使用的例示性血管生成抑制剂包括血管他丁(angiostatin)、 baculostatin、canstatin、乳腺丝抑蛋白(maspin)、抗-VEGF抗体或肽、抗-胎盘生长因子 抗体或肽、抗-Flk-1抗体、抗-Flt-1抗体或肽、层粘连蛋白肽、纤连蛋白肽、纤溶酶原激活 剂抑制剂、组织金属蛋白酶抑制剂、干扰素、白细胞介素12、IP-lO、Gro-0、凝血酶敏感蛋白 (thrombospondin)、2_ 甲氧基雌二醇、增殖蛋白相关蛋白(proliferin-relatedprotein)、 羧胺三唑(carboxyamidotriazole)、CM 101、马立马司他(Marimastat)、戊聚糖多硫酸酯 (pentosan polysulphate)、血管生成素2、干扰素-a、除莠霉素A、PNU145156E、16K催乳素 片段、利诺胺(Linomide)、沙利度胺(thalidomide)、己酮可可碱(pentoxifylline)、染料 木黄酮(genistein)、TNP-470、内皮他丁(endostatin)、紫杉醇、accutin、血管他丁、西多 福韦(cidofovir)、长春新碱(vinscristine)、博来霉素(bleomycin)、AGM_1470、血小板因 子4或者米诺环素(minocycline)。本发明提供在治疗转移癌中有用的试剂盒，包括本说明书中所述的一种或多种成 分，还包括应用那些成分的说明书。在优选的实施方案中，本发明的试剂盒包括本发明的蛋 白质，单独或者与第二种治疗剂一起。针对该优选实施方案的所述说明书包括对利用本发 明的蛋白质(单独或者与第二种治疗剂一起)抑制癌细胞生长的说明，和/或对利用本发 明的蛋白质治疗癌症患者的方法的说明。


图1显示了 Comp-I和贝伐单抗在MDA-MB-231原位肺癌转移模型中的作用。将 MDA-MB-231乳腺肿瘤细胞植入小鼠乳腺脂肪垫，在第24天切除产生的肿瘤。第28天开始药物治疗，第118天处死小鼠，评估局部再生和肺转移。
具体实施例方式定义本说明书中使用的“转移(metastasis) ”定义为恶性肿瘤细胞或新生物 (neoplasms)通过循环系统或淋巴系统或者通过天然体腔移动(migration)或转移 (transfer)，通常从肿瘤(tumor)、癌症(cancer)或新生物(neoplasia)的原发病灶至身体 中的远处，随后在一个新的或多个新的部位产生一个或多个继发性肿瘤或其集落。“转移” 包括由于转移形成的继发性肿瘤或集落，还包括微转移(micro-metastasis)。如本说明书中使用的，术语“治疗(treatment) ”、“治疗(treating) ”等，是指获得 理想的药理学和/或生理学效应。所述效应可以是预防性的，体现在以完全或部分预防疾 患或其症状；和/或可以是治疗性的，体现在部分或完全治愈疾患和/或可归因于该疾患的 不良反应。如本说明书中使用的，“治疗(treatment) ”涵盖哺乳动物(特别是人类)疾病的 任何治疗，包括(a)增加存活时间；(b)降低疾病引起的死亡风险；(c)预防疾病在可能易 感该疾病但尚未诊断为患有该疾病的受试者中发生；(d)抑制疾病，即阻止其发展(例如降 低疾病进展的速度)；以及(e)缓解疾病，即引起疾病的消退。具体地，所述疾病(disease)/ 疾患(disorder)是转移或转移的发展(development)。如本说明书中使用的，可“预防(prevent)”疾患或症候(condition)的治疗剂是 这样的化合物在统计样本中，相对于未经治疗的对照样本，它减少治疗样本中疾患或症候 的发生，或者相对于未经治疗的对照样本，它延迟疾患或症候的一种或多种症状的发作或 者降低其严重性。预防转移的试剂，相对于对照，可完全阻断转移的发生或降低形成的转移 灶数目。“多肽(polyp印tide) ”是指任何两个或多个氨基酸的序列，无论长度、翻译后修饰 或功能如何。“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用。多肽可包括天然氨基酸和非 天然氨基酸，例如美国专利6，559，126中所描述的那些，本文通过援引并入该专利。多肽还 可以用许多种标准化学方法中的任一种来修饰(例如，氨基酸可用保护基修饰；羧基端氨 基酸可变成末端酰胺基；氨基末端残基可用基团修饰，以例如增强亲脂性；或者多肽可用 化学方法进行糖基化或其它方式修饰以提高稳定性或体内半衰期)。多肽修饰可包括将另 一种结构如环状化合物或其他分子搭接在多肽上，还可包括具有一个或多个构型改变(即 R或S;或者L或D)的氨基酸的多肽。术语“单域多肽(single domain polyp印tide) ”用 来表示主题多肽的靶结合活性(例如VEGFR-2结合活性)位于单一结构域内，这有别于例 如抗体和单链抗体，后者的抗原结合活性通常由重链可变域和轻链可变域两者所赋予。我 们预期，可以把多个属于本说明书中公开类型的单结构域多肽连接起来以产生亲合力变强 的复合分子。而且，可把单结构域多肽搭接(例如作为融合蛋白)于任何数目的其他多肽， 例如荧光多肽、靶向性多肽和有不同(distinct)疗效的多肽。免疫球蛋白或者免疫球蛋白样支架的单结构域多肽往往会共有某些的结构特征。 举例来说，所述多肽可包括约80个至约150个氨基酸，这些氨基酸在结构上被组织成一组 3链或类0链，形成0折叠片，其中这些0链或类0链通过间插的环部分连接起来。这 些3折叠片形成单结构域多肽的稳定核心，同时生成两个由连接0链或类0链的环构成的“面(faces)”。如本说明书中所述，可以对这些环加以改变来产生定制的配体结合部位， 而且，通过进行适当的控制，可以在不破坏蛋白质的总体稳定性的同时产生所述变化。在抗 体中，这些环中有3个是众所周知的互补决定区(ComplementarityDetermining Regions) (或 “CDR”)。用于形成单结构域多肽的支架在生理条件下应该极易溶且稳定。免疫球蛋白支架 的例子有单结构域支架，还有单结构域骆驼Vhh结构域(在骆驼中发现的一种重链可 变域的形式)或者其他在自然界中发现的或工程化改造的免疫球蛋白可变区。在本说明书 中公开的一种单结构域型式中，免疫球蛋白多肽无需与第二种多肽形成二聚体来获得结合 活性。因此，对于任何天然地含有可介导与第二种蛋白质形成二硫化物交联的半胱氨酸(a cysteine which mediates disulfide cross-linking to a second protein)的多月太，可 以加以改变，除去该半胱氨酸。或者，可保留所述半胱氨酸，用来将额外的部分(例如PEG) 偶联到单结构域多肽上。其他支架可以是非抗体支架蛋白。“非抗体支架蛋白或结构域”是指具有免疫球蛋 白样折叠的非抗体多肽。“免疫球蛋白样折叠”指的是具有约80-150个氨基酸残基的蛋白 质结构域，包括两层反平行的3折叠片，其中两个3折叠片的平坦疏水界面相互挤压在一 起(packed against each other)。所述支架的一个例子是“基于纤连蛋白的支架蛋白”，其 是指基于III型纤连蛋白结构域(Fn3)的多肽。纤连蛋白是一种大蛋白，它在细胞外基质的 形成和细胞间相互作用中发挥重要作用；纤连蛋白由许多个重复的3种类型(I型、II型和 III 型)的小结构域组成(Baron et al. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 1991May 29；332(1263) :165_70)。Fn3本身是一个大亚家族的范式，该家族包括细胞粘附分子的部 分、细胞表面激素和细胞因子受体、伴侣蛋白(chaperoning)，以及碳水化合物结合域。关 于综述参见 Bork and Doolittle, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 19920ct 1 ；89 (19) :8990_4 ; Bork et al.J.Mol. Biol. 1994Sep 30 ；242 (4) 309-20 ；Campbell and Spitzfaden, Structure. 1994Mayl5 ；2 (5) 333-7 ；Harpez and Chothia, J. Mol. Biol. 1994May 13; 238(4) :528-39)。优选地，基于纤连蛋白的支架蛋白为“"^113”支架，其是指一种基于人III型纤连 蛋白第十模块的多肽变体，其中一个或多个溶剂可及环(solventaccessible loops)被随 机化或突变，特别是被称为BC环(氨基酸23-30)、DE环(氨基酸52-56)和TO环(氨基酸 77-87)的3个环中的一个或多个(编号以人纤连蛋白第十个III型结构域上的序列为基 础，氨基酸Val-Ser-ASp-Val-Pr0(SEQ ID NO 62)为氨基酸编号1_5)被随机化或突变。野 生型人III型纤连蛋白结构域第十模块的氨基酸序列为VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYT ITGYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(SEQ IDN0 1)。因此，野生型BC环包含序列DAPAVTVR(SEQ ID NO :63)；野生型DE环包含序列 GSKST (SEQ ID NO 64)；野生型 FG 环包含序列 GRGDSPASSKP (SEQ ID NO :65)。位于 BC、DE 和re环侧翼的序列也称为框架1、框架2、框架3和框架4。优选地，基于纤连蛋白的支架是 以SEQ ID NO 1为基础的。已经鉴定了许多种改善的突变型"^113支架。修饰的Asp7，其由非负电荷氨基酸 残基(如AsruLys等)取代。与野生型形式相比，这些突变都具有促进突变型"^113在中性PH下更高稳定性的作用。支架中许多种其他的改变——它们或者是有益的或者是中
性的-已经被公开。参见例如 Batori et al. Protein Eng. 2002Dec ； 15 (12) :1015_20 ;
Koide et al. Biochemistry2001Aug 28 ；40 (34) :10326_33。变异体和野生型"^113蛋白特征都在于有相同的结构，S卩7个3链结构域序列(命 名为A至和6个环状区域(AB环、BC环、⑶环、DE环、EF环和TO环)，所述环连接所述7个 3链结构域序列。位置靠近N末端和C末端的0链在溶液中可能呈现类0构象。在SEQ ID NO :1中，AB环对应于残基15-16，BC环对应于残基22-30，CD环对应于残基39-45，DE 环对应于残基51-55，EF环对应于残基60-66，FG环对应于残基76-87。BC环、DE环和TO 环都位于多肽的同一端。类似地，免疫球蛋白支架往往具有至少7个0链或类0链，且常 常有9个0链或类0链。Adnectins 可包含其他Fn3型纤连蛋白结构域，只要它们显示 出wfm型结构域的有用的活性和性质。本说明书中公开的单结构域多肽可具有至少5-7个0链或类0链，它们分布在 至少两个3折叠片之间，至少有一个环部分连接两个3链或类3链，所述环部分参与和 VEGFR-2的结合，所述结合的特征在于解离常数小于1 X 10_6M，优选小于1 X 10_8M。如本说明 书中所述，解离常数小于5X 10_9M的多肽特别适合体内治疗性应用来抑制VEGF信号传导。 解离常数在1 X 10_6M至5X 10_9M之间的多肽可能适合用于在离体或体内条件下检测或标记 VEGFR-2 蛋白。任选地，相对于来自相同物种的其他相关蛋白，“VEGFR-2结合蛋白”将与VEGFR-2 特异性结合。“特异性结合”是指多肽识别靶蛋白(如VEGFR-2)并与之相互作用，但基本上 不识别且不与样本(例如生物样本)中其他分子相互作用。在优选的实施方案中，本发明 的多肽将与VEGFR-2特异性结合，Kd至少严格到(at least as tight as)500nM。优选地， 所述多肽将以lpM至500nM，更优选lpM至100nM，更优选lpM至10nM，最优选lpM至InM或 更低的Kd与VEGFR-2特异性结合。“功能性Fc区”具有天然序列Fc区的至少一种“效应物功能”。例示性的“效应物 功能”包括Clq结合；补体依赖性细胞毒性(CDC) ；Fc受体结合；抗体依赖细胞介导的细胞 毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调等。所述效应物功 能通常需要Fc区与结合区域(例如抗体可变域)结合，可以利用本领域公知的多种评估此 类抗体效应物功能的测定法对其所述效应物功能进行评价。“天然序列Fc区，，包括与在自然界发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。“变异Fc区”包括由于至少一个氨基酸修饰而与天然序列Fc区的氨基酸序列不同 的氨基酸序列。优选地，与天然序列Fc区或与亲本多肽的Fc区相比，变异Fc区有至少一个 氨基酸取代，例如在天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区中有约1个至约10个氨基酸取代， 优选约1个至约5个氨基酸取代。本说明书中变异Fc区优选将与天然序列Fc区和/或与 亲本多肽的Fc区具有至少约80%序列同一性，最优选与之有至少约90%序列同一性，更优 选与之有至少约95%序列同一性。“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”指的是一种细胞介导的反应，其中表 达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、中性白细胞和巨噬 细胞)识别结合在靶细胞上的抗体，随后引起靶细胞的裂解。主要的介导ADCC的细胞，即 NK细胞，仅表达Fc yRIII，而单核细胞表达Fc yRI、FcyRII和FcyRIII。FcR在造血细
15胞上的表达在 Ravetch andKinet, Annu. Rev. Immunol. 9 :457_92 (1991)第 464 页表 3 中概 述。为了评价感兴趣的分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定，例如美国专利5，500，362 或5，821，337中所描述的。对于所述测定有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和 天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，感兴趣的分子的ADCC活性可在体内加以评价，例如在动 物模型中，如在 Clynes et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:652-656(1998)中公开的。“人效应细胞”是表达一种或多种FcR、并发挥效应物功能的白细胞。优选地，所述 细胞至少表达Fc yRIII，发挥ADCC效应物功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血 单个核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒T淋巴细胞和中性粒细胞；优选 PBMC和NK细胞。所述效应细胞可从其天然来源，例如从血液或本说明书中所述的PBMC中 分离。术语“Fc受体”和“FcR”用来描述与抗体Fc区结合的受体。优选的FcR是天然 序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体的FcR(y受体)，包括Fc y RI、Fc y RII和 FcyRIII亚类的受体，包括这些受体的等位变体或者可变剪接形式。Fc y RII受体包括 FcyRIIA( “活化受体”)和FcyRIIB( “抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，区别主 要在其胞质区。活化受体FcyRIIA在其胞浆区包含免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。抑 制受体Fc y RIIB在其胞质区包含免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)(综述于Daeron，Armu. Rev. Immunol. 15 :203_234 (1997))。FcRs综述于Ravetch and Kinet,Annu. Rev. Immunol. 9 457-92(1991) ；Capel et al. Immunomethods 4:25—34(1994)；以及 de Haas et al. J. Lab. Clin. Med. 126 =330-41(1995)。其他FcR，包括未来将被鉴定的那些，都包括在本说明书的 术语“FcR”中。该术语还包括新生儿受体FcRn，其负责母体IgGs转移至胎儿(Guyer et al. J. Immunol. 117 587(1976) ；and Kim et al. J. Immunol. 24 :249(1994))。本说明书中“百分比(％ )氨基酸序列同一性”定义为以获得最大百分比序列 同一性为目的将候选序列与某个选定序列比对并且视必要引入缺口之后，候选序列中与 选定序列中的氨基酸残基相阿的氨基酸残基的百分比，同时不将任何保守置换视为序列 同一性的一部分。为了确定百分比氨基酸序列同一性，可以以本领域技术内的多种方式 实现比对，例如，利用公众可获取的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或 Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于测定比对的适当参数，包括实现 覆盖所比较序列全长的最大比对所需的任何算法。但为了本说明书的目的，如下文所述， 利用序列比较计算机程序ALIGN-2获得百分比氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比较 计算机程序由Genentech，Inc编写，已经以用户文档提交到美国版权局(U. S. Copyright Office)，Washington D. C.，20559，其登记为美国版权登记号第TXU510087号，公众可通过 Genentech, Inc.，South San Francisco，Calif 获得。所述 ALIGN-2 程序应被编译用在 UNIX 操作系统上，优选数字UNIX V4.0D。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定，不会改变。
为了本说明书中的目的，给定氨基酸序列A对、与、或针对给定氨基酸序列B的百 分比氨基酸序列同一性(或者可表述为，具有或包含对、与、或针对给定氨基酸序列B的 特定百分比氨基酸同一性的给定氨基酸序列A)可如下计算百分比氨基酸序列同一性= 100*X/Y其中X是在用序列比对程序ALIGN-2作出的A和B的比对中，被该程序记为同一性 匹配的氨基酸残基数目，Y是B中氨基酸残基的总数。应了解，在氨基酸序列A的长度不等 于氨基酸序列B的长度的情况下，A对B的百分比氨基酸序列同一性将不等于B对A的百分比氨基酸序列同一性。“多肽链”是这样的多肽其中所述多肽的每个结构域是通过肽键，而不是通过非 共价相互作用或二硫键，与其他结构域连接的。“分离的”多肽是已经被鉴定并且从其天然环境的组分中分离和/或回收得到的多 肽。其天然环境的污染组分是会干扰多肽的诊断或治疗应用的物质，可能包括酶、激素和其 他蛋白质或非蛋白质溶解物。在优选的实施方案中，所述多肽将被纯化成(1)用Lowry法 测定为超过95% (按重量)，最优选超过99% (按重量)，的多肽；(2)足够使用旋转杯序 列分析仪测到N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度；或者(3)在还原或非还原 条件下SDS-PAGE，利用考马斯蓝，或优选银染，表现为均一。分离的多肽包括重组细胞内的 原位多肽，因为多肽天然环境的至少一种组分将不存在。但是，分离的多肽通常将通过至少 一个纯化步骤来制备。靶标还可以是所述靶标的片段。因此靶标还是能够诱导免疫应答的所述靶标的片 段。靶标还是所述靶标的能够与针对全长靶标的单结构域抗体结合的片段。本说明书中使用的片段，指小于序列的100% (如99%、90%、80%、70%、60%、 50%、40%、30%、20%、10%等)，但包括5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、13个、14 个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多个氨基酸。 片段有足够的长度，使得感兴趣的相互作用以1 X 10_6M或更好的亲和力得以维持。本说明书中使用的片段还指任选的一个或多个氨基酸的插入、删除和置换，这些 插入、删除和置换基本上不改变靶标与针对野生型靶标的单结构域抗体的结合能力。氨基 酸插入、删除或置换的数目优选最多达1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、 11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、 25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、 39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、 53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、 67个、68个、69个或70个氨基酸。“可诱导细胞死亡(induces cell death) ”的本发明蛋白质是可导致活细胞变成 无活力细胞的蛋白质。所述细胞通常是表达蛋白质所结合抗原的细胞，特别是在细胞过 表达抗原的情况下。优选地，所述细胞是癌细胞，例如乳腺、卵巢、胃、子宫内膜、唾液腺、 肺、肾、结肠、甲状腺、胰腺或膀胱细胞。在体外，所述细胞可以是SKBR3、BT474、Calu 3、 MDA-MB453、MDA-MB-361或SK0V3细胞。可在体外无补体和免疫效应细胞存在下测定细胞 死亡，以区分由抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)诱导 的细胞死亡。因此，可利用热灭活血清(即在无补体存在下)和在无免疫效应细胞存在下 进行细胞死亡测定。为了确定本发明的蛋白质是否能够诱导细胞死亡，可以以未处理细胞 为参照，通过碘化丙啶(PI)、锥虫蓝(参见Moore et al. Cytotechnology 17:1-11(1995)) 或7AAD的吸收来评估膜完整性的丧失。本发明的“可诱导细胞凋亡(“induces apoptos)”的蛋白质是诱导程序性细 胞死亡的蛋白质，通过结合凋亡相关分子或事件来确定，所述分子或事件例如膜联蛋白 V(annexin V)、DNA碎片、细胞皱缩、内质网膨胀、细胞破碎，和/或囊泡(称为凋亡小体) 形成。所述细胞是表达所述蛋白质与之结合的抗原的细胞，还可以是过表达该抗原的细
17胞。所述细胞可以是肿瘤细胞，例如乳腺、卵巢、胃、子宫内膜、唾液腺、肺、肾、结肠、甲状 腺、胰腺或膀胱细胞。在体外，所述细胞可以是SKBR3、BT474、Calu 3细胞、MDA-MB453、 MDA-MB-361或SK0V3细胞。可利用多种方法评估与凋亡有关的细胞事件。例如，可通过膜 联蛋白结合测定磷脂酰丝氨酸(PS)易位；可通过本说明书实施例中公开的DNA梯状断裂 (DNA laddering)来估计DNA的片段化；以及依据亚二倍体细胞的任何增加来评估伴随DNA 片段化的核/染色质凝聚。优选地，可诱导细胞凋亡的蛋白质是这样的蛋白质利用表达本 发明蛋白质所结合的抗原的细胞进行膜联蛋白结合测定时，相对于未经处理的细胞，该蛋 白质导致膜联蛋白结合的约2-50倍，优选约5-50倍，最优选约10-50倍的诱导。术语“治疗有效量”是指有效治疗哺乳动物疾病或疾患的药物的量。就癌症来 说，药物的治疗有效量可减少癌细胞的数量；降低肿瘤大小；抑制(即一定程度上减慢，优 选阻止)癌细胞浸润至周围器官中；抑制(即一定程度上减慢，优选阻止)肿瘤转移；一 定程度上抑制肿瘤生长；和/或一定程度上缓解与疾患有关的一种或多种症状。以药物 可阻止癌细胞生长和/或杀死存在的癌细胞为限，药物可以是细胞生长抑制剂和/或细胞 毒剂。对于癌症治疗，体内效力可以通过，例如，评估疾病进展前时间(time to disease progression, TTP)和 / 或确定应答率(response rate, RR)来测定。术语“PK”是“药物动力学(pharmokinetic)”的缩写，涵盖化合物的性质，举例来 说包括由受试者吸收、分布、代谢和消除。“PK调节蛋白(PKmodulation protein)”是指当 与生物活性分子融合或与生物活性分子一起施用时，影响生物活性分子药物动力学性质的 任一蛋白质或肽。PK调节蛋白的实例包括PEG，以及美国专利申请流水号11/106，415和 11/331,415中公开的人血清白蛋白(HSA)结合剂。概述本申请提供治疗、预防或降低转移严重性的新方法。本申请在某种程度上依 赖于一个令人惊讶的发现，即选择性抑制VEGFR2可以降低癌症模型中转移的发生率 (prevalence)0本说明书中所述的方法学已成功用于开发在转移癌的治疗中有用的本发明的蛋 白质，包括但不限于单结构域VEGFR-2结合性多肽，所述VEGFR-2结合性多肽来源于蛋白质 结构的至少两个相关基团具有免疫球蛋白折叠片的那些蛋白质和具有免疫球蛋白样折叠 片的那些蛋白质。转移的治疗在一个方面，本申请提供治疗罹患转移癌的患者的方法，包括施用VEGFR-2特异 性抑制剂。施用抑制剂使接受治疗的患者产生统计学显著的且临床上有意义的改善，依据 存活时间、无进展存活(progression freesurvival)、应答率或应答持续时间来量度。在某 些实施方案中，患者罹患转移的乳腺癌、转移的结直肠癌或转移的肺癌。在一些实施方案中，接受治疗的患者有转移癌发病的风险。例如，根据癌症的类 型，癌症患者可能存在高的转移风险。施用抑制剂降低产生转移灶的风险，降低转移灶的数 目，或降低转移灶的大小。适用本发明治疗的癌症包括但不限于癌(carcinoma)、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤以 及白血病或淋巴恶性肿瘤。所述癌症更具体的例子包括鳞状细胞癌、肺癌(包括小细胞肺 癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌和肺的鳞癌)、腹膜癌症、肝细胞癌症、胃癌(包括胃肠癌)、胰
18腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、 结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌(liver cancer)、前列腺癌、外阴癌、 甲状腺癌、肝癌(h印atic carcinoma)和多种类型头颈癌，以及B细胞淋巴瘤(包括低级/ 滤泡非何杰金氏淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL ；中级/滤泡NHL ；中级弥漫性NHL ；高 级成免疫细胞NHL ；高级成淋巴细胞NHL ；高级小无核裂细胞NHL(small non-cleaved cell NHL)；巨大肿瘤(bulky disease)NHL ；外套细胞淋巴瘤；艾滋病相关淋巴瘤和Waldenstrom 巨球蛋白血症)；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性淋巴细胞白血病(ALL)；毛细胞白血 病；慢性成髓细胞白血病；和移植后淋巴增生性疾患(PTLD)，以及与斑痣性错构瘤病相关 的血管增生、水肿(例如与脑瘤相关的水肿)和梅格斯综合征(Meigs' syndrome)。优 选地，所述癌症选自下组乳腺癌、结直肠癌、直肠癌、非小细胞肺癌、非何杰金氏淋巴瘤 (NHL)、肾细胞癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、软组织肉瘤、卡波西肉瘤、类癌癌(carcinoid carcinoma)、头颈癌、黑色素瘤、卵巢癌、间皮瘤和多发性骨髓瘤。本发明的方法特别适合于 治疗血管化肿瘤。在一些实施方案中，VEGFR-2特异性抑制剂的施用可抑制至少约10%、20%、 30%、40%、60%、70%、80%、90%或100%的转移。在一些实施方案中，提供了抑制淋巴结 转移的方法。在一些实施方案中，提供了抑制肺转移的方法。联合化疗在其他治疗性处理中，VEGFR-2抑制剂与一种或多种另外的治疗剂共同施用或相 继施用。合适的治疗剂包括但不限于靶向治疗剂、其他靶向生物制品，以及细胞毒剂或细胞 抑制剂。在某些情况下，将优选由同一个或单独的治疗上可接受的贮存液体配制剂的管形 瓶、注射器或其他给药装置施用试剂。癌症治疗剂是那些旨在杀死癌细胞或限制癌细胞生长而对患者影响极小的药剂。 因此，这样的药剂可利用癌细胞性质(例如代谢、血管化或细胞表面抗原呈递)与健康宿 主细胞的任何差异。肿瘤形态学的差异是可能的介入位点例如，第二种治疗剂可为抗体， 例如抗VEGF抗体，其有用于阻碍实体瘤内部的血管化，从而减慢其生长速率。其他治疗 剂包括但不限于辅助剂如盐酸格拉司琼(granisetron HC1)，雄激素抑制剂如醋酸亮丙瑞 林(leuprolide acetate)，抗生素如多柔比星，抗雌激素药如他莫昔芬，抗代谢药如干扰素 a -2a,细胞毒剂如泰素(taxol)，酶抑制剂如ras法尼酰基转移酶抑制剂，免疫调节剂如阿 地白介素(aldesleukin)，以及氮芥衍生物如盐酸美法仑等。在一些实施方案中，本发明提供一种增加患有转移癌或具有转移癌发病风险的人 类患者的存活时间的方法，包括向所述患者施以有效量的VEGFR-2特异性抑制剂和抗肿瘤 组合物，其中所述抗肿瘤组合物包含至少一种化疗剂，由此，VEGFR-2特异性抑制剂和抗肿 瘤组合物共同施用可有效地增加存活时间。在一些实施方案中，本发明提供一种增加患有转移癌或具有转移癌发病风险的人 类患者的无进展存活的方法，包括向所述患者施以有效量的VEGFR-2特异性抑制剂和抗肿 瘤组合物，其中所述抗肿瘤组合物包括至少一种化疗剂，由此，VEGFR-2特异性抑制剂和抗 肿瘤组合物共同施用可有效地增加无进展存活时间。此外，本发明提供一种治疗患有转移癌或具有转移癌发病风险的人类患者组的方 法，包括向所述患者施以有效量的VEGFR-2特异性抑制剂和抗肿瘤组合物，其中所述抗肿
19瘤组合物包括至少一种化疗剂，由此，VEGFR-2特异性抑制剂和抗肿瘤组合物共同施用可有 效地增加患者组中的应答率。还在另一方面，本发明提供一种增加患有转移癌或具有转移癌发病风险的人类患 者应答持续时间的方法，包括向所述患者施以有效量的VEGFR-2特异性抑制剂和抗肿瘤组 合物，其中所述抗肿瘤组合物包括至少一种化疗剂，由此，VEGFR-2特异性抑制剂和抗肿瘤 组合物共同施用可有效地增加应答持续时间。可用于本发明方法的化疗剂包括烷化剂类(alkylating agents)，诸如 塞替派(thiot印a)和CYTOXAN 环磷酰胺(cyclophosphamide)；磺酸烷基 酯类(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和 哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzocbpa)、卡 波醌(carboquone)、美妥替派(meturecbpa)和乌瑞替派(urecbpa)；乙撑亚胺类 (ethylenimines)禾口甲基蜜胺类(methylamelamines),包括六甲蜜胺(altretamine)、三 乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylen印hosphoramide)、三乙撑 硫代磷酉先胺(triethylenethiophosphoramide)禾口三轻甲蜜胺(trimethylolomelamine)； 番荔枝内酯类(acetogenins)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮 (bullatacinone))；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan)； 苔藓抑素(bryostatin) ；callystatin ；CC-1065 (包括其阿多来新(adozelesin)、卡折 来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；隐藻素类(cryptophycins) (特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin) ；duocarmycin (包括合 成类似物，KW-2189 和 CB1-TM1)；艾槽塞洛素(eleutherobin) ；pancratistatin ； sarcodictyin ；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards),诸如苯丁酸 氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫 司汀(estramustine)、异环磷酉先胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、 盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仓(melphalan)、新氮 芥(novembichin)、苯芥胆甾酉享(phenesterine)、拨尼莫司汀(prednimustine)、曲磷 胺(trofosfamide)、尿啼唆氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas),诸如 卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司 汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，诸如烯 二炔类抗生素(enediyne)(如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素y II 和加利车霉素《 II (参见例如 Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl. 33 :183-186 (1994))；蒽环 类抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A;双膦酸盐(bisphosphonates)，诸如氯屈膦 酸盐(clodronate) ;±矣其if波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin) 发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线 菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素 (bleomycin)、放线菌素 C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌 霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、方文线菌素 D(dactinomycin)、柔红霉素 (daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6_ 二氮-5-氧 _L_ 正亮氨酸、ADRIAMYCIN 多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔 比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(印irubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星
20(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、 霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉 素(peplomycin)、potfiromycin、口票呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗 多比星(rodorubicin)、链黑菌素(str印tonigrin)、链佐星(str印tozocin)、杀结核菌素 (tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗 代谢物类，诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、 甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟 达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌 呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、 6_氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、 去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素 类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇 (epitiostanol)、美雄烧(mepitiostane—)、辜内酉旨(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氛 鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂， 诸如亚叶酸(folinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酉先丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿啼唆(eniluracil)；安口丫 唆(amsacrine) ；bestrabucil ；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酉先 月安(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地口丫酉昆(diaziquone) ；elfornithine ； He 利醋铵(elliptinium acetate)；埃坡霉素(印othilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝 酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登木素 生物喊类(maytansinoids),诸如美登素(maytansine)禾口安丝菌素(ansamitocins)； 米托月瓜月宗(mitoguazone)；米托惠酉昆(mitoxantrone)；莫喊达酉享(mopidamol) ； 二月安 硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁 (pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星 (pirarubicin)；洛索惠酉昆(losoxantrone)；鬼白酸(podophyllic acid)、2_ 乙基酉先月井 (ethylhydrazide)；丙卡巴胼(procarbazine) ；pSK 多糖复合物(JHS Natural Products, Eugene, OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；螺旋锗 (spirogermanium)；细交链于包菌丽酸(tenuazonic acid)；三亚月安酉昆(triaziquone) ；2, 2'，2〃 _三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素 (verrucarin)A、杆抱菌素(roridin) A 禾口蛇对亍菌素(anguidin))；乌拉坦(urethan)；长春 地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露酉享氮芥(mannomustine) ；二溴甘露酉享 (mitobronitol) ；二漠卫矛酉享(mitolactol)；喊泊漠烧(pipobroman) ；gacytosine ；阿糖 胞苷(arabinoside) ( “Ara_C”)；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇(taxoids)，例如 TAX0L 紫杉醇(paclitaxel) (Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N. J.)、ABRAXANE 不 含克列莫佛(Cremophor)，白蛋白改造的纳米颗粒剂型紫杉醇(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois)禾口 TAXOTERE 多西他塞(doxetaxel) ( Rhone -Poulenc Rorer,Antony,France)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他滨(gemcitabine) (GEMZAR ) ；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤 (methotrexate)；钼配位复合物，诸如顺钼(cisplatin)、奥沙利钼(oxaliplatin)和卡 钼(carboplatin)；长春碱(vinblastine)；钼；依托泊苷(etoposide) (VP-16)；异环磷
21酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine) ；NAVELBINE 长春瑞滨(vinorelbine)；能灭瘤(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙 (edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊 本膦酸盐(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)(例如CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000 ；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类维A酸(retinoids)，诸如维A酸(retinoic acid)；卡培 他滨(capecitabine)；和任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物；另外的试剂包括阿巴瑞克(abarelix)、六甲蜜胺、氨鲁米特、安吖啶、阿那曲唑、安 肽、天冬酰胺酶、AZD2171 (Recentin )、卡介苗/BCG(TheraCys ，TICE )、贝伐单抗(参见 美国专利6，054，297 ；bevacizumab )、比卡鲁胺、博来霉素、硼替佐米(Velcade )、布舍瑞 林、白消安、喜树碱、卡培他滨、卡钼、卡莫司、西妥昔单抗(Erbitux )、苯丁酸氮芥、顺钼、克 拉屈滨、氯屈膦酸盐、秋水仙碱、环磷酰胺、环丙孕酮、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素D、达沙 替尼(dasatinib)(参见美国专利6，596，746 ；Spryce 1 )、柔红霉素、己二烯雌酚、己烯雌 酚、地塞米松、多西他赛(Taxotere )、多柔比星、Abx-EGF、埃博霉素(印othilones)、表柔 比星、厄洛替尼(Tarceva )、雌二醇、雌莫司汀、依托泊苷、依西美坦、5_氟尿嘧啶、非格司 亭、氟达拉滨、氟氢可的松、氟尿嘧啶、氟甲睾酮、氟他胺、氟维司群、吉非替尼(Iressa )、吉 西他滨(参见美国专利4，808，614 ；Gemzar )、染料木黄酮(genistein)、戈舍瑞林、羟基脲、 伊达比星、异环磷酰胺、甲磺酸伊马替尼(参见美国专利5，521，184 ；Gleevac )、干扰素、 伊立替康、替伊莫单抗(ibritumomab) (Zevalin ), ironotecan、伊沙匹隆(BMS-247550)、 拉帕替尼(参见美国专利6，391，874 ；Tykreb )、来曲唑、亚叶酸钙、亮丙瑞林、左旋咪唑、 洛莫司汀、氮芥、甲羟孕酮、甲地孕酮、美法仑、巯嘌呤、美司钠、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托 坦、米托蒽醌、二磷酸莫替沙尼(AMG 706)、尼鲁米特、诺考达唑、奥曲肽、奥沙利钼、紫杉 醇(Taxo 1 )、帕玛二磷酸(pamidronate)、喷司他丁(pentostatin)、普卡霉素、卩卜菲尔钠 (porfimer)、丙卡巴胼(procarbazine)、雷替曲塞(raltitrexed)、雷帕霉素、利妥昔单抗 (Rituxan )、索拉非尼(NexaVarTM/Bayer BAY43-9006)、链佐星、舒拉明、苹果酸舒尼替尼 (参见美国专利6，573，293 ；Sutent )、他莫昔芬、temsirolimus (参见美国专利5，362，718 ； CC1-779)、替莫唑胺(参见美国专利5，260，291 ；Temodar )、替尼泊苷、睾酮、硫鸟嘌呤、塞 替派、二氯环戊二烯钛、托泊替康、托瑞米芬、托西莫单抗(Bexxar )、曲妥珠单抗(美国专 利 5，821，337 ；Here印tin )、维 A 酸(tretinoin)、VEGF Trap (阿柏西普(aflibercept)； 制备描述于美国专利5，844，099)、长春碱、长春新碱、长春地辛，以及长春瑞滨、唑来膦酸 (zoledronate)0在一些实施方案中，所述抗肿瘤组合物是以氟尿嘧啶为基础的联合给药方案。所 述联合给药方案可例如包括5-FU+亚叶酸钙、5-FU+亚叶酸钙+伊立替康(IFL)，或者5-FU+ 亚叶酸钙+奥沙利钼(F0LF0X)。化疗剂的这个定义中还包括发挥调节或抑制肿瘤上激素活化作用的抗激素 剂，例如抗雌激素类和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括例如他莫昔芬(包括 NOLVADEX 他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4_羟基他莫昔 芬 4-(hydroxytamoxifen)、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、 奥那司酮(onapristone)和FAREST0N托瑞米芬(toremifene)；抑制芳香酶的芳香酶抑 制剂，其调节肾上腺中的雌激素生成，例如，4(5)-咪唑类、氨鲁米特、MEGASE 醋酸甲地孕
22酮、AR0MASIN 依西美坦、福美斯坦(formestanie)、法倔唑、RIVIS0R 伏氯唑(vorozole)、 FEMARA 来曲唑和ARIMIDEXTM阿那曲唑；以及抗雄激素类例如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁 胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；还有曲沙他滨(一种1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡 核苷酸，特别是抑制异常细胞增殖涉及的信号通道中的基因，例如，PKC-α、Ralf和H-Ras， 的表达的那些反义寡核苷酸；核酶类(ribozyme)例如VEGF表达抑制剂(如ANGI0ZYME 核 酶)和HER2表达抑制剂；疫苗例如基因治疗疫苗，如ALL0VECTIN 疫苗、LEUVECTIN 疫苗 和 VAXID 疫苗；PR0LEUKIN rIL-2 ；LURT0TECAN 拓扑异构酶 1 抑制剂；ABARELIX rmRH;W 及任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物。用在本说明书中时，“生长抑制剂(growth inhibitory agent) ”是指可在体外和 /或体内抑制细胞生长的化合物或组合物。因此，所述生长抑制剂可以是显著降低S期细胞 的百分比的抑制剂。所述生长抑制剂的例子包括阻碍细胞周期进展(在除S期外的地方) 的试剂，例如引起Gl期阻滞和M期阻滞的试剂。经典的M期阻滞剂包括长春药属(vincas) (长春新碱和长春碱)、TAX0L 和拓扑II抑制剂例如多柔比星、表柔比星、柔红霉素、依托泊 苷和博来霉素。阻滞Gl的那些试剂还影响到S期阻滞，例如，DNA烷化剂如他莫昔芬、泼尼 松、达卡巴嗪、氮芥、顺钼、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶和阿糖胞苷。更多信息可在The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds. ， Chapter 1， entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplasticdrugs"by Murakami et al. (WB Saunders Philadelphia, 1995)，尤其是第13页中发现。术语“细胞因子(cytokine)”是由一个细胞群释放的、作为细胞间介质作用于另 一个细胞的蛋白质的总称。所述细胞因子的例子有淋巴因子、单核因子和传统的多肽激 素。细胞因子中包括生长激素例如人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素，和牛生长激素； 甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素如滤泡刺激激 素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH)；表皮生长因子；肝细胞生长因子；成纤 维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳激素；肿瘤坏死因子α和肿瘤坏死因子β ；副中肾管 抑制物质；小鼠促性腺素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板 生成素(TPO)；神经生长因子如NGF-α ；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)如TGF-α 和TGF-β ；胰岛素样生长因子-I和胰岛素样生长因子-II ；红细胞生成素(EPO)；骨诱 导因子；干扰素如干扰素-α，干扰素-β和干扰素-Y ；集落刺激因子(CSF)如巨噬细 胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；以及粒细胞-CSF(G-CSF)；白细胞介素 (IL)如 IL-UIL-I α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12 ； 肿瘤坏死因子如TNF- α或TNF- β ；以及其他多肽因子包括LIF和kit配体(KL)。如本说 明书中使用的，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质，以及天 然序列细胞因子的生物学活性的等价物。本申请中使用的术语“前药(prodrug)”是指药学活性物质的前体或衍生物 形式，其与母体药物相比对肿瘤细胞的细胞毒性更小，能够经酶活化或者转化成更具活 性的母体形式。参见例如 Wilman，"Prodrugs in CancerChemotherapy，，Biochemical Society Transactions,14, pp.375-382,615thMeeting Belfast (1986)禾口 Stella et al. "Prodrugs :A Chemical Approach toTargeted Drug Delivery,，，Directed Drug Delivery, Borchardt et al. (ed.), pp. 247-267，Humana Press(1985)。本发明的前药包
23括但不限于含磷酸盐的前药、含硫代磷酸盐的前药、含硫酸盐的前药、含肽的前药、D-氨基 酸修饰的前药、糖基化的前药、含内酰胺的前药、含任选取代的苯氧基乙酰胺的前药或 含任选性取代的苯乙酰胺的前药、5-氟胞嘧啶和其他5-氟尿嘧啶前药，它们可被转化成更 有活性而无细胞毒性的药物。可被衍生化成前药形式用在本发明中的细胞毒药物的例子包 括但不限于上述那些化疗剂。可在施用VEGFR-2特异性抑制剂之前、同时或之后施用一种或多种另外的治疗 剂。技术人员将理解，对于每种治疗剂，按某种特定顺序施用可能具有优势。同样，技术人 员将理解，对于每种治疗剂，试剂和VEGFR-2特异性抑制剂施用之间的时长将有不同。与放疗和手术的联合疗法在另一方面，本发明提供一种治疗患有转移癌或具有转移癌发病风险的患者的方 法，其包括第一种疗法和第二种疗法，所述第一种疗法包括施用VEGFR-2特异性抑制剂，所 述第二种疗法包括放射和/或手术。所述VEGFR-2特异性抑制剂的施用可在放射和/或手术之前、放射和/或手术之 后或者与放射和/或手术同时。例如，所述VEGFR-2特异性抑制剂的施用可在放射和/或 手术治疗之前或之后相隔从分钟计到以周计的时间进行。在一些实施方案中，第一种疗法 和第二种疗法之间的时间使得所述VEGFR-2特异性抑制剂和放射/手术仍然能对细胞发 挥有利的联用效果。例如，可以在放射和/或手术之前少于约1小时、3小时、6小时、9小 时、12小时、18小时、24小时、48小时、60小时、72小时、84小时、96小时、108小时、或120 小时施用所述VEGFR-2特异性抑制剂。在一些实施方案中，在放射和/或手术之前不到约 9小时施用所述VEGFR-2特异性抑制剂。在一些实施方案中，在放射/手术之前不到约1 天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天施用纳米颗粒组合物(nanoparticle composition)。在一些实施方案中，在放射和/或手术之后不到约1小时、3小时、6小时、9 小时、12小时、18小时、24小时、48小时、60小时、72小时、84小时、96小时、108小时或120 小时施用所述VEGFR-2特异性抑制剂。在一些实施方案中，显著地延长治疗时间可能是理 想的，其中所述两种疗法之间历时数日至数周。本说明书中预期的放射包括例如y射线、X射线(外线束)，及将放射性同位素 直接投递至肿瘤细胞。还预期了其他形式的DNA损伤因素，例如还预期子微波和紫外线照 射。放射线可以单剂量给予，或者按照剂量分次方案分成一系列小剂量给予。本说明书 中涉及的放射线的量从约IGy至约lOOGy，包括例如约5Gy至约80Gy、约IOGy至约50Gy， 或者约10Gy。总剂量可以以分次方案施用。例如，所述方案可以包括多次2Gy的单剂量 (fractionated individual doses of 2Gy)。放射性同位素的剂量范围差别很大，取决于 同位素的半衰期以及所发射的放射线的强度和类型。当所述放射线包括应用放射性同位素时，可使所述同位素与靶向试剂偶联。靶向 试剂，例如治疗性抗体，携带所述放射性核素至靶组织。合适的放射性同位素包括但不限于
砹 21V4 碳、51 铬、36 氯、58 钴、铜67、152 铕、镓67、3 氢、碘123、碘(131、铟 1V7 铁、59 铁、32 磷、铼186、 75硒、35硫、锝99和/或钇9°。在一些实施方案中，对个体施加足够的放射，使实现相同程度的治疗所需的 VEGFR-2特异性抑制剂的正常剂量降低至少约5%、10%、20%、30%、50%、60%、70%、 80%、90%或更多。在一些实施方案中，施用足够的VEGFR-2特异性抑制剂，使实现相同程
24度的治疗所需的放射的正常剂量降低至少约5 %、10 %、20 %、30 %、50 %、60 %、70 %、80 %、
90 %或更多。在一些实施方案中，与各自单独应用时相应的正常剂量相比，VEGFR-2特异性 抑制剂和放射线两者的剂量都降低。在一些实施方案中，联合施用VEGFR-2特异性抑制剂和放射治疗产生超叠加作 用。在一些实施方案中，VEGFR-2特异性抑制剂施用一次，放射线以每日一次SOGy应用5 次。本说明书中所述手术包括切除术，其中所有或部分癌组织被物理性移除、切除 (exercise)和/或破坏。肿瘤切除术是指物理性移除至少部分肿瘤。除肿瘤切除术外，手 术治疗包括激光手术、冷冻手术、电外科手术和显微镜控制手术(Mohs surgery)。还涉及体 表手术移除初期癌或正常组织。除了施用化疗剂外，还可以进行放疗和/或手术。例如，可以首先向个体施以含紫 杉烷的纳米颗粒组合物和至少一种其他化疗剂，随后对个体进行放疗和/或手术。或者，可 以首先用放疗和/或手术来治疗个体，随后向其施以纳米颗粒组合物和至少一种其他化疗 剂。其他组合也在考虑之内。在一个实施方案中，本发明可用于增加对易患转移癌或被诊断为转移癌的人类患 者的存活时间。存活时间(duration of survival)定义为自首次施用药物起至死亡的时 间。在一个优选的方面，向人类患者联合施用VEGFR-2特异性抑制剂与一种或多种化疗剂， 从而使患者的存活时间与单独化疗相比有效增加。例如，用VEGFR-2特异性抑制剂与至少 两种，优选3种化疗剂的化疗鸡尾酒联合治疗的患者组可有至少2个月，优选约2个月至约 5个月的中值存活期，比单独用相同的化疗鸡尾酒治疗的患者组的中值存活期长，该增加是 统计学显著的。存活时间还可以通过治疗组与对照组的分层危害比(HR)来测定，其代表患 者在治疗期间死亡的风险。优选地，与单独化疗相比，VEGFR-2特异性抑制剂与一种或多种 化疗剂的联合治疗将死亡风险显著地降低至少约30% ( S卩，分层HR约0. 70)，优选至少约 35% (即，分层 HR 约 0.65)。在另一个实施方案中，本发明提供用于增加易患转移癌或被诊断为转移癌的人
皿(progression free survival)白勺力夕去。皿IlfBi(time to disease progression)定义为从施用药物起直至疾病进展的时间。在一个优选的实施方案 中，本发明的利用VEGFR-2特异性抑制剂和一种或多种化疗剂的联合治疗，与单独用化学 疗法治疗相比，使无进展存活时间显著地增加至少约2个月，优选约2个月至约5个月。在另一个实施方案中，本发明的治疗显著增加用多种治疗剂治疗的易患转移癌或 被诊断为转移癌的人类患者组中的应答率。应答率定义为对治疗有应答的受治疗患者的百 分比。在一个方面，本发明的利用VEGFR-2特异性抑制剂和一种或多种化疗剂的联合治疗， 与单独用用化学疗法治疗组相比，显著地增加治疗患者组的应答率，所述增加的卡方P值 小于0. 005。在一个方面，本发明提供增加易患癌症或被诊断为癌症的人类患者或人类患者组 中应答持续时间的方法。应答持续时间定义为从初始应答至疾病进展的时间。在本发明的 利用VEGFR-2特异性抑制剂和一种或多种化疗剂的联合治疗中，应答持续时间统计学上显 著地增加至少2个月是可以达到的，并且是优选的。VEGFR-2特异性抑制剂
25
如美国专利申请流水号11/482，641、11/448，171和PCT国际申请公开号WO 05/056764所述制备了 VEGFR-2特异性抑制剂，本文援引并入这些文献。这些抑制剂于美国 临时专利申请流水号60/899，094中有进一步描述，本文援引并入该文献。可用于本发明的优选的VEGFR-2结合性kiFM多肽的序列如下SEQ ID NO 2VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYT ITVYAVTEGPNERSLFIPISINYRTSEQ ID NO 3EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTE GPNERSLFIPISINYRTSEQ ID NO 4GEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVT DGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPCQSEQ ID NO 5EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTD GRNGRLLSIPISINYRTSEQ ID NO 6EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTM GLYGHELLTPISINYRTSEQ ID NO 7 EVVAATPTSLLISffRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTD GENGQFLLVPISINYRTSEQ ID NO 8EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTM GPNDNELLTPISINYRTSEQ ID NO 9EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTA GffDDHELFIPISINYRTSEQ ID NO: 10EVVAATPTSLLISffRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTS GHNDHMLMIPISINYRTSEQ ID NO: 11EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTA GYNDQILMTPISINYRTSEQ ID NO: 12EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTF GLYGKELLIPISINYRTSEQ ID NO: 13EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTT
26GPNDRLLFVPISINYRTSEQ ID NO: 14EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTD VYNDHEIKTPISINYRTSEQ ID NO: 15EWAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATI SGLKPGVDYT I TGYAVTD GKDGRVLLTPISINYRTSEQ ID NO: 16EWAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATI SGLKPGVDYT ITGYAVTE VHHDREIKTPISINYRTSEQ ID NO: 17 EVVAATPTSLLISffRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTQ APNDRVLYTPISINYRTSEQ ID NO: 18EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTR EENDHELLIPISINYRTSEQ ID NO: 19EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTV THNGHPLMTPISINYRTSEQ ID NO:20EVVAATPTSLLISffRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTL ALKGHELLTPISINYRTSEQ ID NO 21VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYT ITGYAVTVAQNDHELITPISINYRTSEQ ID NO:22 VSDVPRDL/QEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPAATISGLKPGVD YTITGYAVTMAQSGHELFTPISINYRTSEQ ID NO:24EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTV ERNGRVLMTPISINYRTSEQ ID NO:25EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTV ERNGRHLMTPISINYRTSEQ ID NO:26EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTL ERNGRELMTPISINYRTSEQ ID NO:27EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTE
27ERNGRTLRTPISINYRT
SEQ ID NO:28 EVVAATPTSLLISffRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTV ERNDRVLFTPISINYRTSEQ ID NO:29EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTV ERNGRELMTPISINYRTSEQ ID NO:30EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTL ERNGRELMVPISINYRTSEQ ID NO 31EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTD GRNDRKLMVPISINYRTSEQ ID NO:32EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTD GQNGRLLNVPISINYRTSEQ ID NO:33 EVVAATPTSLLISWRHHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTTTGYAVT VHWNGRELMTPISINYRTSEQ ID NO:34EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTE EffNGRVLMTPISINYRTSEQ ID NO:35EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTV ERNGHTLMTPISINYRTSEQ ID NO:36EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTV EENGRQLMTPISINYRTSEQ ID NO:37EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTL ERNGQVLFTPISINYRTSEQ ID NO:38 EVVAATPTSLLISffRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTV ERNGQVLYTPISINYRTSEQ ID NO:39EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTff GYKDHELLIPISINYRTSEQ ID NO:40EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTL
28GRNDRELLTPISINYRTSEQ ID NO 41EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTD GPNDRLLNIPISINYRTSEQ ID NO 42EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTF ARDGHEILTPISINYRTSEQ ID NO 43 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTL EQNGRELMTPISINYRTSEQ ID NO 44EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTV EENGRVLNTPISINYRTSEQ ID NO 45EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTL EPNGRYLMVPISINYRTSEQ ID NO 46EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTE GRNGRELFIPISINYRTSEQ ID NO 47VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPAATISGLKPGVDYT ITGYAVTffERNGRELFTPISINYRTSEQ ID NO:48 VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPAATISGLKPGVDYT ITGYAVTKERNGRELFTPISINYRTSEQ ID NO:49VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTHYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPAATISGLKPGVDYT ITGYAVTTERTGRELFTPISINYRTSEQ ID NO:50VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTHYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPAATISGLKPGVDYT ITGYAVTKERSGRELFTPISINYRTSEQ ID NO 51VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTHYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPAATISGLKPGVDYT ITGYAVTLERDGRELFTPISINYRTSEQ ID NO:52VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPLATISGLKPGVDYT ITG/VYAVTKERNGRELFTPISINYRTSEQ ID NO 53VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPTTATISGLKPGVDYT
29ITGYAVTffERNGRELFTPISINYRTSEQ ID NO 54VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPTVATISGLKPGVDYT ITGYAVTLERNDRELFTPISINYRTSEQ ID NO 55MGEVVAATPTSLLISffRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAV TDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPSQSEQ ID NO 56MGEVVAATPTSLLISffRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAV TDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPCQSEQ ID NO 57MVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDY TITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPSQSEQ ID NO 58MGEVVAATPTSLLISffRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAV TDGffNGRLLSIPISINYRTSEQ ID NO 59MGEVVAATPTSLLISffRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAV TEGPNERSLFIPISINYRTSEQ ID NO 60MVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDY TITVYAVTEGPNERSLFIPISINYRT本发明的蛋白质包含本文所公开的氨基酸序列，其中前8个氨基酸缺失，可能在N 末端或C末端包含额外的氨基酸。例如，N末端可以具有额外的MG序列。所述M通常将被 剪切掉，在N末端留下GEV...序列。将这8个正常的氨基酸重新添加到N末端也可产生具 有所需性质的VEGFR-2结合蛋白。在一些实施方案中，N末端甲硫氨酸被剪切掉。为了体 内应用，可产生适合于聚乙二醇化的形式。在一个实施方案中，可添加包含半胱氨酸的C末 端尾巴(例如，在C末端添加EIDKPCQ(SEQ ID N0:61))。附加的蛋白质实施方案可用在本发明方法中的蛋白质包括本说明书中所述的单结构域多肽，通常为与靶 标，例如VEGFR-2，结合的多肽，且其中靶结合活性位于单个结构域内，这一点区别于例如抗 体和单链抗体_抗体和单链抗体中抗原结合活性通常由重链可变区和轻链可变区二者提 供。本文的公开还提供可包含与靶标结合的单结构域多肽的更大的蛋白。例如，可将多个 单结构域多肽连接，以产生亲合力更高或多价的复合分子。而且，可将单结构域多肽搭接到 (例如作为融合蛋白)任何数目的其他多肽上。在某些方面，单结构域多肽可包括分布在至 少两个β折叠片中的至少5-7条β链或类β链，例如免疫球蛋白和免疫球蛋白样结构域。 类β链是一串氨基酸(a string of aminoacids)，它参与单结构域多肽的稳定作用，但并 不一定采取β链构象。关于类β链是否参与蛋白质的稳定作用，可以通过删除该串或者 改变该串的序列，再分析蛋白质稳定性是否降低来加以估计。对于稳定性，可以例如通过热
30变性和复性研究来估计。优选地，单结构域多肽将包括不超过两条类β链。类β链通常 将不采取α螺旋构象，但可采取无规卷曲结构。在免疫球蛋白结构域或免疫球蛋白样结构 域的情况下，类β链最常出现在结构中本应由最靠N末端的β链或最靠C末端的β链占 据的位置。如果某个氨基酸串位于蛋白质序列的内部时通常会形成β链，当其位于更靠近 N末端或C末端的位置时，可采取不明显为β链的构象，在本说明书中称之为类β链。在某些实施方案中，本文的公开提供与VEGFR-2结合的单结构域多肽。优选地，所 述单结构域多肽与人VEGFR-2或模型物种的VEGFR-2结合。单结构域多肽可包括具有如下 结构组织的约80个至约150个氨基酸，所述结构组织包括分布在至少两个β折叠片之间 的至少7条β链或类β链，以及至少一个连接两条β链或类β链的环部分，所述环部分 参与结合VEGFR-2。换言之，环部分可连接两条β链、两条类β链或者连接一条β链与 一条类β链。通常，有一个或多个环部分将参与VEGFR-2结合，但有可能一个或多个β链 或类β链部分也将参与VEGFR-2结合，特别是最靠近环部分的那些β链或类β链部分。 单结构域多肽可包含免疫球蛋白结构域或免疫球蛋白样结构域作为结构单位。单结构域多 肽可与VEGFR-2的任一部分结合，但优选与VEGFR-2胞外域结合的多肽。结合可以用平衡 常数(例如解离常数，Kd)和动力学常数(例如开启速率(on rate)常数，k。n和关闭速率 (offrate)常数，k。ff)来评价。通常将选择单结构域多肽使其与VEGFR-2结合的Kd小于约 1(Γ6Μ，或小于1(Γ7Μ，约5Χ 1(Γ8Μ，约ICT8M或小于约1(T9M。VEGFR-2结合性多肽可与VEGF家 族的一个或两个或更多个成员(特别是VEGF-A、VEGF-C和/或VEGF-D)竞争结合，并可抑 制一种或多种VEGFR-2介导的生物学事件，例如癌细胞增殖和癌症转移。VEGFR-2结合性多 肽可用于治疗学目的，还可用于与VEGFR-2的检测或结合有关的任何目的。用于治疗应用 的多肽通常Kd将小于5X 10_8M、小于10_8M或小于10_9M，但在k。ff足够低或k。n足够高的情 况下可容忍更高的Kd值。在某些实施方案中，所述单结构域多肽包括免疫球蛋白(Ig)可变区。所述Ig可 变区可例如选自下组人\域、人Vh域和骆驼Vhh域。Ig可变域的一个、两个、三个或更多 个环可参与结合VEGFR-2，通常地，称作CDR1、CDR2或CDR3的任一个环将参与VEGFR-2结
口 O在某些实施方案中，所述单结构域多肽包括免疫球蛋白样结构域。所述免疫球蛋 白样结构域的一个、两个、三个或更多个环可参与结合VEGFR-2。优选的免疫球蛋白样结构 域为III型纤连蛋白(Fn3)结构域。所述结构域可包括，按从N末端至C末端的顺序β链 或类β链，A ；环，AB ； β链，B ；环，BC； β链C ；环CD ； β链D ；环DE ； β链F ；环TO ；以及 β链或类β链G。任选地，环AB、BC、CD、DE、EF和TO中任一个或全部可参与VEGFR-2结合，但优选 的环为BC、DE和TO。优选的Fn3结构域为衍生自人纤连蛋白的Fn3结构域，特别是纤连蛋 白的第十个Fn3结构域，称作uiFr^tj应当注意，本说明书中公开的任何VEGFR-2结合性多 肽的氨基酸序列都不与天然wFM相同；所述序列已经过修饰以获得VEGFR-2结合蛋白，但 是，本文中仍然把具有kiFM的基本结构特征的蛋白质，特别是那些保留对天然kiFM可识别 的序列同源性的蛋白质在本说明书中称作“卞113多肽”。该命名法与抗体领域中的某些情 况类似，例如其中针对特定靶蛋白产生的重组抗体\域可能与任何天然存在的\域都不相 同，但是蛋白质可公认为\蛋白。kiFM多肽可与SEQ ID NO 1中显示的人kiFM结构域有
31至少60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%同一性。大部分的变异会在于一个或多个环 中发生。wFM多肽的每条β链或类β链可基本上由与SEQ ID NO 1的相应β链或类β 链的序列有至少80 %、85 %、90 %、95 %或100 %同一性的氨基酸序列组成，只要所述变异 不破坏多肽在生理条件下的稳定性。kiFM多肽可以在环AB、CD和EF中各自具有这样序列， 所述序列基本上由与SEQ IDNO 1的相应环的序列有至少80%、85%、90%、95%或100%同 一性的氨基酸序列构成。在许多情况下，环BC、DE和TO中任一个或全部相对于SEQID NO 1将是低保守的。例如，环BC、DE和FG全部可能与SEQ ID NO 1中它们相应的环具有小于 20%、10%或者0%同一性。在某些实施方案中，本文的公开提供一种可与VEGFR-2结合的非抗体多肽，所述 非抗体多肽包含具有免疫球蛋白样折叠的结构域。所述非抗体多肽分子量可小于20kD，或 小于15kD，通常由参比蛋白或“支架”蛋白(例如Fn3支架)衍生而来(例如通过改变氨基 酸序列)。所述非抗体多肽可以以小于10_6M、或小于10_7M、小于5X 10_8M、小于10_8M或小于 10_9M的Kd结合VEGFR-2。未改变的参比蛋白或者不与VEGFR-2有意义地结合，或者结合的 Kd大于10_6M。所述非抗体多肽可抑制VEGFR-2信号，特别是在非抗体多肽Kd小于5 X 10_8M、 小于10_8M或小于10_9M的情况下，但在k。ff足够低(例如小于5 X ICT4iT1)的情况下可容忍 更高的Kd值。所述免疫球蛋白样折叠可以是kiFM多肽。在某些实施方案中，本文的公开提供一种可结合VEGFR-2的多肽，所述多肽包含 具有免疫球蛋白折叠的单个结构域。所述多肽分子量可小于20kD，或小于15kD，通常由免 疫球蛋白的可变域衍生而来(例如通过改变氨基酸序列)。所述多肽可以以小于10_6M、 或小于10_7M、小于5X 10_8M、小于IO-8M或小于ΙΟ—、的Kd结合VEGFR-2。所述多肽可抑制 VEGFR-2信号，特别是在多肽Kd小于5 X 10_8M、小于ICT8M或小于ICT9M的情况下，但在k。ff足 够低或者k。n足够高的情况下可容忍更高的Kd值。在某些优选实施方案中，具有衍生自免 疫球蛋白轻链可变域的免疫球蛋白折叠且能够与VEGFR-2结合的单结构域多肽可包括选 自下组的氨基酸序列表格中公开的那些氨基酸序列。在一些实施方案中，所述多肽包含与 SEQ NO :1有至少80%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述多肽包含选自SEQID NOs 2-60中的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述多肽进一步包含PEG。在某些优选实施方案中，本文的公开提供VEGFR-2结合性多肽，所述VEGFR-2结合 性多肽包括表格中公开的具有最理想的生物化学特征的任一种氨基酸序列。就包含这样的 氨基酸序列的多肽来说，可使PEG部分或其他感兴趣的部分与约第85-100位(取决于蛋白 质)上的半胱氨酸共价结合。所述PEG部分还可以与多肽中胺部分共价结合。所述胺部分 可以是，例如，出现于多肽N末端的伯氨基或者氨基酸(例如赖氨酸或精氨酸)中存在的氨 基。在某些实施方案中，使PEG部分联结在多肽上选自下组的位置a)N末端；b)N末端与最 靠近N末端的β链或类β链之间；c)位于多肽中与靶结合部位相对的面上的环；d)C末端 和最靠近C末端的β链或类β链之间；以及e) C末端。在某些方面，本文的公开提供了介导VEGFR-2结合的短肽序列。所述序列可以在 分离的形式下，或者在插入特定蛋白质结构中时，介导VEGFR-2结合，所述特定蛋白质结构 例如免疫球蛋白或免疫球蛋白样结构域。这样的序列的例子包括公开的那些序列(例如 SEQ ID NO 2-60)以及其他与SEQID NO 1或所述序列有至少85%、90%或95%同一性且 保留VEGFR-2结合活性的序列。因此，本文的公开提供基本上纯的多肽，其包含与所述序列
32中的任一个有至少85%同一性的氨基酸序列，其中所述多肽与VEGFR-2结合，且与VEGF种 类竞争与VEGFR-2的结合。所述多肽的例子包括一种多肽，其包含与SEQ ID :2_60的氨基 酸序列有至少80%、85%、90%、95%或100%同一性的氨基酸序列。优选地，所述多肽将抑 制VEGF的生物活性，并以小于1(Γ6Μ、或小于1(ΤΜ、小于5Χ1(Γ8Μ、小于ICT8M或小于ICT9M的 Kd 与 VEGFR-2 结合。在某些实施方案中，任一种本说明书中所述的VEGFR-2结合性多肽都可以结合有 一个或多个额外的部分，这样的部分包括，例如也可与VEGFR-2结合的部分(如另一个相 同或不同的VEGFR-2结合性多肽)、可与另一不同靶标结合(例如产生双特异性结合试剂) 的部分、标记部分、有助于蛋白质纯化的部分或者提供改善的药动学的部分。改善的药动学 可根据人们理解的治疗需求来估计。通常，生物利用度的提高和/或给药间隔时间的增加 是理想的，这可能通过增加给药后蛋白质在血清中保持可利用的时间来实现。在某些情况 下，理想的是提高蛋白质的血清浓度随时间的连续性(例如，减少施用后即刻和下一次施 用前即刻的蛋白质血清浓度的差异)。易于减慢蛋白质从血液中的清除的部分包括聚乙二 醇、糖类(如唾液酸)和耐受良好的蛋白质部分(如Fc片段或血清白蛋白)。可使单结构 域多肽与可降低哺乳动物(如小鼠、大鼠或人)体内多肽清除速率的部分联结，该部分相对 于未修饰多肽可降低清除率超过3倍。改善的药动学的其他衡量标准可包括血清半衰期， 血清半衰期通常分成α相和β相。两相中任一相或两相都可通过添加适当的部分而显著 提高。在应用聚乙二醇的情况下，可将一个或多个PEG分子联结在蛋白质中不同位置，所述 联结可通过与胺、硫醇或其他适当的活性基团反应而实现。聚乙二醇化可通过定点聚乙二 醇化实现，在定点聚乙二醇化中，将适当的活性基团引入蛋白质中以产生优先发生聚乙二 醇化的位点。在优选的实施方案中，所述蛋白质经修饰，从而在希望的位置上有半胱氨酸残 基，使得在所述半胱氨酸上进行定点聚乙二醇化成为可能。PEG的分子量可以有很大的差 别，可以是分枝的或直链的。值得注意的是，本文的公开已经证明，聚乙二醇化与kiFM多肽 的靶结合活性是相容的，另外，聚乙二醇化确实可改善这样的多肽的药动学。因此，在一个 实施方案中，本文的公开提供了 kiFM多肽的聚乙二醇化的形式，无论所述多肽可结合何种 靶标。附加的双特异性和多特异性实施方案在许多实施方案中，制备多特异性组合物，例如结合超过一种靶标或其他感兴趣 的蛋白质的组合物。在一个方面，用在本发明方法中的蛋白质包括第一种蛋白质及与其连接或搭接 的第二种蛋白质，所述第一种蛋白质与第一种期望的靶标(如VEGFR-2)的结合亲和力为 约IOnM(其它适当的亲和力在本文中有描述)或更低，而结合不需要的、相关的靶标(如 VEGFR-I和VEGFR-3)的结合亲和力为约1 μ M(其它适当的亲和力在本文中有描述)或更 高，该第一种蛋白质优选为单结构域的或基本上单价的；所述第二种蛋白与第二种期望的 靶标(例如，c-kit、Her-2、FGFR-l、VEGFR-l、VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D、叶酸盐受体、c-Met、 EGFR)的结合亲合力约为IOnM(其它适当的亲和力在本文中有描述)或更低，而结合不需要 的、相关的靶标(如人胰岛素受体)的亲合力为约1 μ M(其它适当的亲和力在本文中有描 述)或更高，该第二种蛋白质优选为单结构域的或基本上单价的。所述有双特异性亲和力 的分子可进一步搭接于其他分子，包括本说明书中所述的其他蛋白质。
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附加的PEG实施方案在治疗方法的一些实施方案中，VEGFR-2特异性抑制剂是基于纤连蛋白的支架，例 如Adnectins ，还进行半胱氨酸或赖氨酸的工程化。PEG(或功能上类似的分子)用于连接两种蛋白质，所述两种蛋白质是结合两个或 多个不同靶标的非抗体部分或所需蛋白质(例如PK调节蛋白)，特别是其中每个结合蛋白 都由单个结构域或多结构域构成的蛋白质，通常其中每个结构域有约50个或约60个或约 75个氨基酸或更多(相对于5-20个氨基酸的小肽)。优选地，基于纤连蛋白的支架，例如 Adnectins ，可在所述实施方案中有利地使用，更优选还进行适当的半胱氨酸或赖氨酸工 程化。另外，VEGFR-2特异性抑制剂的非PEG方面和PEG方面包括抗体部分(例如，骆驼 抗体及其衍生物，以及单链和单结构域抗体；特别是由微生物表达的那些)和类抗体部分 (例如，脂笼蛋白、锚蛋白、多个Cys-Cys结构域和四连蛋白的衍生物；特别是由微生物表达 的)，特别是小于约40kD、由PEG连接的，更特别的是具有少数(limited number of)半胱 氨酸的。PEG连接蛋白具有许多性质和优点。当所述蛋白在微生物中表达时，可能优选的是 把多个结构域分离出来，并通过PEG或其他多聚物接头将它们连接起来。PEG，或其他功能 上可操作的聚合物接头，可用于最优地调整各个蛋白质部分之间的距离，以产生具有以下 一种或多种特性的蛋白质1)当与感兴趣的蛋白质(例如靶标)结合时，减少或增加一个 或多个蛋白质结构域的结合位阻，2)连接两个或多个结合不同靶标的结构域，3)增加蛋白 质稳定性或可溶性，而无需寻找额外的氨基酸取代来增加稳定性或可溶性(例如，至少约 20mg/mL、或至少约50mg/mL的溶解度)，4)减少蛋白质聚集，而无需寻找额外的氨基酸取代 来降低稳定性(例如，依照SEC所测定的)，5)通过增加额外的结合域来增加所述蛋白质对 感兴趣的蛋白质的总亲合力或亲和力。PEG连接蛋白的其它优点包括取决于PEG连接蛋 白中所包括的蛋白质寻靶部分的数目，可迅速地制备单特异性、多价结合形式，以及多特异 性、单价或多价结合形式。可用于本发明方法的kiFM多肽可被聚乙二醇化，并保留配体结合活性。在一个 优选的实施方案中，聚乙二醇kiFM多肽通过定点聚乙二醇化产生，特别是通过将PEG与N 末端或C末端处的半胱氨酸部分偶联而产生。因此，本文的公开提供具有改善的药动学性 质的、靶标结合性的kiFM多肽，所述多肽包括有约80个至约150个氨基酸的kiFM结构 域，其中所述kiFM结构域的至少一个环参与靶标结合；以及共价结合的PEG部分，其中所述 kiFM多肽可以以小于IOOnM的Kd与靶标结合，在哺乳动物中清除速率小于30mL/hr/kg。所 述PEG部分可通过定点聚乙二醇化联结到kiFM多肽，例如通过与半胱氨酸残基联结，其中 所述半胱氨酸残基可位于kiFM多肽的N末端或在N末端和最靠近N末端的β链或类β 链之间，或者位于kiFM多肽的C末端或在C末端和最靠近C末端的β链或类β链之间。 半胱氨酸还可以位于其他位置，特别是任何不参与靶结合的环。PEG部分还可以通过其他化 学作用联结，包括与胺偶联。另外，本发明包括通过这种类型N末端或C末端PEG偶联抗体 部分(例如，骆驼抗体及其衍生物，以及单链和单结构域抗体；特别是由微生物表达的)和 类抗体部分(例如，脂笼蛋白、锚蛋白、多个Cys-Cys结构域和四连蛋白的衍生物；特别是由 微生物表达的)，特别是由PEG连接的小于40kD的，更特别的是具有少数Cys氨基酸的。
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在本发明的一个具体实施方案中，主题可溶多肽的修饰形式包括使主题可溶多肽 连接到非蛋白质性聚合物。在一个具体实施方案中，所述聚合物为聚乙二醇(“PEG”)、聚 丙二醇或聚氧化烯，以美国专利 4，640，835 ；4, 496，689 ；4, 301，144 ；4, 670，417 ；4, 791，192 或4，179，337中所述的方式。本发明修饰的多肽的例子包括本说明书中另外描述的聚乙二
醇化蛋白质。PEG是众所周知的水溶性聚合物，可以商购的或者可根据本领域公知的方法通过 乙二酉享的开环聚合制备(Sandler and Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol. 3，pages 138-161)。术语“PEG”以其广义使用，涵盖任何聚乙二醇分子，无论其 大小或在PEG末端的修饰，可用下式表示X-O (CH2CH2O) ^1CH2CH2OH(I)其中η为20-2300，X为H或末端修饰，例如CV4烷基。在一个实施方案中，本发明 的PEG在一端以羟基或甲氧基终止，即X为H或CH3 (“甲氧基PEG”)。PEG可包含其它结合 反应必需的化学基团；其由分子的化学合成产生；或者其是该分子的各部分具有最佳距离 的间隔物(spacer)。另外，这样的PEG可包括一条或多条被连接在一起的PEG侧链。有超过 一条PEG链的PEG称为多臂PEG或分枝PEG。分枝PEG可例如通过聚氧化乙烯与各种多元 醇加成而制备，所述多元醇包括甘油、季戊四醇(pentaerythritol)和山梨醇。例如，具有 四条臂的分枝PEG可由季戊四醇和环氧乙烷制备。分枝PEG例如在欧洲专利EP-A 0473084 和美国专利5，932，462中有描述。有一种形式的PEG包括两条PEG侧链(PEG2)，它们通过 赖氨酸的伯氨基连接(Monfardini，C. et al. Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69)。在一个优选的实施方案中，聚乙二醇化kiFM多肽通过定点聚乙二醇化，特别是通 过PEG与N末端或C末端半胱氨酸部分偶联而产生。因此，本文的公开提供药动学性质改善 的靶标结合性的kiFM多肽，所述多肽包括有药80个至约150个氨基酸的kiFM结构域，其 中所述wFM结构域的至少一个环参与靶标结合；以及共价结合的PEG部分，其中所述wFM 多肽以小于IOOnM的Kd与靶标结合，在哺乳动物中清除速率小于30mL/hr/kg。所述PEG部 分可通过定点聚乙二醇化联结到kiFM多肽，例如通过与半胱氨酸残基联结，其中所述半胱 氨酸残基可位于kiFM多肽的N末端或在N末端和最靠近N末端的β链或类β链之间，或 者位于kiFM多肽的C末端或在C末端和最靠近C末端的β链或类β链之间。半胱氨酸 还可以位于其他位置，特别是任何不参与靶标结合性的环。PEG部分还可以通过其他化学作 用联结，包括通过与胺偶联。PEG与肽或蛋白质偶联通常包括活化PEG以及活化的PEG-中间体直接与靶蛋 白/肽偶联或与接头偶联，所述接头随后被激活并与靶蛋白/肽偶联(参见Abuchowski， A.et al, J. Biol. Chem. , 252, 3571 (1977) and J. Biol. Chem.，252，3582 (1977)，Zalipsky， et al. and Harris et.al., in :Poly (ethylene glycol)Chemistry :Biotechnical and Biomedical Applications ； (J. M. Harris ed.)PlenumPress :New York,1992 ；Chap. 2land 22)。有人指出，含PEG分子的结合多肽也称为结合蛋白，而没有联结PEG分子的蛋白质可 称为非结合蛋白。可选择PEG的许多种分子量形式，如约1，000道尔顿(Da)至100，OOODa(η为 20-2300)，用于与本发明的结合多肽偶联。PEG中重复单位“η”的数目近似于以道尔顿描述 的分子量。优选的是，活化的接头上PEG的总分子量是适合于药学应用的。因此，在一个实
35施方案中，PEG分子的分子量不超过100，OOODa0例如，如果将3个PEG分子联结到一个接 头上，其中每个PEG分子有相同的12，OOODa的分子量(每个η约为270)，那么接头上PEG 的总分子量约为36，OOODa(总η约为820)。联结到接头的PEG的分子量还可以是不同的， 例如，接头上的3个分子中，有两个PEG分子可各为5，OOODa (η各约为110)，有一个PEG分 子可为12，OOODa (η约为270)。在本发明一个具体的实施方案中，VEGFR-2特异性抑制剂共价连接到一个如下式 所示的聚(乙二醇)基团:-C0-(CH2)x-(0CH2CH2)m-0R，该聚(乙二醇)基团的-CO(即羰基) 与结合多肽(binding polypeptide)的一个氨基形成酰胺键；R为低级烷基；χ为2或3 ;m 为约450至约950 ；选择η和m以使得偶联物减去结合多肽后的分子量为约10-40KD。在一 个实施方案中，结合多肽的赖氨酸的氨基是可利用的(游离的)氨基。以上偶联物可更具体地用式(II)表示=P-NHCO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR(II)，其中 P为本说明书中所述的结合多肽的基团，即没有所述一个或多个氨基与式(II)中所示羰基 形成酰胺键；其中R为低级烷基；X为2或3 ;m为约450至约950，选择m以使得偶联物减 去结合多肽后的分子量为约IOkD至约40kD。如本说明书中使用的，“m”的给定范围具有方 向意义(orientationalmeaning)。在任何情况下，“m”的范围都确切地由PEG基团的分子 量确定。本领域技术人员可选择适当的PEG分子量，例如根据聚乙二醇化结合多肽将如何 在治疗上应用、期望的剂量、循环时间、对蛋白水解的抗性、免疫原性以及其他考虑因素。 关于PEG及其用于增强蛋白质性质的讨论，参见N. V. Katre, Adv. Drug Delivery Rev. 10 91-114(1993)。在本发明的一个实施方案中，可使PEG分子活化，以与结合多肽上的氨基反 应，例如与赖氨酸反应(Bencham C. 0. et al. Anal. Biochem.，131，25 (1983) ；Veronese, F. Μ. et al. Appl. Biochem. ,11,141 (1985). ；Zalipsky, S. et al. Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems, adrs 9-1IOACS Symposium Series469(1999) ；Zalipsky, S. et al. Europ. Polym. J. ,19,1177-1183(1983) ；Delgado, C. et al. Biotechnol. Appl. Biochem. ，12，119-128(1990))。在一个具体的实施方案中，使用PEG的碳酸酯形成PEG-结合多肽偶联物。N， N’-二琥珀酰亚胺碳酸酯(DSC)可用在与PEG的反应中，以形成活性的混合PEG-琥珀酰亚 胺碳酸酯，其随后可与接头的亲核基团或结合多肽的氨基反应(参见美国专利5，281，698 和5，932，462)。在一个相似类型的反应中，1，1’ -( 二苯并三唑基)碳酸酯和二 _(2_吡 啶基)碳酸酯可分别与PEG反应，形成PEG-苯并三唑和PEG-吡啶混合碳酸酯(美国专利 5，382，657)。kiFM多肽的聚乙二醇化可根据现有技术的方法实现，例如通过结合多肽 与亲电性的 PEG (供应商Shearwater Corp.，USA, www, shearwatercoro. com)的反 应。本发明优选的PEG试剂例如为N-羟基琥珀酰亚胺丙酸酯(PEG-SPA)、丁酸酯或 盐(butanoates) (PEG-SBA)、PEG-琥珀酰亚胺丙酸酯或分枝N-羟基琥珀酰亚胺例如 mPEG2-NHS (Monfardini, C.，et al. BioconjugateChem. 6 (1995) 62-69)。所述方法可用于在 结合多肽赖氨酸的ε"氨基或结合多肽的N末端氨基处进行聚乙二醇化。在另一个实施方案中，可将PEG分子偶联至结合多肽上的巯基(Sartore，L.，et
36al. Appl. Biochem. Biotechnol. 27,45(1991) ；Morpurgo et al.Bioconjugate Chem. 7, 363-368(1996) ；Goodson et al. Bio/Technology(1990) 8，343 ;U. S. Pat. No. 5，766，897)。 美国专利6，610，281和5，766，897描述了可偶联至巯基的例示性活性PEG种类。在一些PEG分子偶联到结合多肽上的半胱氨酸残基的实施方案中，所述半胱氨酸 残基对于结合多肽而言是天然的，而在其他实施方案中，一个或多个半胱氨酸残基被工程 化到结合多肽中。可将突变引入结合多肽编码序列中，以产生半胱氨酸残基。这可以通过， 例如，使一个或多个氨基酸残基突变成半胱氨酸来实现。优选突变成半胱氨酸残基的氨基 酸包括丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸和其他亲水性残基。优选地，欲突变成半胱氨酸的残基是暴 露于表面的残基。根据蛋白质的一级序列来预测残基表面的可及性的算法是本领域众所 周知的。或者，由于设计和演变结合多肽的基础框架的晶体结构已经得到了解析(参见 Himanen et al. Nature (2001) 20-27 ；414 (6866) :933_8)，可通过比较结合多肽的氨基酸序 列来预测表面残基，从而鉴定暴露于表面的残基。在一个实施方案中，将半胱氨酸残基引入 到结合多肽的N末端和/或C末端或靠近N末端和/或C末端的地方，或者引入环区内。在一些实施方案中，聚乙二醇化结合多肽包括共价联结到N末端氨基酸α氨基 的PEG分子。位点特异性N末端还原氨基化在P印insky et al. (2001) J. Pharmacol. Exp. Ther. 297，1059，及美国专利5，824，784中有描述。利用PEG-醛和其他可用的亲核氨基进 行的蛋白质还原氨基化在美国专利4，002，531，Wieder et al. (1979) J. Biol. Chem. 254， 12579，以及 Chamow et al. (1994)Bioconjugate Chem. 5，133 中有记载。在另一个实施方案中，聚乙二醇化结合多肽包括一个或多个共价联结于接头的 PEG分子，而所述接头与结合多肽的N末端氨基酸残基的α氨基联结。所述方法在美国专 利申请流水号09/967，223和PCT国际申请公开号WO 94/01451中公开。在一个实施方案中，结合多肽的C末端被聚乙二醇化。在一个具体的实施方案 中，通过在C末端引入叠氮基-甲硫氨酸，随后通过Staudinger反应偶联甲基-PEG-三 芳基膦化合物，将蛋白质的C末端聚乙二醇化。这种C末端偶联方法描述于Cazalis et al.Bioconjugate Chem. 2004 ； 15 (5) :1005_1009。结合多肽的单聚乙二醇化还可以根据PCT国际申请公开号W094/01451中所述的 一般方法制备。WO 94/01451描述了一种制备重组多肽的方法，所述重组多肽带有修饰的末 端氨基酸α碳活性基团。所述方法的步骤包括形成重组多肽并通过在N末端α氨基和C 末端α羧基处以生物学方式添加一个或多个保护基团对其进行保护。然后可将所述多肽 与化学保护剂反应，以选择性保护活性侧链基团，从而防止侧链基团被修饰。接着用特异针 对生物保护基团的剪切试剂剪切所述多肽，以形成无保护的末端氨基酸α碳活性基团。用 化学改性剂修饰所述无保护的末端氨基酸α碳活性基团。然后，对该侧链被保护且末端被 修饰的单拷贝多肽，将其侧链基团脱保护，形成末端被修饰的重组单拷贝多肽。所述方法中 步骤的数目和顺序可变化，以实现选择性地修饰多肽的N末端和/或C末端氨基酸。偶联反应中结合多肽与活化PEG的比值可为约1 0.5至1 50，从约1 1至 1 30之间，或从约1 5至1 15之间。在本方法中可使用多种含水缓冲液以催化PEG 共价添加到结合多肽上。在一个实施方案中，使用的缓冲液PH为约7.0-9.0。在另一个实 施方案中，PH在稍为碱性的范围内，如约7. 5-8. 5。可使用pKa接近于中性pH范围的缓冲 液，例如磷酸盐缓冲液。当制备多特异性PEG连接蛋白时，将使用其他比值，例如约1 4
37至1 8，或约1 3至1 5。本领域公知的常规分离和纯化技术可用于纯化聚乙二醇化结合多肽，例如大小排 阻(如凝胶过滤)和离子交换层析。还可以利用SDS-PAGE分离产物。可被分离的产物包 括单聚乙二醇化、双聚乙二醇化、三聚乙二醇化、多聚乙二醇化和非聚乙二醇化结合多肽， 以及游离的PEG。通过汇集洗脱峰周围较宽的级分以增加组合物中单-PEG的百分比，可以 控制单-PEG偶联物的百分比。约90%单-PEG偶联物表示收率和活性的平衡较好。例如， 其中至少92%或至少96%的偶联物是单-PEG种类的组合物可能是理想的。在本发明的一 个实施方案中，单-PEG偶联物的百分比为90 % -96 %。在一个实施方案中，本发明的PEG化结合多肽包含一个、两个或更多个PEG部分。 在一个实施方案中，所述PEG部分与这样的氨基酸残基结合，所述氨基酸残基在蛋白质的 表面和/或远离接触靶配体的表面。在一个实施方案中，PEG-结合多肽中PEG的组合分子 量或总分子量约为3，000Da-60, OOODa，任选地约为10，000Da-36, OOODa0在一个实施方案 中，聚乙二醇化结合多肽中的PEG基本上是线性、直链PEG。在本发明一个实施方案中，利用羟胺测定，例如450mM羟胺(pH6. 5)于室温处理 8-16小时，聚乙二醇化结合多肽中的PEG不从聚乙二醇化氨基酸残基上被水解下来，因此 是稳定的。在一个实施方案中，组合物中大于80%是稳定的单-PEG结合多肽，更优选至少 90%，最优选至少95%。在另一个实施方案中，本发明的聚乙二醇化结合多肽将优选保留至少约25%、 50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%与未修饰蛋白质相关的生物活性。在一个 实施方案中，生物活性是指其与VEGFR-2结合的能力，用Kd、1^或1^。 评价。在一个具体 的实施方案中，相对于非聚乙二醇化结合多肽，所述聚乙二醇化结合多肽蛋白质显示出与 VEGFR-2的结合增加。相对于未修饰的结合多肽的清除速率，PEG修饰的多肽血清清除速率可减少约 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或甚至90%。相对于未修饰蛋白的半衰期， PEG修饰的多肽的半衰期(t1/2)可增加。相对于未修饰结合多肽的半衰期，PEG-结合多肽 的半衰期可增加至少 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、125%、 150%,175%,200%,250%,300%,400% or 500%或者甚至 1000%。在一些实施方案中， 所述蛋白质半衰期在体外测定，例如在缓冲盐水溶液或在血清中。在其他实施方案中，所述 蛋白质半衰期是体内半衰期，例如该蛋白质在动物血清或其他体液中的半衰期。附加的载体和聚核苷酸实施方案编码本说明书中公开的多种蛋白质或多肽中任一种的核酸可用化学方法合成。 为了提高在细胞中的表达，可进行密码子用法的选择。所述密码子用法将依赖于所选择 的细胞类型。已经为大肠杆菌和其他细菌，以及哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞和昆 虫细胞开发了专用的密码子用法模式。参见例如Mayfield et al. Proc. Natl. Acad. Sci.USA.2003Jan21 ； 100 (2) 438-42 ；Sinclair et al. Protein Expr. Purif. 20020ct ； 26(1) 96-105 ；Connell ND.Curr.Opin. Biotechnol. 20010ct ； 12(5) 446-9 ；Makrides et al. Microbiol Rev. 1996Sep ；60 (3) :512_38 ；以及 Sharp et al. Yeast. 19910ct -J(J) 657-78。核酸操作的常规技术描述于例如Sambrook et al. Molecular Cloning
38ALaboratory Manual, Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press,2ed. ,1989,或 者 F. Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology (GreenPublishing and Wiley-Interscience =New York, 1987)及其定期更新，在此通过提述并入本文。编码多肽 的DNA与来自哺乳动物、病毒或昆虫基因的适当转录或翻译调控元件可操作地连接。所述 调控元件包括转录启动子、可任选的控制转录的操纵基因序列、编码适当的mRNA核糖体结 合部位的序列，以及控制转录和翻译终止的序列。另外包括在宿主中复制的能力(通常由 复制起点赋予)和有利于识别转化子的选择基因。蛋白质不仅可以直接重组产生，而且可以作为与异源多肽或者其他在成熟蛋白或 多肽N末端具有特异性剪切位点的多肽的融合多肽来产生，所述异源多肽优选为信号序 列。所选异源信号序列优选是被宿主细胞识别并加工(即，被信号肽酶剪切)的序列。对 于不识别和加工天然信号序列的原核宿主细胞，所述信号序列由例如选自下组的原核信号 序列代替碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp或耐热肠毒素II前导序列。为了酵母分泌，所述天 然信号序列可例如由酵母转化酶前导序列、因子前导序列(包括酵母属(Saccharomyces) 和克鲁维酵母属(Kluyveromyces) α因子前导序列)或酸性磷酸酶前导序列、白色念珠菌 (C. albicans)葡糖淀粉酶前导序列或者PCT国际申请公开号WO 90/13646中所述的信号序 列所代替。在哺乳动物细胞表达中，可使用哺乳动物信号序列以及病毒的分泌前导序列，例 如单纯疱疹gD信号。可以把这样的前体区的DNA与编码蛋白质的DNA按读码框连接。表达载体和克隆载体都包含使载体能够在一种或多种选定的宿主细胞中复制的 核酸序列。通常，在克隆载体中，该序列是使载体能够不依赖宿主染色体DNA复制的序列， 包括复制起点或自主复制序列。对于许多种细菌、酵母和病毒，这样的序列是众所周知的。 来自质粒PBR322的复制起点适合于多数革兰氏阴性细菌，2微米质粒起点适合于酵母，各 种病毒起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。通 常，哺乳动物表达载体不需要复制起点组件(可能通常会使用SV40起点，仅仅是因为其包 含早期启动子)。表达载体和克隆载体可包含选择基因，也称为选择标记。典型的选择基因编码如 下蛋白质(a)赋予对抗生素或其他毒素(例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素) 的抗性的蛋白，(b)补充营养缺陷型的不足的蛋白，或(c)供给从复合培养基得不到的关键 营养素的蛋白，例如编码芽孢杆菌D-丙氨酸消旋酶的基因。选择方案的一个例子利用药物阻止宿主细胞生长。被异源基因成功转化的那些细 胞产生赋予抗药性的蛋白质，因而在经历选择方案之后还存活。所述优势选择(dominant selection)的例子利用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。另外，衍生自1. 6微米环状质粒pKDl的载体可用来转化克鲁维酵母属酵母。或 者，有人报道了乳克鲁维酵母(K. Iactis)大规模生产重组牛凝乳酶的表达系统(参见Van den Berg, Bio/Technology, 8 135 (1990))。还有人公开了利用克鲁维酵母属工业菌株分泌 成熟的重组人血清白蛋白的稳定的多拷贝表达载体(参见Fleer et al. Bio/Technology, 9 968-975(1991))ο表达载体和克隆载体通常包含被宿主生物体所识别的启动子，其与编码本发明蛋 白质的核酸可操作地连接，所述蛋白质例如基于纤连蛋白的支架，如Adnectins 。适合原 核宿主使用的启动子包括PhoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨
39酸(trp)启动子系统，以及杂合启动子如tac启动子。但其他已知的细菌启动子也是适合 的。用于细菌系统中的启动子还将包含Shine-Dalgarn0(S. D.)序列，其与编码本发明蛋白 质的DNA可操作地连接。真核生物启动子序列是公知的。几乎所有的真核基因都具有富AT区，它位于转录 起始的位点上游约25-30个碱基处。另一种在许多基因的转录起点上游70-80个碱基处发 现的序列为CNCAAT区，其中N可为任一核苷酸。多数真核基因3’端为AATAAA序列，其可 能是向编码序列3’端添加多聚A尾的信号。所有这些序列都适宜地插入真核表达载体中。适合酵母宿主使用的启动序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶， 如烯醇化酶，3-磷酸甘油醛脱氢酶，己糖激酶，丙酮酸脱羧酶，磷酸果糖激酶，6-磷酸葡萄 糖异构酶，3-磷酸甘油酸变位酶，丙酮酸激酶，磷酸丙糖异构酶，磷酸葡糖异构酶和葡糖激 酶的启动子。还有的酵母启动子是诱导型启动子，具有可通过生长条件控制转录的额外优点， 它们是下列酶的启动子区醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢相关的降解 酶、金属硫蛋白、3-磷酸甘油醛脱氢酶，以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶。酵母表达中应 用的合适载体和启动子在欧洲专利EP 73，657中有详述。将酵母增强子与酵母启动子一起 应用也是有利的。哺乳动物宿主细胞中，从载体发生的转录可例如受以下启动子控制从病毒基因 组中获得的启动子，所述病毒如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、 禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、反转录病毒、乙型肝炎病毒，以及最优选的，猴病毒40 (SV40)；来 自异源哺乳动物的启动子如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子，热休克启动子，只要所 述启动子与宿主细胞系统相容。SV40病毒的早期启动子和晚期启动子方便地作为SV40限制性片段获得，该片段 还包含SV40病毒复制起点。人巨细胞病毒的立即早期启动子作为HindIII E限制性片段方 便地获得。美国专利4，419，446中公开了利用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表 达DNA的系统。美国专利4，601, 978中描述了对该系统的修改。还参见Reyes et al. Nature 297 :598-601(1982)，其涉及人β干扰素cDNA在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子控制 下在小鼠细胞中的表达。或者，可使用Rous肉瘤病毒长末端重复序列作为启动子。经常通过向载体中插入增强子序列来增加高等真核生物对编码本发明蛋白质的 DNA的转录。目前已知许多来自哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰 岛素)的增强子序列。但通常将使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括位于复制起点 晚期侧的SV40增强子(bpl00-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、位于复制起点晚期侧 的多瘤病毒增强子以及腺病毒增强子。还参见Yaniv，Nature 297 17-18 (1982)，其涉及用 于真核生物启动子活化的增强元件。可将所述增强子拼接到载体中多价抗体编码序列5’ 或3’侧的位置，但优选位于启动子的5’方向。用在真核生物宿主细胞(如酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其他多细胞生 物体的有核细胞)中的表达载体还将包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。所述序列 通常可从真核生物或病毒的DNA或cDNA的5’非翻译区得到，偶尔从3’非翻译区得到。这 些区域包含转录成在编码多价抗体的mRNA的非翻译部分中多聚腺苷酸化片段的核苷酸区 段。牛生长激素多聚腺苷酸化区是一种有用的转录终止元件(参见PCT国际申请公开号WO
4094/11026及该说明书中公开的表达载体)。重组DNA还可包括可能对纯化蛋白质有用的任何类型的蛋白质标签序列。蛋白 质标签的例子包括但不限于组氨酸标签、FLAG标签、myc标签、HA标签或GST标签。细菌、 真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主使用的适当克隆载体和表达载体可在Cloning Vectors =A Laboratory Manual, (Elsevier,New York, 1985)中找到，其相关公开内容在此通过提述并 入本文。利用适合于宿主细胞的方法将表达构建体导入宿主细胞，这对于本领域技术人员 是显而易见的。许多种将核酸导入宿主细胞的方法是本领域公知的，包括但不限于电穿 孔；用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其他物质转染；微粒轰击；脂质转染；及感染 (其中载体是感染原)。合适的宿主细胞包括原核生物、酵母、哺乳动物细胞或细菌细胞。合适的细菌包括 革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌或芽孢杆菌(Bacillus spp.)。酵母(优选 来自酵母属物种，如酿酒酵母(S. erevisiae))也可以用来制备多肽。还可以应用多种哺乳 动物或昆虫细胞培养系统表达重组蛋白。Luckow和Summers综述了杆状病毒系统在昆虫细 胞中制备异源蛋白(Bi0/Techn0l0gy，6 :47，1988)。合适的哺乳动物宿主细胞系的例子包 括内皮细胞、C0S-7猴肾细胞、CV-1、L细胞、C127、3T3、中国仓鼠卵巢(CHO)、人胚肾细胞、 HeLa.293.293T以及BHK细胞系。通过培养适当的宿主/载体系统来表达重组蛋白从而制 备纯化的多肽。对于许多应用，本说明书中公开的许多小尺寸多肽将使得在大肠杆菌中的 表达成为优选的表达方法。然后从培养基或细胞提取物中纯化蛋白质。附加的表达和细胞实施方案优选用于生产的蛋白质和细胞的实施方案为基于纤连蛋白的支架(例如 Adnectins )及相关蛋白质。本说明书中用于克隆或表达载体中DNA的合适宿主细胞为上文所述的原核 生物、酵母或高等真核生物细胞。为此目的，合适的原核生物包括真细菌如革兰氏阴 性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)诸如大肠杆菌，肠杆菌 属(Enterobacter)，欧文氏菌属(Erwinia)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，变形杆菌属 (Proteus),沙门氏菌属(Salmonella)如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，沙 雷氏菌属如黏质沙雷氏菌(Serratiamarcescans)，和志贺氏菌属(Shigella)，以及芽孢杆 菌如枯草芽孢杆菌(B. subtilis)和地衣芽孢杆菌(B. Iicheniformis)(例如1989年4月 12日出版的DD266，710中公开的地衣芽孢杆菌41P)，假单胞菌属(Pseudomonas)如铜绿假 单胞菌(P. aeruginosa)，以及链霉菌属(Str印tomyces)。一种优选的大肠杆菌克隆宿主为 大肠杆菌294 (ATCC 31，446)，但其他菌株例如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776 (ATCC 31，537) 和大肠杆菌W3110(ATCC 27，325)也是合适的。这些例子用作说明而非限制。除原核生物之外，真核微生物例如丝状真菌或酵母是用于蛋白质编码载体的 适当的克隆或表达宿主。在低等真核宿主微生物中，酿酒酵母，或称普通面包酵母， 是最常使用的。但许多其他属、种和菌株通常可得到并且在本发明中有用，例如粟酒 裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属宿主例如乳克鲁维酵母、脆 壁克鲁维酵母(K. fragilis) (ATCC12, 424)、保加利亚克鲁维酵母(K. bulgaricus) (ATCC 16,045)、K. wickeramii (ATCC 24，178)、K. waltii (ATCC 56，500)、果蠅克鲁维酵
41母(K. drosophilarum) (ATCC 36，906)、耐热克鲁维酵母(K. thermotolerans)和马克思 克鲁维酵母(K. marxianus)；耶氏酵母属(yarrowia) (EP 402, 226)；巴斯德毕赤酵母 (Pichiapastoris) (EP 183,070)；念珠菌属(Candida)；瑞氏木霉(Trichoderma reesia) (EP244, 234)；粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)如西方许 旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；以及丝状真菌例如脉抱霄属(Neurospora)、青 霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)和曲霉属(Aspergillus)宿主如构巢曲霉 (A. nidulans)禾口黑曲霄(A. niger)。用于糖基化的本发明蛋白表达的适当宿主细胞来源于多细胞生物。无脊椎动物细 胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经从例如以下宿主中鉴定了许多杆状病毒毒株和变体以 及相应的许可型昆虫宿主细胞草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊 (Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)。许多转染用病毒毒株是公众可获得的，例 如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(NPV)的L-I变体和家蚕核 型多角体病毒的Bm-5毒株，所述病毒可用作根据本说明书的病毒，特别是用于转染草地贪 夜蛾细胞。在某些情况下，将需要在脊椎动物细胞中制备蛋白质，例如糖基化，脊椎动物细胞 在培养基中(组织培养)增殖已成为常规操作。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子有SV40 转化的猴肾CVl细胞系(C0S-7，ATCC CRL1651)；人胚肾细胞系(经亚克隆可在悬浮培养基 中生长的293细胞或293细胞，Graham et al. J. Gen Virol. 36 59. (1977))；幼仓鼠肾细胞 (BHK，ATCC CCL10)；中华仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA77 4216(1980))；小鼠 Sertoli 细胞(TM4, Mather, Biol. Reprod. 23 243-251 (1980))； 猴肾细胞(CVIATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCCCRL-1587)；人宫颈癌细 胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK, ATCCCCL 34) ；buffalo 大鼠肝细胞(BRL 3A, ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138, ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳 腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51) ；TRI 细胞(Mather et al. Annals N. Y. Acad. Sci. 383 44-68(1982)) ；MRC 5细胞；FS4细胞；人肝细胞瘤细胞系Ofep G2)；以及骨髓瘤或淋巴瘤 细胞(如YO、J558L、P3和NSO细胞)(参见美国专利5，807，715)。棉花、玉米、马铃薯、大豆、牵牛花、西红柿和烟草的植物细胞培养物也可用作宿 主。用本说明书中所述的表达或克隆载体转化宿主细胞从而生产蛋白质，将所述宿主 细胞在经改进的常规营养培养基中培养，所述常规营养培养基适合于诱导启动子、选择转 化子或扩增编码感兴趣的序列的基因。培养细胞用于生产本发明蛋白质的宿主细胞可以在多种培养基中培养。商业上可得到的 培养基，例如 Ham，s FlO(Sigma)、最小必需培养基((MEM)，Sigma)、RPMI-1640 (Sigma)以 及Dulbecco改进的Eagle培养基((DMEM)，Sigma)，适合用于培养宿主细胞。另外，在Ham et al. Meth. Enz. 58 44 (1979)，Barnes etal. Anal. Biochem. 102 255 (1980),美国专利 4，767，704 ；4，657，866 ；4，927，762 ；4，560，655 或 5，122，469 ；公开的 PCT 国际申请公开号 WO 90/03430 ；W087/00195 ；或者美国专利Re. 30, 985中所述的任一种培养基可用作宿主细
42胞的培养基。必要时这些培养基中任一种都可补充激素和/或其他生长因子(如胰岛素、 转铁蛋白或表皮生长因子)，盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)，缓冲液(如HEPES)，核苷酸 (如腺苷和胸苷)，抗生素(如GENTAMYCIN 药物)，痕量元素(定义为通常以终浓度微克 分子范围存在的无机化合物)，以及葡萄糖或等价能源。还可以以合适的浓度包括本领域技 术人员公知的任何其他必要的添加物。培养条件，例如温度、PH等，是先前所选择的宿主细 胞表达使用的条件，对普通技术人员来说将是显而易见的。本说明书中公开的蛋白质还可以利用无细胞翻译系统产生。为此目的，编码多肽 的核酸必须被修饰，以允许体外转录产生mRNA并允许mRNA在所利用的特定无细胞系统 (真核生物例如哺乳动物或酵母的无细胞翻译系统或者原核生物例如细菌的无细胞翻译系 统)中进行无细胞翻译。本发明的蛋白质还可通过化学合成产生(例如用Solid Phase PeptideSynthesis, 2nd ed. , 1984, The Pierce Chemical Co. , Rockford, IL 中描述的方 法)。还可以通过化学合成生成对蛋白质的修饰。可以用蛋白质化学领域中通常公知的蛋白质分离/纯化方法纯化本发明的蛋白 质。非限制实例包括萃取、重结晶、盐析(如用硫酸铵或硫酸钠)、离心、透析、超滤、吸附层 析、离子交换层析、疏水层析、正相层析、反相层析、凝胶过滤、凝胶渗透层析、亲和层析、电 泳、逆流分配法或这些方法的任意组合。纯化后，可用本领域公知的多种方法中任一种将多 肽换至不同缓冲液中和/或浓缩，所述方法包括但不限于过滤和透析。经纯化的多肽优选至少为85%纯，更优选至少95%纯，最优选至少98%纯。不管 纯度的确切数值是多少，所述多肽的纯度足够用作药品。附加的糖基化实施方案在一些实施方案中，可能优选将用于本发明的蛋白糖基化。优选地，这样的蛋白质 为基于纤连蛋白的支架，例如Adnectins 。但Adnectins 通常不包含糖基化位点，可将所 述糖基化位点工程构建到所述蛋白质中。蛋白质的糖基化通常或者是N-连接的或者是0-连接的。N-连接的是指碳水化 合物部分联结到天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨 酸，其中X是除了脯氨酸之外的任何氨基酸，是碳水化合物部分酶促联结到天冬酰胺侧链 的识别序列。可将这些三肽序列工程构建到本发明的蛋白质中，特别是基于纤连蛋白的支 架，例如Adnectins ，以及它们相应的多核苷酸中。因此，这些三肽序列中的任一个在多肽 中的存在都可潜在地产生糖基化位点。0-连接的糖基化是指N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木 糖等糖类中的一种联结到羟基氨基酸，最常见为丝氨酸或苏氨酸，但也可使用5-羟脯氨酸 或5-羟赖氨酸。通过改变本发明的蛋白质的氨基酸序列以使其包含一种或一种上述三肽序列 (对于N-连接糖基化位点)，方便地实现向本发明的蛋白质添加糖基化位点。所述改变还 可通过添加一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基至原始抗体的序列或用一个或多个丝氨酸或 苏氨酸残基加以取代而达到(对于0-连接糖基化位点)。编码本发明蛋白质的此类氨基酸序列变体的核酸分子可利用本领域公知的多种 方法制备。这些方法包括但不限于从天然来源分离(对天然存在的氨基酸序列变体而言) 或者通过对预先制备的蛋白质的变体或非变体形式施加寡核苷酸介导的(或定点的)诱
43变、PCR诱变、以及蛋白质(例如基于纤连蛋白的支架，如Adnectins )的盒式诱变来加以 制备。理想的是，修饰本发明的蛋白质的效应物功能，以实现，例如，增强抗体的抗原依 赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)的目的。这可通过引入 Fc区的活性部分，以及在蛋白质(例如基于纤连蛋白的支架，如Adnectins )的Fc区中引 入一个或多个氨基酸修饰从而产生变体Fc区来实现。所述Fc区变体可包括在一个或多个 氨基酸部位包括一个氨基酸修饰(例如取代)的人Fc区序列(例如人IgGl、IgG2、IgG3或 IgG4Fc 区)。在一个实施方案中，与天然序列Fc区相比，变体Fc区在人效应细胞存在下可更 有效地介导抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)或者以更高的亲合力结合Fcy受体 (Fe y R) ο 所述 Fc 区变体可在 Fc 区的位点 256、290、298、312、326、330、333、334、360、378 或430中任一个或多个位点处包含一个氨基酸修饰，其中Fc区中残基的编号是Kabat中EU 索引的编号。附加的基于抗体的蛋白质，包括部分和衍生物本发明中有用的蛋白质的另外的实施方案包括单结构域抗体、其互补决定区是单 结构域的一部分的多肽(优选针对VEGFR-2)以及包括在本发明PEG连接蛋白中的抗体。实 例包括但不限于重链抗体、天然缺失轻链的抗体、衍生自常规的4链抗体的单结构域抗体、 工程化抗体和除衍生自抗体的那些之外的单结构域支架。单结构域抗体可以是现有技术中 的任何抗体，或任何未来的单结构域抗体。单结构域抗体可来自于任何物种，包括但不限于 小鼠、人、骆驼、骆马、山羊、兔、牛。根据本发明的一个方面，本说明书中使用的单结构域抗 体为天然存在的单结构域抗体，称为缺失轻链的重链抗体。这样的单结构域抗体例如在PCT 国际申请公开号WO 94/04678中公开。为清晰起见，这种从天然缺失轻链的重链抗体衍生 的可变域在本说明书中称为Vhh或纳米抗体(nanobody)，以使其与4链免疫球蛋白的常规Vh 相区别。所述Vhh分子可来源于在骆驼科(Camelidae)物种中产生的抗体，所述骆驼科物种 例如路马它(camel)、单峰骆驼(dromedary)、骆马(llama)、小羊驼(vicuna)、羊驼(alpaca) 和大羊驼(guanaco)。除骆驼科之外还有其他物种可产生天然缺失轻链的重链抗体；这样 的Vhh在本发明的范围内。根据本发明，且本领域技术人员公知，Vhh是来自于天然缺失轻链的免疫球蛋白的 重链可变区，例如在PCT国际申请号WO 94/04678中所述的来自于骆驼科的(以下称之为 Vffl域或纳米抗体)。Vra分子约比IgG分子小10倍。它们是单一的多肽，而且很稳定，耐得 住极端PH和温度条件。此外，它们对蛋白酶的作用有抵抗力，这是常规抗体不具备的。此 外，Vhh体外表达产生高收率、正确折叠的、有功能的V,另外，与通过应用抗体文库而在体 外产生的抗体或通过免疫哺乳动物(除骆驼科外)产生的抗体所识别的表位相比，在骆驼 科动物中产生的抗体将识别不同的表位(参见PCT国际申请公开号WO 9749805)。因此， 与常规抗体相比，抗VEGFR-2Vhh可与VEGFR-2更有效地相互作用，从而更有效地阻断其与 VEGFR配体的相互作用。由于已知Vhh可结合到“不寻常的(unusual)，，表位例如腔或沟中 (参见PCT国际申请公开号WO 97/49805)，所以所述Vhh的亲和力可能更适合于治疗处理。在本发明方法中有用的VEGFR-2特异性抑制剂另一个例子是由这样的序列组成 的抗VEGFR-2，该序列相应于针对VEGFR-2或其近缘的家族成员的骆驼科Vra序列。本发明
44还涉及所述多肽的同源序列、功能性部分、或同源序列的功能性部分。本发明还涉及能够编 码所述多肽的核酸。本发明的单结构域抗体可针对VEGFR-2或其近缘的家族成员。用在本发明方法中的多肽构建体可以进一步包括针对其他靶标(例如血清白蛋 白)的单结构域抗体。针对靶标的单结构域抗体指的是能够以好于IiT6M的亲和力与所述 靶标结合的单结构域抗体。本发明进一步涉及Vhh单结构域抗体的应用，所述Vhh单结构域抗体属于具有人源 样序列(human-like sequences)的类别。一个这样的类别具有这样的特征Vra在45位带 有选自下组的氨基酸甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨 酸、色氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺，例如L45 ；且在103位具有色 氨酸，其中位置根据Kabat编号法。由此，属于该类别的多肽与AVh框架区显示较高的氨 基酸序列同源性，所述多肽可以直接向人施用，预期不会导致不良的免疫应答，且无需进一 步人源化。另一人源样类别的骆驼科单结构域抗体已在PCT国际申请号W003/035694中描 述，它们包含通常在人源或来自其他物种的常规抗体中发现的疏水性FR2 (框架2)残基，但 通过以103位荷电的精氨酸残基取代双链抗体来源的Vh中存在的保守色氨酸残基而补偿 该亲水性损失。因此，属于这两个类别的肽显示出与人Vh框架区有较高的氨基酸同源性， 所述多肽可以直接向人施用，不会导致不良的免疫应答，且无需进一步人源化。本发明还涉 及能够编码所述多肽的核酸。多肽可包括全长骆驼科抗体，即Fc和Vhh域。抗-白蛋白Vra可以更高效地与血清白蛋白——一种已知的载体蛋白——相互作 用。作为载体蛋白，血清白蛋白的一些表位可能由于结合着蛋白、肽和小的化合物而无法达 到。由于已知Vra可结合到“不寻常的(unusual)”或非常规的表位例如腔(参见PCT国际 申请公开号WO 97/49805)，所以所述Vhh对循环中的白蛋白的亲和力可能更适合于治疗处 理。所述血清蛋白可以是在受试者血清中发现的任何合适的蛋白质，或其片段。在本发明 的一个方面，所述血清蛋白为血清白蛋白、血清免疫球蛋白、甲状腺素结合蛋白、转铁蛋白 或纤维蛋白原。取决于预期的应用，例如有效治疗感兴趣的半衰期和/或靶抗原的区隔化 (compartmentalization)，Vhh-伴侣可针对至上述血清蛋白之一。“抗体片段(antibody fragments) ”仅包括完整抗体的一部分，通常包括完整抗 体的抗原结合部位，因此保留结合抗原的能力。本定义包含的抗体片段的例子包括(i) Fab片段，具有\、CL, Vh和CHl域；(ii)Fab'片段，其是在CHl域的C末端具有一个或多 个半胱氨酸残基的Fab片段；(iii)具有Vh和CHl域的Fd片段；(iv)具有Vh和CHl域并 且在CHl域的C末端具有一个或多个半胱氨酸残基的Fd’片段；(ν)具有抗体单臂的\和 Vh 域的 Fv 片段；(vi)包含 Vh 域的 dAb 片段(Ward et al. Nature 341,544-546(1989))； (vii)分离的⑶R区；(viii)F(ab’)2片段，为包含两个Fab’片段的二价片段，通过铰 链区的二硫桥连接；(ix)单链抗体分子(如单链Fv ;scFv) (Bird et al. Science 242 423-426(1988)；和 Huston et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA85 5879-5883 (1988)) ； (χ)有 两个抗原结合部位的“双抗体(diabodies)”，包括重链可变区(Vh)连接到同一多肽链中的 轻链可变区(Vl)(参见例如欧洲专利EP 404，097 ；PCT国际申请公开号WO 93/11161 ；和 Hollinger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 6444-6448 (1993)) ；(xi)包括一对串联
45Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)的“线性抗体(linear antibodies) ”，其与互补的轻链多肽一起 形成一对抗原结合区(Zapata et al. Protein Eng. 8(10) 1057-1062 (1995)；及美国专利 5，641，870)。已开发了多种技术用于生产抗体片段，可将其用于制备本发明中使用的抗体 片段。传统上，这些片段通过完整抗体的蛋白水解消化而得到(参见例如Morimoto et al.J.Biochem. Bioph. Methods 24 107-117(1992)；禾口 Brennan et al. Science,229 81(1985))。但是，现在这些片段可以直接利用重组宿主细胞产生。例如，所述抗体片段可 从以上讨论的抗体噬菌体文库中分离。或者，Fab’-SH片段可直接从大肠杆菌中回收，并以 化学方法偶联以形成 F(ab，)2 片段(Carter et al. Bio/Technology 10:163-167(1992))。 根据另一种方法，F(ab’)2片段可直接从重组宿主细胞培养物中分离。其他制备抗体片段 的技术对技术人员将是显而易见的。在其他实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv) (参见PCT国际申请公开号WO 93/16185以及美国专利5，571，894和5，587，458)。所述抗 体片段还可以是“线性抗体”，例如美国专利5，641，870中所描述的。所述线性抗体片段可 为单一特异性的或双特异性的。可供选择的革巴向性蛋白治疗法(targeted protein therapeutics)在某些实施方案中，可用于本说明书中描述的本发明方法中的蛋白质可包括一 个或多个avimer序列。avimers是一类结合蛋白，对多种靶分子有亲和力和特异性，包 括本说明书中所述的那些靶分子。这些蛋白质可以包括在本发明的PEG连接的实施方案 中。它们是从人胞外受体结构域出发，通过体外外显子改组和噬菌体展示而产生的(参见 Silverman et al. 2005，Nat. Biotechnol. 23 1493-94 ；禾口 Silverman et al. 2006，Nat. Biotechnol. 24 220)。由此产生的多结构域蛋白可包括多个独立的结合域，与单表位结合 蛋白相比，其可显示出更好的亲和力(在某些情况下为亚纳摩尔级)和特异性。在许多实 施方案中，avimers可例如与PEG或多肽接头联结。关于avimers的构建方法和应用的更 多细节例如在美国专利申请流水号10/693，057,10/693, 056,10/840, 723,10/871, 602和 10/966，064中公开，本文援引并入其中每一件专利申请的实施例部分以及整个文档。在某些实施方案中，本说明书中描述的用在本发明方法中的蛋白质可包括一个或 多个脂笼蛋白相关的序列，例如anticalins或脂笼蛋白衍生物。anticalins或脂笼蛋白衍 生物是一类结合蛋白，对多种靶分子有亲和力和特异性，包括本说明书中所述的那些靶分 子。所述蛋白质描述于美国专利申请流水号11/224，071-Anticalins，美国专利申请流水 号 10/490，953— "Muteinsof human neutrophil gelatinase-associated lipocalin and related proteins”，美国专利申请流水号 10/491, 001- "Muteins of apolipoprotein d” 以及PCT国际申请公开号WO 06/056464中。这些蛋白质可以包括在本发明的PEG连接的 实施方案中。在某些实施方案中，可用于本说明书中描述的本发明方法中的蛋白质可包括一个 或多个四连蛋白C型凝集素相关序列或三连蛋白(trinectins)，例如四连蛋白C型凝集素 或四连蛋白C型凝集素衍生物。四连蛋白C型凝集素或四连蛋白C型凝集素衍生物是一类 结合蛋白，对多种靶分子有亲和力和特异性，包括本说明书中所述的那些靶分子。不同的四 连蛋白C型凝集素和相关蛋白质描述于PCT国际申请公开号WO 06/053568 ；W005/080418 ； WO 04/094478 ；WO 04/039841 ；WO 04/005335 ；WO 02/048189 ；和 WO 98/056906，以及美国
46专利申请流水号11/064，115。这些可以包括在蛋白质本发明的PEG连接的实施方案中。与本发明蛋白质连接的毒素和其他分子可用于本说明书中公开的本发明方法中的蛋白质可与细胞毒剂连接。所述实施方 案可酌情用体内或体外方法制备。体外方法包括本领域众所周知的偶联化学，包括与蛋白质相容的化学，例如对特 定氨基酸(如半胱氨酸和赖氨酸)的化学。为了使细胞毒剂连接到本发明的蛋白质上，利 用连接基团或活性基团。合适的连接基团是本领域众所周知的，包括二硫化物基团、硫醚 基团、酸敏感基团、光敏感基团、肽酶敏感基团和酯酶敏感基团。优选的连接基团是二硫化 物基团和硫醚基团。例如，可以利用二硫化物交换反应，或通过在抗体和细胞毒剂之间形 成硫醚键，来构建偶联物。优选的细胞毒剂是美登素类化合物(maytansinoids)、紫杉烷和 CC-1065类似物。体内方法包括使毒性蛋白、标记蛋白或标签蛋白连接到本发明的蛋白质上作为融 合蛋白。利用编码感兴趣多肽的多核苷酸来产生单个多肽。对于毒性蛋白，可通过在毒素 抗性或不敏感细胞中表达来加以控制，或者用敏感细胞中的诱导型启动子来进行控制。尽管并非限制，但在各实施方案中，可使本发明的蛋白质连接到以下蛋白质，例如 细菌毒素、植物毒素、篦麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶(RNase)、DNA酶I、蛋白酶、葡 萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、白树毒素(gelonin)、白喉毒素、假单胞菌外毒素、 假单胞杆菌内毒素、豹蛙酶(Ranpirnase) (Rap)、Rap (N69Q)、酶或荧光蛋白。美登素类化合物和美登素类化合物类似物属于优选的细胞毒剂。合适的美登素 类化合物的例子包括美登醇(maytansinol)和美登醇类似物。合适的美登素类化合物 公开于美国专利 4，424，219 ；4，256，746 ；4，294，757 ；4，307，016 ；4，313，946 ；4，315，929 ； 4，331，598 ；4，361，650 ；4，362，663 ；4，364，866 ；4，450，254 ；4，322，348 ；4，371，533 ； 6，333，410 ；5，475，092 ；5，585，499 ；和 5，846，545。紫杉烷也是优选的细胞毒剂。适合用在本发明中的紫杉烷在美国专利6，372，738 和6，340，701中公开。CC-1065及其类似物也是优选用在本发明中的细胞毒剂。CC-1065及其类似物在 美国专利 6，372，738 ；6，340，701 ；5，846，545 和 5，585，499 中公开。一种用于制备所述细胞毒性偶联物的引人注意的候选物为CC-1065，其是从泽耳 链霉菌(Str印tomyces zelensis)的培养基肉汤中分离的有效的抗肿瘤抗生素。在体外 CC-1065比通常使用的抗癌药更有效约1000倍，所述通常使用的抗癌药例如多柔比星、甲 氨蝶呤和长春新碱(B. K. Bhuyan et al. Cancer Res.，42，3532-3537 (1982))。细胞毒类药例如甲氨蝶呤、柔红霉素、多柔比星、长春新碱、长春碱、美法仑、丝裂 霉素C、苯丁酸氮芥和加利车霉素也适合于制备本发明的偶联物，所述药物分子也可通过中 间载体分子(如血清白蛋白)与抗体分子连接。偶联可以应用本领域公知的任一方法使蛋白质与可检测部分偶联，所述方法包括 由 Hunter, et al. Naturel44 945(1962) ；David, et al. Biochemistryl3 1014(1974)； Pain, et al. J. Immunol. Meth. 40 219 (1981)；禾口 Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30 407(1982)所描述的那些方法。
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体外方法包括本领域众所周知的偶联化学，包括与蛋白质相容的化学作用，例如 对特定氨基酸(如半胱氨酸和赖氨酸)的化学作用。为了使部分(例如PEG)与本发明的 蛋白质连接，使用连接基团或活性基团。合适的连接基团是本领域众所周知的，包括二硫化 物基团、硫醚基团、对酸敏感基团、对光敏感基团、对肽酶敏感基团和对酯酶敏感基团。根据 实际应用，优选的连接基团是二硫基团和硫醚基团。对于基于纤连蛋白的支架，如Adnectins ，或其他没有半胱氨酸的蛋白质，可将半 胱氨酸工程化到一定的位置，以便在创建偶联部位时蛋白质的活性存在。配制和施用通过使所述具有感兴趣的纯度的蛋白质与可任选的生理学可接受载体、赋形剂 或稳定剂混合(Remington’ s Pharmaceutical Sciences 16th edition，Osol，A. Ed. (1980))，以水溶液、冻干配方或其他干燥配方的形式，制备本发明的治疗配方用于贮存。可 接受的载体、赋形剂或稳定剂在所应用的剂量和浓度下对接受者无毒，包括缓冲液如磷酸 盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂包括维生素C和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基 二甲基苄基(octadecyldimethylbenzyl)氯化铵；氯己双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、 丁醇或苯甲醇；烷基对羟苯甲酸类如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚； 间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及m-甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质 如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、 谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物包括葡萄糖、 甘露糖或右旋糖酐；螯合剂如EDTA ；糖类如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；形成盐的抗衡 离子如钠；金属络合物(如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂如TWEEN 、 PLUR0NICS 或聚乙二醇(PEG)。必要时对于要治疗的特殊适应症，本说明书中的配制剂还可包含超过一种活性化 合物，优选具有互补活性而彼此之间无不利影响的那些活性化合物。本说明书中提供了活 性化合物的组合的实例。所述分子以对预期目的有效的剂量适当地联合存在。在胶体给药系统(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳、纳米颗粒和纳米囊)或粗乳 状液中，所述活性成分还可以被分别包封到微囊中。微囊例如通过凝聚技术或通过界面聚 合法制备的微囊，如羟甲基纤维素或明胶-微囊和聚_(甲基丙烯酸甲酯)微囊。所述技术 在 Remington’ s Pharmaceutical Sciencesl6th edition, Osol, A. Ed. (1980)中公幵。体内给药使用的配制剂必须是无菌的。这通过无菌过滤膜过滤很容易实现。可以制备缓释制剂。缓释制剂合适的例子包括包含本发明蛋白质的固体疏水性聚 合物的半渗透性基质，该基质为定型产品的形式，例如薄膜或微囊。缓释基质的例子包括多 元酯，水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))，多乳酸化合物(美国 专利3，773，919)，L-谷氨酸和、乙基-L-谷氨酸盐的共聚物，非降解性乙烯醋酸乙烯酯， 可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物如LUPRON DEPOT (由乳酸-羟基乙酸共聚物和醋酸亮丙 瑞林组成的可注射微球)，以及聚-D- (-) -3-羟丁酸。聚合物如乙烯醋酸乙烯酯和乳酸-羟 基乙酸能够实现超过100天分子释放，而某些水凝胶释放蛋白质的时间短一些。当本发明 的包封蛋白质在体内保留较长时间时，它们可能因为37°C暴露于湿气中而变性或聚集，导 致生物活性丧失并且免疫原性可能改变。可根据有关机制针对稳定性设计合理的策略。例 如，如果发现聚集机制是通过硫代_ 二硫化物互换的分子间S-S键形成的，则可通过修饰巯
48基残基、从酸性溶液冻干、控制湿度、使用适当的添加剂和开发特异的聚合物基质组合物从 而获得稳定性。虽然技术人员将理解，各治疗剂的剂量将取决于药剂本身，但优选的剂量范围可 为约10mg/m2至约2000mg/m2，更优选50mg/m2至约1000mg/m2。对于优选的试剂如钼剂(卡 钼、奥沙利钼、顺钼)优选的剂量为约10mg/m2至约400mg/m2，对于紫杉烷(紫杉醇、多西他 赛)优选的剂量为约20mg/m2至约150mg/m2，对于吉西他滨优选的剂量为约100mg/m2至约 2000mg/m2，对于喜树碱优选的剂量为约50mg/m2至约350mg/m2。这种治疗剂及其他治疗剂 的剂量可取决于本发明的抗体、抗体片段或偶联物是与治疗剂同时施用还是相继施用。VEGFR-2特异性抑制剂以药学可接受药物剂型向受试者施用。它们可以静脉内 施用(推注，或者通过连续输注一段时间施用)，通过肌内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、眼 内、口服、局部或吸入途径施用。所述蛋白质还可以通过瘤内、肿瘤旁、病灶内或病灶周围 途径施用，以发挥局部以及全身疗效。合适的药学可接受载体、稀释剂和赋形剂是众所周知 的，可由本领域技术人员视临床情况需要确定。合适的载体、稀释剂和/或赋形剂的例子 包括(I)Dulbecco磷酸缓冲盐溶液，pH约7. 4，包含约lmg/mL至25mg/mL人血清白蛋白， (2)0. 9%盐水(0.9%w/v NaCl)，以及(3)5% (w/v)葡萄糖。本发明的方法可体外、体内或 离体实施。配制剂的实例包括5-100mM乙酸钠、甘露醇或类似的赋形剂(如山梨醇)，浓度 从50mM至且包括高渗浓度，任选地氯化钠浓度从O至约200mM，pH约4至约7. 5。在一个 实施方案中，所述配方包括约IOmM乙酸钠、约IOOmM氯化钠和约IlOmM甘露醇，pH约4. 5。 在另一个实施方案中，所述配制剂包括IOmM乙酸钠和IOOmM甘露醇，pH约4. 5至约6。抑 制剂在配制剂中的浓度可以是l_15mg/mL。在一个实施方案中，蛋白质的浓度为约9mg/mL 至约llmg/mL。VEGFR-2特异性抑制剂，及一种或多种其它治疗剂的施用，不管是同时施用 还是相继施用，都可如上所述进行。技术人员将理解，同时施用的合适的药学可接受载体、 稀释剂和赋形剂取决于同时施用的特定治疗剂本身。当以含水剂型而不是冻干剂型存在时，所述蛋白质通常可以以约0. lmg/mL至约 lOOmg/mL的浓度配制，但在这些范围之外较大变动也是允许的。对于疾病治疗，抗体或偶联 物的适当剂量将取决于以上确定的要治疗的疾病类型、疾病的严重性和病程、抗体施用是 为了预防目的还是治疗目的、先前治疗的过程、患者的临床病史和对抗体的反应，以及主治 医师的判断。蛋白质视情况一次性或者经一系列治疗向患者施用。取决于疾病的类型和严重性，优选约lmg/m2至约2000mg/m2蛋白质为向患者施用 的起始候选剂量，更优选例如约10mg/m2至约lOOOmg/m2抗体，不管例如是通过一次或多次 单独施用还是通过连续输注。对于重复施用数天或更长，根据情况重复治疗直到产生理想 的疾病症状抑制。但其他给药方案也可能是有用的，并不排除在外。本发明还包括在治疗患有或有转移癌发病风险的患者中有用的试剂盒，其包括本 说明书中所述的一种或多种成分以及应用这些成分的说明书。在优选的实施方案中，本发 明的试剂盒包括VEGFR-2特异性抑制剂和抗肿瘤组合物。用在试剂盒中的抗肿瘤组合物 可包含如本说明书中先前描述的任何合适的化疗剂，用于如本说明书中先前描述的任何癌 症。提供试剂盒时，组合物的不同成分可包装在单独的容器中，即将使用前混合。所述 成分单独地包装可允许长期贮存，而不丧失活性成分的功能。
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试剂盒中包括的试剂可在任何种类的容器中提供，以便于不同成分的寿命得以保 持，而不被容器材料吸附或改变。例如，密封玻璃安瓿可盛放冻干的治疗剂或者已包装在中 性非活性气体(例如氮气)中的缓冲剂。安瓿可由任何适当的材料构成，例如玻璃，有机聚 合物如聚碳酸酯、聚苯乙烯等、陶瓷、金属或通常用于容纳类似试剂的任何其他材料。合适 的容器其他例子包括可由如安瓿类似的物质制造的简单瓶子，以及可能包含衬箔内面(例 如铝或合金)的包封。其他容器包括试管、管形瓶、细颈瓶、瓶子、IV袋、注射器等。容器可 以有无菌进入口，例如带有可用皮下注射针穿透的塞子的瓶子。其他容器可以有两个隔室， 隔室由可容易移去的膜隔开，一旦移去所述膜，将使成分得以混合。可移去的膜可以是玻 璃、塑料、橡胶等。试剂盒还可提供说明材料。说明书可印刷在纸或其他物质上，和/或可以以电子 可读介质提供，所述电子可读介质例如软盘、⑶_R0M、DVD-R0M、Zip光盘、录像带、录音磁带、 闪存设备等。详细的说明书可能不是在物理上与试剂盒一起提供的，而是在用户可直接访 问试剂盒的厂商或经销商指定的互联网站点上提供，或者以电子邮件提供。本领域技术人员可容易地确定在本说明书所述方法中施用的细胞毒剂或治疗剂 的剂量。当确定适当的剂量时，还可参考药物的药品说明书。举例来说，以下药品的说明书 可在下列万维网上获得且通过提述并入Sutentm :pfizer. com/pfizer/download/news/asco/sutent—fact—sheet, pdf ；Nexavar :univgraph. com/bayer/inserts/nexavar. pdf ；贝伐单抗(bevacizumab) :gene. com/gene/products/information/oncology/ bevacizumab/insert.jsp ；曲妥珠单抗(trastuzumab) :gene. com/gene/products/information/oncology/ herceptin/index, jsp ；吉西他滨(gemcitabine) :pi. lilly. com/us/gemzar. pdf ；替莫唑胺(temozolomide):fda. gov/cder/foi/label/1999/210291bl. pdf ；Gleevac :accessdata. fda. gov/scripts/cder/onctools/labels. cfm ？ GN = imatinib% 20mesylate ；紫杉酉享(paclitaxel) :accessdata. fda. gov/scripts/cder/onctools/labels. cfm ？ GN = paclitaxel ；多西他赛(doxetaxel) :http:// www. accessdata. fda. gov/scripts/cder/ onctools/labels. cfm ？ GN = docetaxel ；附加的专利文献以下附加的专利申请及专利中描述的方法和组合物也包括在本文的公开中 美国专禾Ij 申请流水号 10/897, 406 ；10/735, 916 ； 10/886，838 ； 10/800，197 ； 10/363，552 ； 10/309，722 ；11/259，232 ；11/154，103 ；10/553，105 ；10/650，592 ；10/650，591 ； 10/792，498 ；10/676，873 ；10/728，078 ；10/989，723 ；11/483，918 ；11/448，171 ；禾口 11/482,641 ；美国专利 5，707,632 ；6，818，418 ；和 7，115，396 ；以及 PCT 国际申请公开 号 W 05/085430 ；WO 04/019878 ；WO 04/029224 ；WO 05/056764；WO 01/064942 ；和 WO 02/032925。以提述方式并入
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本说明书中所述的所有文档和文献，包括专利文献和网站，都分别以提述的方式 并入本文档，达到与在本文档中全部或部分载明相同的程度。现在参照以下实施例描述本发明，所述实施例仅用作说明而并非意欲限制本发 明。尽管已经详细地并参考本发明的具体实施方案描述了本发明，但对于本领域技术人员 来说将显然可对本发明进行各种变化和修饰而不背离本发明的精神和范围。实施例实施例1在肿瘤转移的原位(orthotopic)模型中，Comp-I显著地比贝伐单抗更有活性。在 第O天将人MDA-MB-231乳腺癌细胞植入小鼠乳腺脂肪垫中(1 X 106MDA_MB_231乳腺癌细 胞)。在第24天切除产生的肿瘤，4天后开始治疗(切除时平均肿瘤体积为400mm3)。治疗 组如下对照:PBS, Comp-I :30mg/kg,贝伐单抗5mg/kg(100 μ L IP注射，每周两次)。处死 小鼠时，评估了局部再生(regrowth)的程度和肺转移灶的数目。与贝伐单抗相比，Comp-I 在每只小鼠中产生的肉眼可见转移灶更少。此外，在研究中Comp-I对转移的发生率有显著 影响。与74%贝伐单抗治疗的动物和84%对照组相比，仅有30% Comp-I治疗的小鼠显示 出了肺转移(见图1)。序列表SEQ ID NO 1为人III型纤连蛋白结构域的第十模块。SEQ ID NO 2~60 为 VEGFR-2 结合性 lclFn3 多肽。SEQ ID NO 61为适合于聚乙二醇化的C末端尾。SEQ ID NO :62_65为片段，具体为人III型纤连蛋白结构域的第十模块的环结构。
5权利要求
一种治疗、预防或降低转移癌的播散的方法，所述方法包括向有需要的患者施以治疗性VEGFR-2特异性抑制剂。
2.权利要求1的方法，其中所述患者患有乳腺癌。
3.权利要求1的方法，其中所述VEGFR-2特异性抑制剂包含与人VEGFR-2结合的第一 种多肽，所述多肽包含具有如下结构组织的约80个至约150个氨基酸，所述结构组织包括 a)分布在至少两个β-折叠片中的至少5-7个β链或类β链，以及b)至少一个连接两条 链的环部分，所述两条链是β链或类β链，所述环部分参与对VEGFR-2的结合，其中所述 多肽以小于1x10_6M的解离常数(Kd)结合人VEGFR-2蛋白的胞外区，并抑制VEGFR-2介导 的血管发生。
4.权利要求3的方法，其中所述多肽包含与SEQNO :1具有至少80%同一性的氨基酸 序列。
5.权利要求3的方法，其中所述多肽包含选自SEQID NO 2-60中的任意氨基酸序列。
6.权利要求3的方法，其中所述多肽进一步包括聚氧化烯部分。
7.权利要求6的方法，其中所述聚氧化烯部分为聚乙二醇(PEG)部分。
8.权利要求1的方法，进一步包括施用第二种化疗剂。
9.权利要求8的方法，其中所述第二种试剂为苹果酸舒尼替尼。
10.权利要求8的方法，其中所述第二种试剂为拉帕替尼。
11.权利要求8的方法，其中所述第二种试剂为索拉非尼。
12.权利要求8的方法，其中所述第二种试剂为AZD2171。
13.权利要求8的方法，其中所述第二种试剂为贝伐单抗。
14.权利要求8的方法，其中所述第二种试剂为阿柏西普。
15.权利要求8的方法，其中所述第二种试剂为mTor抑制剂。
16.权利要求15的方法，其中所述mTor抑制剂为雷帕霉素。
17.权利要求8的方法，其中所述第二种试剂为吉西他滨。
18.权利要求8的方法，其中所述第二种试剂为替莫唑胺。
19.权利要求8的方法，其中所述第二种试剂为达沙替尼。
20.权利要求8的方法，其中所述第二种试剂为西妥昔单抗。
21.权利要求8的方法，其中所述第二种试剂为temsirolimus。
22.权利要求8的方法，其中所述第二种试剂为伊沙匹隆。
23.权利要求8的方法，其中所述第二种试剂为甲磺酸伊马替尼。
24.权利要求8的方法，其中所述第二种试剂为曲妥珠单抗。
25.权利要求8的方法，其中所述第二种试剂为紫杉烷。
26.权利要求8的方法，其中所述第二种试剂为奥沙利钼。
27.权利要求8的方法，其中所述第二种试剂为5-氟尿嘧啶。
28.权利要求3的方法，其中所述VEGFR-2特异性抑制剂进一步包含第二种多肽，所述 多肽包含与SEQ NO 1具有至少80%同一性的氨基酸序列。
全文摘要
本申请提供治疗转移癌的组合物及方法。有转移瘤或有发展成转移瘤风险的患者可得到治疗。用于本发明的组合物包括VEGFR-2特异性抑制剂。
文档编号A61P35/04GK101883578SQ200880110085
公开日2010年11月10日 申请日期2008年8月20日 优先权日2007年8月20日
发明者罗尼·马姆卢克 申请人:百时美施贵宝公司