一种同时检测食品中多种植物生长调节剂的方法
【专利摘要】本发明公开了一种同时检测食品中多种植物生长调节剂的方法。该方法利用稳定性同位素稀释技术，采用改进的QuEChERS前处理方法，建立了超高效液相色谱质谱联用法对植物源性食品中常用的19种植物生长调节剂残留同时快速定性、精准定量的高通量检测技术，为植物源性食品中植物生长调节剂残留的风险评估提供技术支撑，为食品安全突发公共卫生事件的处置提供科学的检测方法。
【专利说明】
一种同时检测食品中多种植物生长调节剂的方法
技术领域
[0001] 本发明属于食品安全检测技术领域，是食品安全标准制定与食品安全风险监测领 域的重要内容。本发明具体涉及一种同时检测食品中多种植物生长调节剂的方法。
【背景技术】
[0002] 植物生长调节剂是指人工合成(或从微生物中提取）的，由外部施用于植物，可以 调节植物生长发育的一类农药。按功能分为生长素类、赤霉素类、细胞分裂类、催熟剂类和 生长抑制剂类等。植物生长调节剂已广泛应用于农业生产中，能有效地改善作物生长状况， 提高农作物的产量和质量。但和其它农药一样，植物生长调节剂也具有一定的毒性。食用植 物生长调节剂残留的植物、水果、蔬菜，以及由激素催成的反季节蔬菜和水果，短期内影响 不大，但长期食用会对人体产生副作用，造成人体内代谢失调，从而引发各种疾病。因此随 着植物生长调节剂在农业生产中越来越广泛的应用，其滥用及使用不当导致的食品安全问 题逐渐增多，由此引发的食品安全事故也频繁发生，特别是近几年发生的"毒豆芽事件"造 成了严重的影响。我国豆芽生产主要是家庭作坊孵化式，一些不法商贩在制作过程中滥用 植物生长调节剂，造成大量植物生长调节剂残留。植物生长调节剂在食品中的残留也因此 成为影响我国食品安全的主要因素之一。因此加强植物源性食品中植物生长调节剂残留量 的快速有效检测，对保证食品安全，促进人类健康及社会经济发展都具有现实意义。
[0003] 农药多组分残留分析日趋朝着痕量方向发展，要求研发出快速定性、精准定量、回 收率好、操作简便、检出限低的检测技术。目前我国《食品安全国家标准食品中农药最大残 留限量》(GB 2763-2014)中规定的植物生长调节剂只有矮壮素、多效唑、氯苯胺灵、氯吡脲、 萘乙酸、噻苯隆和乙烯利等12种，而生产中常用的一些植物生长调节剂由于缺乏监测数据， 没有制定相应的最大残留限量。并且目前基本使用单一农药检测技术，而其它滥用的植物 生长调节剂残留的检测标准有北京市地方标准《豆芽中4-氯苯氧乙酸钠、6-苄基腺嘌呤、2， 4_滴、赤霉素、福美双的测定》(DB11/T 379-2006)和浙江省地方标准《无公害豆芽第3部分： 6 -苄基腺嘌呤残留量和4一氯苯氧乙酸钠残留量的测定》(DB33/T 625.3-2007)，只针对豆 芽中的4-氯苯氧乙酸纳、6-苄基腺嘌呤、2,4_滴、赤霉素的测定；吉林省食品安全地方标准 《豆芽中4-氯苯氧乙酸钠的测定高效液相色谱法》(DB S22/001-2013)、《食品中6-苄基腺嘌 呤的测定高效液相色谱法》(GB/T 23381 -2009)针对食品中6-苄基腺嘌呤的检测方法;《粮 食中2,4-滴丁酯残留量的测定》(68/^5009.165-2003);《粮食和蔬菜中2,4-0残留量的测 定》(GB/T 5009.175-2003)是针对2,4_滴丁酯和2，4-D的检测方法。上述几个标准和相关检 测植物生长调节剂的文献报道采用了气相色谱法、气相色谱-质谱法、液相色谱法、液相色 谱-质谱法等的方法仅仅对单一或几个植物生长调节剂进行检测，并不适合不同基质的植 物源性食品中多组分植物生长调节剂残留量同时进行检测。
[0004] 关于植物生长调节剂检测样品前处理的文献报道中，主要涉及的富集净化方式有 液液萃取，固相萃取和分散固相萃取(QuEChERS)等，液液萃取，固相萃取存在着可适用的溶 剂种类比较少、易出现乳化现象、使用有机溶剂的量大、重现性差和回收率较低等缺点。 QuEChERS 方法，意为快速（quick)、简单（easy)、实惠（cheap)、有效（effective)、好用 (rugged)、安全(safe)的样品前处理方法，是近年来国际上最新发展起来的一种用于农产 品检测的快速样品前处理技术，但由于在多组分分析中一些植物生长调节剂在酸性和碱性 条件下不稳定，易产生降解，因此无法采用现有的QuEChERS方法进行样品前处理。且由于不 同的植物源性食品基质干扰、市场使用植物生长调节剂的品种繁多且不同的植物生长调节 剂理化性质存在较大差异，从而对其残留进行精准定量分析造成了很大的困难。如何通过 简单、有效、适宜的前处理技术，在不同基质样品中尽可能的检测多种植物生长调节剂，同 时实现精准定量和快速定性、检出限能够满足最大残留限量要求是本发明要解决的关键技 术问题。总之，目前尚未有采用稳定性同位素稀释与超高效液相色谱质谱联用法对植物源 性食品中19种植物生长调节剂残留量快速定性、精准定量的检测方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的旨在克服现有技术的缺点，利用稳定性同位素稀释技术，采用改进 的QuEChERS前处理方法，建立了超高效液相色谱质谱联用法对植物源性食品中常用的19种 植物生长调节剂残留同时快速定性、精准定量的高通量检测技术，为植物源性食品中植物 生长调节剂残留的风险评估提供技术支撑，为食品安全突发公共卫生事件的处置提供科学 的检测方法。
[0006] 为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
[0007] 本发明所述的19种植物生长调节剂包括4类:生长素类：吲哚乙酸、吲哚丙酸、吲哚 丁酸、萘氧乙酸、2,4_二氯苯氧乙酸、4-氯苯氧乙酸、2,3,5_三碘苯甲酸;赤霉素类:赤霉 素(GA3);细胞分裂类:玉米素、6-苄基腺嘌呤、氯吡脲、6-糠基氨基嘌呤、四氢吡喃苄基腺嘌 呤、噻苯隆;生长抑制剂类和生长延缓剂类:多效唑、矮壮素、助壮素、烯效唑、丁酰肼。这4类 植物生长调节剂理化性质之间差别较大，发明人通过大量实验摸索，找到了一种可同时检 测食品中上述19种植物生长调节剂的方法，该方法包括：
[0008] 1)样品前处理
[0009] 称取适量试样，按照lg:l-2mL的比例加入含1%乙酸的乙腈溶液，并加入至少两种 同位素稀释剂，匀浆，然后加入脱水试剂，调节pH至5.5-6.0，涡旋振荡、离心;取上清液进行 分散固相萃取，涡旋混匀、离心，所得上清液用氮气吹干，加入5%乙腈水溶液超声溶解，过 滤后，待测定；
[0010] 2)制备标准溶液
[0011] 将多效唑、6-苄基腺嘌呤、四氢吡喃苄基腺嘌呤、6-糠基氨基嘌呤、烯效唑和玉米 素标准品为一组配制成标准使用液1;再将矮壮素、助壮素、丁酰肼、赤霉素、吲哚乙酸、2,4_ 二氯苯氧乙酸、吲哚丙酸、吲哚丁酸、噻苯隆、氯吡脲、4-氯苯氧乙酸、2,3,5_三碘苯甲酸和 萘氧乙酸标准品为另一组配制成标准使用液2;
[0012] 3)绘制标准曲线
[0013]吸取标准使用液1适量，用空白样品基质溶液配成系列浓度的基质标准工作液，经 UPLC-MS/MS分析，以各浓度基质标准工作液的色谱峰面积对其相应的浓度进行回归，建立 标准工作曲线;吸取标准使用液2适量，用空白样品基质溶液配成系列浓度的基质标准工作 液，经UPLC-MS/MS分析，以各浓度基质标准工作液的色谱峰面积对其相应的浓度进行回归， 建立标准工作曲线;其中，所述空白样品基质溶液即不含有所测的植物生长调节剂的样品， 经上述步骤1)处理后所得的溶液；
[0014] 4)样品通过UPLC-MS/MS进行定量和/或定性测定，其中：
[0015] 色谱条件为采用Acquity UPLC HSS T3色谱柱，流动相为含5mmol/L乙酸铵的水溶 液和乙腈，流速为0.3mL/min，采用梯度洗脱方式:Omin-1. Omin，流动相中乙腈的体积浓度 为0% ; 1.0min-12.0min，流动相中乙腈的体积浓度从0%升至70% ; 12.0min_14.0min，流动 相中乙腈的体积浓度为70%，14.0min-15min，流动相中乙腈的体积浓度从70%降至0%，柱 温35°C，进样量10此；
[0016]质谱条件为:离子源为电喷雾离子源，采用正负电离模式:ESI + :多效唑、6-苄基腺 嘌呤、吲哚乙酸、吲哚丙酸、吲哚丁酸、四氢吡喃苄基腺嘌呤、6-糠基氨基嘌呤、矮壮素、烯效 唑、丁酰肼、玉米素、助壮素;ESI-:赤霉素、2,4-二氯苯氧乙酸、噻苯隆、氯吡脲、4-氯苯氧乙 酸、2，3，5-三碘苯甲酸、萘氧乙酸，多离子反应监测MRM;毛细管电压：2.8kV(_); 2.9kV (+ );离子源温度：150°C ;脱溶剂气温度:500°C ;脱溶剂气流量:1000L/h。
[0017]在上述方法中，步骤1)中，所述同位素稀释剂优选为吲哚丙酸-D2和氯吡脲-D5。本 发明首次采用稳定性同位素稀释技术对19种植物生长调节剂进行精准定量检测，分别采用 2种不同的同位素内标进行定量检测，有效地克服了基质效应和减少了样品前处理所造成 的损失，确保了定量检测结果的准确性。
[0018] 进一步地，步骤1)中，所述试样与脱水试剂的质量比为1:0.5-1;其中，所述脱水试 剂为无水硫酸镁和氯化钠，优选地，所述无水硫酸镁和氯化钠的质量比为4:1。本发明选择 无水硫酸镁和氯化钠作为脱水试剂可避免了植物源性食品基质中干扰物质（如果糖)一同 被提取出来。此外，步骤1)中，使用乙酸钠调节pH值至5.5-6,避免了酸性或碱性不稳定植物 生长调节剂的降解，能满足多种类多组分植物生长调节剂的检测要求。
[0019] 进一步地，步骤1)中，所述分散固相萃取采用C18和无水硫酸镁作为吸附剂，其中， 所述C18和无水硫酸镁的质量比为1:2-3。本发明选择上述比例的(：18和无水硫酸镁作为吸 附剂，不仅有效去除了色素、脂肪酸等基质干扰，而且目标化合物均有较高的回收率;拓展 了方法适用的食品基质种类。
[0020] 进一步地，步骤1)中，过滤时采用0.22M1的有机滤膜。
[0021] 在本发明上述方法的步骤3)中，发明人经过大量实验摸索将理化性质存在较大差 异的19种植物生长调节剂分成两组配制标准溶液，即简化操作步骤，同时还提高定量的准 确性和可靠性。此外，采用空白基质添加不同浓度的目标化合物混合标准溶液，克服有些样 品的基质效应。本发明所建立的检测方法，所述多效唑、6-苄基腺嘌呤、四氢吡喃苄基腺嘌 呤、6-糠基氨基嘌呤、烯效唑和玉米素的线性范围为0.5iig/L-100iig/L;所述矮壮素、助壮 素、丁酰肼、赤霉素、吲哚乙酸、2,4_二氯苯氧乙酸、吲哚丙酸、吲哚丁酸、噻苯隆、氯吡脲、4-氯苯氧乙酸、2，3，5-三碘苯甲酸和萘氧乙酸的线性范围为2.0iig/L-200iig/L。本发明检测 线性范围较宽，适合不同植物生长调节剂残留量浓度的分析。
[0022] 进一步地，在上述方法的步骤4)中，定量测定具体为:将步骤1)得到的样品溶液注 入UPLC-MS/MS进行测定，测得样液中目标化合物的色谱峰面积，根据标准曲线，计算样品溶 液中各植物生长调节剂的浓度，并计算出样品中各植物生长调节剂的含量。
[0023]定性测定具体为:检测步骤1)得到的样品溶液中目标化合物，以保留时间和特征 离子与定量离子所对应的色谱峰面积相对丰度进行定性。要求被测试样中目标化合物的保 留时间与标准溶液中目标化合物保留时间的相对偏差小于20% ;样品特征离子的相对丰度 与浓度相当混合标准溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表1的规定，则可判断样品 中存在相应的被测物。
[0024]表1定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差
[0026]此外，在建立上述方法时，发明人考察了不同流动相体系对目标化合物分离的影 响，研究表明乙腈和水、乙腈和0.1 %甲酸作为流动相时，分离的效果很不好，而采用含 5mmol/L乙酸铵的水溶液和乙腈作为流动相时，19种植物生长调节剂能够很好的进行分离， 峰形好。但是在选用5mmol/L乙酸铵水溶液做流动相时优选是要现用现配，使用时间最好不 要超过24小时，否则会影响待测物灵敏度而且保留时间也会有变化。根据19种植物生长调 节剂理化性质，采用了正、负两种电离模式，多离子反应监测，确保快速定性，精准定量。 [0027]本发明的有益效果如下：
[0028]本发明通过对实验条件的优化，首次建立了改进的QuEChERS-稳定性同位素稀释-超高效液相色谱质谱法测定植物源性食品中4大类19种植物生长调节剂残留量的方法。19 种植物生长调节剂分别采用2种不同的同位素内标进行定量检测，有效地克服了基质效应 和减少了样品前处理所造成的损失，确保了定量检测结果的准确性。矮壮素、丁酰肼、赤霉 素、吲哚乙酸、2,4_二氯苯氧乙酸、吲哚丙酸、吲哚丁酸、噻苯隆、氯吡脲、4-氯苯氧乙酸、2， 3，5-三碘苯甲酸、萘氧乙酸的浓度在2.0yg/L-200yg/L范围内线性良好；多效唑、6-苄基 腺嘌呤、四氢吡喃苄基腺嘌呤、6-糠基氨基嘌呤、烯效唑、玉米素的浓度在0.2yg/L-20yg/L 范围内线性良好。本发明检测线性范围较宽，适合不同植物生长调节剂残留量浓度的分析； 19种植物生长调节剂的检出限在0.02yg/kg-5.0yg/kg之间，方法平均回收率在72.3%-115.8%，RSD为 1.78%-5.32%。
[0029]本发明样品前处理简单，提取效率比较高，分离效果好，重现性好，方法的灵敏度 和检出限均能满足农药残留分析的要求，且可分析的植物生长调节剂范围广、分析速度快、 溶剂使用量少，污染小，易于推广使用。此外，本发明完全克服了由于不同的植物源性食品 基质干扰、市场使用植物生长调节剂的品种繁多且不同的植物生长调节剂理化性质存在较 大差异对残留分析的困难，同时19种植物生长调节剂仅用15min就完成全部的分离检测，大 大缩短了检测时间，提高了检测效率，具有简单高效、高特异性、高通量和高灵敏度等优点， 也使本发明更适用于食品安全突发公共卫生事件的检测。
【附图说明】
[0030] 图1 19种植物生长调节剂标准溶液的色谱图；
[0031] 注:A 4-氯苯氧乙酸、B赤霉素、C 2,4_二氯苯氧乙酸、D噻苯隆、E氯吡脲、邱-萘氧 乙酸、G 2,3,5_三碘苯甲酸、H助壮素、I矮壮素、J丁酰肼、K吲哚乙酸、L吲哚丙酸、M吲哚丁 酸、N 6-糠基氨基嘌呤、0玉米素、P 6-苄基腺嘌呤、Q烯效唑、R多效唑、S四氢吡喃苄基腺嘌 呤。
[0032]图2 19种植物生长调节剂在2种样品前处理方法中测定结果的比较；
[0033] 注：1.4-氯苯氧乙酸、2.赤霉素、3.2,4_二氯苯氧乙酸、4.噻苯隆、5.氯比脲、6.0-萘氧乙酸、7.2,3,5_三碘苯甲酸、8.助壮素、9.矮壮素、10.丁酰肼、11.吲哚乙酸、12.吲哚丙 酸、13.吲哚丁酸、14.6-糠基氨基嘌呤、15.玉米素、16.6-苄基腺嘌呤、17.烯效唑、18.多效 唑、19.四氢吡喃苄基腺嘌呤。
【具体实施方式】
[0034]本发明实施例中使用的仪器与试剂：
[0035] 超高效液相色谱-串联质谱联用仪（UPLC-MS/MS) (Waters TQS，美国）、离心机 (CF16RN，日立公司）、MS3型漩涡混合器（IKA，德国）、氮吹仪(0A? SYS，0A? JNC); 19种植物生 长调节剂标准品，均购自德国Dr .Ehrenstorfer公司，纯度均彡99.0% ;吲噪丙酸-D2标准品 购自加拿大TRC公司，氯吡脲-D5标准品购自加拿大CDN公司。乙腈、乙酸（色谱纯，美国 Fi sher公司）；乙酸铵(色谱纯，德国CNW公司）；无水硫酸镁、乙酸钠、氯化钠(分析纯，北化）； C18分散固相萃取剂(美国Agilent公司）。
[0036]实施例1植物源性食品中植物生长调节剂残留量的检测 [0037] 1)样品前处理
[0038] 称取试样lO.OOg于50mL离心管中，加入10mL含1%(V/V)乙酸的乙腈溶液，分别加 入50yL浓度为1.0mg/L的2种同位素稀释剂，勾衆2min后，加入5-10g脱水试剂(6g无水硫酸 镁和1 ? 5g氯化钠），加入乙酸钠调节pH至5 ? 5-6，祸旋振荡lmin，以10000r/min离心3min，采 用改进的QuEChERS前处理方法，取2. OmL上清液于分散固相萃取管（50mg C18和100mg无水 硫酸镁）中，祸旋混勾lmin后于10000r/min速率下离心5min，所得上清液取1. OmL，50°C下用 氮气吹干，加入1.0mL5 %乙腈水溶液超声溶解，经0.22mi有机滤膜过滤后，待测定。
[0039] 其中，同位素稀释剂的配制方法:分别精确称取同位素内标吲哚丙酸-D2和氯吡 脲-D5标准品各lO.Omg，用乙腈分别溶解并定容至100mL，混匀，此标准储备液浓度为 0. 100mg/mL，储存于棕色玻璃瓶中，-20°C下避光保存。同位素标准使用液:分别精确吸取吲 哚丙酸-D2和氯吡脲-D5标准储备液各lmL，用纯水溶解定容至100mL，混匀，此标准使用液浓 度为 1 .Omg/L。
[0040] 2)制备标准溶液
[0041] 分别精确称取多效唑、6-苄基腺嘌呤、四氢吡喃苄基腺嘌呤、6-糠基氨基嘌呤、烯 效唑、玉米素、矮壮素、助壮素、丁酰肼、赤霉素、吲哚乙酸、2,4_二氯苯氧乙酸、吲哚丙酸、吲 哚丁酸、噻苯隆、氯吡脲、4-氯苯氧乙酸、2，3，5-三碘苯甲酸、萘氧乙酸标准品各10.0 mg， 用乙腈分别溶解并定容至100mL，混匀，此标准储备液浓度为0.100mg/mL，储存于棕色玻璃 瓶中，-20 °C下避光保存。分别精确吸取（1)组：多效唑、6-苄基腺嘌呤、四氢吡喃苄基腺嘌 呤、6-糠基氨基嘌呤、烯效唑、玉米素标准储备液各0. lmL，用纯水溶解定容至100mL，混匀； 再分别精确吸取(2)组:矮壮素、丁酰肼、赤霉素、吲哚乙酸、2,4_二氯苯氧乙酸、吲哚丙酸、 吲哚丁酸、噻苯隆、氯吡脲、4-氯苯氧乙酸、2,3,5_三碘苯甲酸、萘氧乙酸标准储备液各 1. OmL，用纯水溶解定容至1 OOmL，混匀。制备标准使用液，4 °C冰箱中保存。
[0042] 3)测定：
[0043] a标准曲线的绘制
[0044] 吸取标准使用液适量，矮壮素、助壮素、丁酰肼、赤霉素、吲哚乙酸、2,4_二氯苯氧 乙酸、吲哚丙酸、吲哚丁酸、噻苯隆、氯吡脲、4-氯苯氧乙酸、2,3,5_三碘苯甲酸、萘氧乙酸 用空白样品基质溶液配成 2yg/L、1 Oyg/L、20yg/L、50yg/L、100yg/L、150yg/L、200y g/L 的系 列标准溶液;多效唑、6-苄基腺嘌呤、四氢吡喃苄基腺嘌呤、6-糠基氨基嘌呤、烯效唑、玉米 素用空白样品基质溶液配成 0 ? 2yg/L、0 ? 5yg/L、2iig/L、5iig/L、lOyg/L、15yg/L、20iig/L 的系 列标准溶液，经UPLC-MS/MS分析，建立标准曲线。
[0045] b色谱条件
[0046] 采用Acquity UPLC HSS T3色谱柱，流动相为含5mmol/L乙酸铵的水溶液和乙腈， 流速为〇 . 3mL/min，采用梯度洗脱方式：0min-l. Omin，流动相中乙腈的体积浓度为0% ; 1.0min-12.0min，流动相中乙腈的体积浓度从0%升至70% ; 12.0min-14.0min，流动相中乙 腈的体积浓度为70% ; 14.0min-15min，流动相中乙腈的体积浓度从70%降至0%，柱温35 °(：，进样量10此。
[0047] c质谱条件
[0048] 离子源为电喷雾离子源，电离模式:ESI+:多效唑、6-苄基腺嘌呤、吲哚乙酸、吲哚 丙酸、吲哚丁酸、四氢吡喃苄基腺嘌呤、6-糠基氨基嘌呤、矮壮素、烯效唑、丁酰肼、玉米素、 助壮素;ESr:赤霉素、2,4_二氯苯氧乙酸、噻苯隆、氯吡脲、4-氯苯氧乙酸、2,3,5_三碘苯甲 酸、萘氧乙酸，多离子反应监测MRM，毛细管电压：2.81^(-);2.91^( + );离子源温度：150 °C ;脱溶剂气温度:500°C ;脱溶剂气流量:1000L/h。待测物的定性、定量离子及碰撞能量、锥 孔电压见表2。
[0049] 表2 19种植物生长调节剂的定性、定量离子及碰撞能量、锥孔电压
[0050]
[0051]
[0052] 根据标准曲线，计算样品溶液中各植物生长调节剂的浓度，根据公式计算出样品 中各植物生长调节剂的含量。多效唑、6-苄基腺嘌呤、吲哚乙酸、吲哚丙酸、吲哚丁酸、四氢 吡喃苄基腺嘌呤、6-糠基氨基嘌呤、矮壮素、烯效唑、丁酰肼、玉米素、助壮素选择吲哚丙酸-D2为内标;赤霉素、2,4_二氯苯氧乙酸、噻苯隆、氯吡脲、4-氯苯氧乙酸、2,3,5_三碘苯甲酸、 萘氧乙酸选择氯吡脲-D5为内标。
[0053] 应用本发明所述方法还对对多种植物源性食品进行了检测，检测的结果详见表3。
[0054] 表3植物源性食品检测结果一览表
[0055]
[0056] 实施例2
[0057] 以空白样品基质溶液配制不同浓度的植物生长调节剂标准系列，采用UPLC-MS/MS 进行分析，得出线性范围、回归方程和相关系数(r)及检出限。按本发明方法进行样品处理， 在基质样品中添加不同含量的3个水平19种植物生长调节剂的混合标准溶液，每个添加浓 度平行测定6次，测定精密度及准确度。
[0058] 1)线性范围、回归方程及检出限
[0059] 矮壮素、丁酰肼、赤霉素、吲哚乙酸、2,4_二氯苯氧乙酸、吲哚丙酸、吲哚丁酸、噻苯 隆、氯吡脲、4-氯苯氧乙酸、2，3，5-三碘苯甲酸、萘氧乙酸的浓度在2.0yg/L-200yg/L范围 内线性良好;多效唑、6-苄基腺嘌呤、四氢吡喃苄基腺嘌呤、6-糠基氨基嘌呤、烯效唑、玉米 素的浓度在〇. 2yg/L-20yg/L范围内线性良好。详见表4。
[0060] 表4 19种植物生长调节剂线性范围及检出限
[0062] 2)精密度和准确度试验
[0063] 在基质样品中添加不同含量的3个水平19种植物生长调节剂的混合标准溶液，每 个添加浓度平行测定6次，测定精密度及准确度，19种植物生长调节剂加标回收率在 72.3%-115.8%，所测定的RSD为1.78%-5.32%。方法的准确度和精密度均符合残留分析 的要求(表5)。
[0064] 表5 19种植物生长调节剂精密度和准确度试验结果(n = 6)
[0067] 对比例1
[0068] 本对比例所述西瓜样品为西瓜阴性样品，添加19种植物生长调节剂浓度为5.Oyg/ kg制得，采用与实施例1完全相同的超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪条件对所述待 测样品中含有的19种植物生长调节剂进行检测，区别仅在于对样品前处理的步骤中未向样 品中加入脱水剂(无水硫酸镁和氯化钠)和用乙酸钠调节pH至5.5-6,而是直接加入C18和无 水硫酸镁进行净化提取。
[0069]所制得的待测样品溶液颜色为浅红色，利用超高效液相色谱-三重四级杆质谱联 用仪进行检测，质谱的色谱峰信噪比S/N〈10,各植物生长调节剂的检出限明显高于加入脱 水剂(无水硫酸镁和氯化钠)和用乙酸钠调节pH至5.5-6的样品检出限，且回收率降低(详见 表6)，同时会对仪器造成一定的污染。
[0070] 表6两种前处理方法检测结果对比
[0071]
[0072] 对比例2
[0073] 本对比例所述豆芽样品为豆芽阴性样品，添加19种植物生长调节剂浓度为10.0y g/kg制得，采用与实施例1完全相同的超高效液相色谱_三重四级杆质谱联用仪条件对所述 待测样品中含有的19种植物生长调节剂进行检测，区别仅在于对样品前处理的步骤中未向 样品中加入稳定性同位素内标。
[0074] 所制得的待测样品溶液，利用超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪进行检测， 测定的各植物生长调节剂含量明显低于利用稳定性同位素内标进行修正计算的样品测定 值，而使用同位素内标进行修正的测定结果与实际添加水平更接近(见图2)。因此使用稳定 性同位素稀释技术可以有效地克服基质效应和减少样品前处理所造成的损失，确保了定量 检测结果的准确性。
[0075]显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对 本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可 以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发 明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
【主权项】
1. 一种同时检测食品中多种植物生长调节剂的方法，其特征在于，该方法包括： 1) 样品前处理 称取适量试样，按照lg:l-2mL的比例加入含1%乙酸的乙腈溶液，并加入至少两种同位 素稀释剂，匀浆，然后加入脱水试剂，调节pH至5.5-6.0，涡旋振荡、离心;取上清液进行分散 固相萃取，涡旋混匀、离心，所得上清液用氮气吹干，加入5%乙腈水溶液超声溶解，过滤后， 待测定； 2) 制备标准溶液 将多效唑、6-苄基腺嘌呤、四氢吡喃苄基腺嘌呤、6-糠基氨基嘌呤、烯效唑和玉米素标 准品为一组配制成标准使用液1;再将矮壮素、助壮素、丁酰肼、赤霉素、吲哚乙酸、2,4_二氯 苯氧乙酸、吲哚丙酸、吲哚丁酸、噻苯隆、氯吡脲、4-氯苯氧乙酸、2，3,5_三碘苯甲酸和β-萘 氧乙酸标准品为另一组配制成标准使用液2; 3) 绘制标准曲线 吸取标准使用液1适量，用空白样品基质溶液配成系列浓度的基质标准工作液，经 UPLC-MS/MS分析，以各浓度基质标准工作液的色谱峰面积对其相应的浓度进行回归，建立 标准工作曲线;吸取标准使用液2适量，用空白样品基质溶液配成系列浓度的基质标准工作 液，经UPLC-MS/MS分析，以各浓度基质标准工作液的色谱峰面积对其相应的浓度进行回归， 建立标准工作曲线； 4) 定量和/或定性测定，其中： 色谱条件为采用Acquity UPLC HSS Τ3色谱柱，流动相为含5mmol/L乙酸铵的水溶液和 乙腈，流速为〇 . 3mL/min，采用梯度洗脱方式：Omin-1. Omin，流动相中乙腈的体积浓度为 0% ; 1.0min-12.0min，流动相中乙腈的体积浓度从0%升至70% ; 12.0min_14.0min，流动相 中乙腈的体积浓度为70% ; 14.0min-15min，流动相中乙腈的体积浓度从70%降至0%，柱温 35°C，进样量 10yL; 质谱条件为:离子源为电喷雾离子源，采用正负电离模式:ESI+:多效唑、6-苄基腺嘌呤、 吲哚乙酸、吲哚丙酸、吲哚丁酸、四氢吡喃苄基腺嘌呤、6-糠基氨基嘌呤、矮壮素、烯效唑、丁 酰肼、玉米素、助壮素;ESr:赤霉素、2,4_二氯苯氧乙酸、噻苯隆、氯吡脲、4-氯苯氧乙酸、2， 3，5-三碘苯甲酸、β-萘氧乙酸，多离子反应监测MRM;毛细管电压:2.8kV(_); 2.9kV( + );离子 源温度：150°C ;脱溶剂气温度:500°C ;脱溶剂气流量:1000L/h。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述同位素稀释剂为吲哚丙酸-D2和氯吡脲-D5。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述试样与脱水试剂的质量比 为1:0.5-1;其中，所述脱水试剂为无水硫酸镁和氯化钠，所述无水硫酸镁和氯化钠的质量 比为4:1。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，使用乙酸钠调节pH值。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述分散固相萃取采用C18和无 水硫酸镁作为吸附剂，其中，所述C18和无水硫酸镁的质量比为1:2-3。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，过滤时采用0.22μπι的有机滤膜。7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多效唑、6-苄基腺嘌呤、四氢吡喃苄基 腺嘌呤、6-糠基氨基嘌呤、烯效唑和玉米素的线性范围为0.5yg/L-100yg/L;所述矮壮素、助 壮素、丁酰肼、赤霉素、吲哚乙酸、2,4_二氯苯氧乙酸、吲哚丙酸、吲哚丁酸、噻苯隆、氯吡脲、 4-氯苯氧乙酸、2，3，5-三碘苯甲酸和β-萘氧乙酸的线性范围为2.0yg/L-200yg/L。8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中，定量测定具体为:将步骤1)得到 的样品溶液注入UPLC-MS/MS进行测定，测得样液中目标化合物的色谱峰面积，根据标准曲 线，计算样品溶液中各植物生长调节剂的浓度，并计算出样品中各植物生长调节剂的含量。9. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中，定性测定具体为:检测步骤1)得 到的样品溶液中目标化合物，以保留时间和特征离子与定量离子所对应的色谱峰面积相对 丰度进行定性。
【文档编号】G01N30/88GK106053703SQ201610680340
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年8月17日
【发明人】刘思洁, 吴永宁, 方赤光, 何东阳, 崔勇, 姜楠
【申请人】刘思洁