专利名称：灵芝酸在癌症治疗中作为增敏增效剂和抑制剂的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及灵芝酸的新用途，尤其涉及灵芝酸Me(Ganoderic acid Me)和灵芝酸T(Ganoderic acid T)的新用途。
背景技术：
灵芝是一种珍贵的药用真菌，已有几千年的应用历史。东汉时期的《神农本草经》，把灵芝列为上药。以后历代医药学家也有许多关于灵芝的论著，如东晋葛洪的《抱朴子》，唐朝苏静的《新修本草》，梁代陶弘景的《名医别录》，以及明代李时珍的《本草纲目》等。古代医药学家对灵芝的药用价值已有充分认识，认为灵芝具有“扶正固本”作用，可用于治疗多种疾病。
灵芝的现代研究始于20世纪50年代，随着人工栽培和深层发酵生物技术的成功，为灵芝的医药研究和产品开发提供了充足的原料。《中华人民共和国药典》(2000)已收载了灵芝作为法定中药材，美国《草药药典与治疗概要》也收载了灵芝，该系列专著迄今仅收载了10种中药。说明灵芝的药用价值得到了多方面的承认。
灵芝的化学研究证明，它含有多糖，三萜类，肽类等主要有效成分。药理研究证明，它有广泛的药理作用，如抗肿瘤，抗HIV病毒，免疫调节，抗心肌缺血，调节血脂，降血糖，镇静作用，保肝作用，抗放射和抗化疗，抗缺氧和抗衰老作用等。
三萜类化合物是灵芝类的主要化学成分之一，很多三萜类化合物具有重要的生理活性，比如，ganodriol F、ganodermanontriol、lucidumol A和lucidumol B有抗HIV病毒活性，ganoderic acid F有很强的抑制血管紧张素酶的活性等。自1982年T Kubota(Helv.Chim.Acta，65(2)，611-619，1982)等人首次分离得到该类化合物以后，迄今为止已分离得到100多种同类化合物。
有关灵芝酸的公开的专利和发表的文献大致可分为三类第一类是关于发酵生产灵芝酸，这些专利和文献主要是优化发酵条件，增加灵芝酸产量日本专利公开特许公报特开平4-304890，公开了灵芝酸的发酵生产工艺，但所得的产物中灵芝酸的含量仅为0.46-1.0毫克/100毫克干重。专利CN1264743A中，钟建江和方庆华提供了一种“液体发酵法同时生产灵芝多糖和灵芝酸工艺”，涉及到一种液体好氧发酵-液体静止培养法，考察了第二阶段培养过程中振荡与静止对灵芝酸生产的影响。王淑华，孙翠焕，朱万琴，王恒新，冯健.灵芝液体深层发酵工艺研究初报，微生物学杂志1994，14(5)29-32报道了灵芝G3-1批培养的方法。还有一些专利和文献也公开和报道了各种发酵方法，比如，钟建江和汤亚杰公开了有关发酵法同时生产灵芝多糖和灵芝酸的专利(专利公开号CN1375557、CN1316519)，可以高效率生产灵芝酸，粗灵芝酸的总含量可达5毫克/100毫克，总产量高达1克/升。
第二类是关于灵芝抗肿瘤的专利和文献，主要是灵芝子实体或孢子粉和其他药物配伍后，用于癌症的治疗专利CN1483423报道了一种治疗恶性肿瘤的中药制剂及其制备方法，该中药制剂是以半枝莲、灵芝、鸡血藤、生地、枸杞子等为主要原料，对各种肿瘤皆有很好的疗效。
专利CN 1480208报道了一种用于放化疗减毒增效的药物组合物及其制备方法，这种药物由黄芪、枸杞、灵芝按重量配比制成。专利CN 1421227报道了包含灵芝的用于治疗与预防辐射线损伤的药物。专利CN 1286119报道了一种灵芝保健品及其制备方法，灵芝酸纯度为15％，对肿瘤的抑制率达30％上。但是相关文献中未见有关灵芝酸单体的报道。
第三类是关于灵芝酸分离的专利和文献，介绍了灵芝酸的粗分离工艺，比如，专利CN 1282611报道了灵芝孢子中抗肿瘤成分的分离技术，原料经浸提、萃取、层析后得到一系列膏状物。专利CN 1181271报道了一种高活性灵芝酸多糖和高含量灵芝酸的制备方法，提取物的得率提高40％。
肿瘤化疗是目前治疗肿瘤的重要手段，影响治疗效果的主要问题是肿瘤能形成多药耐药性。
目前正在研究中的逆转剂有①钙拮抗剂，主要有verapamil及其衍生物等，部分药物已在临床使用；②钙调蛋白拮抗剂，包括chlorpromazine等吩噻嗪类衍生物，已进入临床试验；③环孢菌素类，环孢菌素A及其结构类似剂PSC833，SDZ280-466等已显示出良好的临床应用前景；④喹啉类，quinidine等已进入临床试验，疗效不理想；⑤抗雌激素类化合物，其中tamoxifen研究较深入，tamoxifen与verapamil合用疗效更好。以上药物大多不良反应较大，疗效报道不一。
其他耐药逆转剂有①反义核酸与核酶；②细胞因子TNF-α；③GSH耗竭剂Vitamin K3，BSO(丁硫氨酸亚砜胺)；④蛋白药物交联剂等。
已有的增敏增效药物都存在使用上的缺陷，寻找新的能同时抗肿瘤和增敏增效的药物资源已成为急需解决的问题。理想的MDR逆转剂应具备以下条件①安全，对正常组织毒性小；②在体内及肿瘤细胞能达到体外有效浓度；③本身具有一定的抗肿瘤活性；④稳定、体内半衰期较长；⑤其代谢物也有效。本项发明正与其相符合，因此，具有重要的经济效益和社会效益。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是公开灵芝酸在制备多药耐药性癌症化疗增敏增效剂和抑制剂中的应用，以满足临床医学的需要。
本发明所说的灵芝酸为灵芝酸Me(Ganoderic acid Me，缩写GA-Me)或灵芝酸T(Ganoderic acid T，缩写GA-T)。
发明人发现，灵芝酸Me或灵芝酸T小剂量使用能增加多药耐药性肿瘤对已产生耐药性的化疗药物的敏感性，大剂量使用能抑制多种多药耐药性肿瘤细胞生长的作用且具有剂量依赖性，可将它们作为治疗多药耐药性肿瘤的药物和增敏增效剂，应用于肿瘤的化学治疗中。所说的小剂量指的是低于1～10mg/(公斤体重·天)的剂量，所说的大剂量指的是高于10～100mg/(公斤体重·天)的剂量。
本发明还涉及一种组合物，包括治疗有效量的灵芝酸Me或灵芝酸T和医药学上可接受的载体。
可以将灵芝酸Me或灵芝酸T与医药学上可接受的载体以组合物的形式，施加于需要治疗的患者，一般的剂量为1～100mg/(公斤体重·天)，具体可根据患者的年龄、病情等进行变化。
所说的载体是指药学领域常规的药物载体，如稀释剂、赋形剂如水等，填充剂，如淀粉、蔗糖等，粘合剂，如纤维素衍生物明胶、聚乙烯吡咯烷酮等，润滑剂，如滑石粉等。
本发明的灵芝酸Me或灵芝酸T与上述载体构成的组合物，可以通过口服、鼻吸、静脉注射或皮下注射的形式施加于需要这种治疗的患者。
用于口服时，可以将其制备成为常规的片剂、粉剂或口服液；用于注射时，可以将其采用本领域常规的方法，制备成为注射液；本发明的芝酸Me或灵芝酸T的各种制剂，包括散剂，丸剂，片剂，胶囊剂等固型制剂，软膏，贴敷剂，注射剂等可以采用药学领域常规的方法进行制备；制剂中，灵芝酸Me或灵芝酸T的重量含量为0.1～99.9％，优选的含量为0.5～99.9％。
本发明提供的芝酸Me或灵芝酸T的各种制剂，在低浓度的情况下具有增强多药耐药性肿瘤细胞对化疗药物敏感性的作用。所说的低浓度指的是低于1～10mg/(公斤体重·天)的剂量。
本发明提供的灵芝酸Me或灵芝酸T的各种制剂，在高浓度的情况下具有抑制多药耐药性肿瘤细胞增殖的作用，说明不仅具有杀灭肿瘤细胞的作用而且可以遏制肿瘤细胞的无限增殖能力，因而可以发挥更进一步更大程度治疗肿瘤的效果。所说的高浓度指的是高于10～100mg/(公斤体重·天)的剂量；本发明提供的多药耐药性肿瘤化疗中的抗癌剂和增敏增效剂，对多药耐药性癌细胞和非多药耐药性癌细胞有相同的细胞毒性，而且两者差异不显著(p＜0.05)。
所说的灵芝酸Me(GA-Me)或灵芝酸T(GA-T)分别由灵芝菌丝体发酵中提取，可采用文献(Chem.Pharm.Bull.，34(5)，2282-2285，1986；Agric.Biol.Chem.，51(2)，619-622，1987)公开的技术进行制备提取，纯度大于99％，其最先被分离鉴定于1983年(Tetrahedron Lett.，24(10)，1081-1084，1983)和1987年(Agric.Biol.Chem.，51(2)，619-622，1987)。
所说的多药耐药性肿瘤为医学上所属的各类肿瘤，包括良性肿瘤和恶性肿瘤。而所说的恶性肿瘤包括恶性黑色素瘤，恶性淋巴瘤，消化器官的肿瘤(胃癌，肠癌，肝癌，胆囊癌，胆道癌，胰腺癌)，肺癌，乳癌，睾丸癌，卵巢癌，子宫癌，前列腺癌，上颚癌，舌癌，口腔癌，咽喉癌，甲状腺癌，脑部肿瘤，各类肉瘤，骨肉瘤，白血病，神经系统肿瘤，膀胱肿瘤，皮肤癌，皮肤附属器官癌和皮肤转移癌。
动物试验证明，本发明的抗癌剂和增敏增效剂，低毒，适合于人和哺乳类动物经口或非经口给药。
本发明提供的多药耐药性肿瘤化疗中的抗癌剂和增敏增效剂，通常能与不影响药理学作用的辅助料配合制成经口或非经口给药的制剂。
本发明的显著的优点和技术上的进步本发明提供的具有同时抗肿瘤和增敏增效的作用的两种天然化合物，克服了传统上以灵芝混合提取物作为药物的缺陷，用现代生物技术作为发明的手段，明确了有效成分，运用纯化合物作为抗肿瘤药物和增敏增效剂，减少了未知成分引起负作用的可能性。这两种化合物具有显著的同时抗肿瘤和增敏增效的作用(体外和体内实验)，同时对人类正常细胞的细胞毒性较小，具有良好的应用前景。
图1为不同浓度的GA-Me和GA-T对多药耐药性KB-A-1细胞的抑制作用。
图2为不同浓度的GA-Me和GA-T增加KB-A-1细胞对阿霉素的敏感性。
图3为不同浓度的GA-Me和GA-T增加KB-A-1细胞内阿霉素的含量。
图4为不同浓度的GA-Me和GA-T增加KB-A-1细胞内Rhodanmin123的含量。
图5为GA-Me和GA-T增加荷瘤裸鼠对抗癌药阿霉素的敏感性。
图6为GA-Me和GA-T抑制裸鼠体内多药耐药性实体瘤的增殖。
图7为GA-Me和GA-T对KB，HeLa和95-D肿瘤细胞以及HLF人正常细胞的毒性作用。
具体实施例方式
下面通过实施例对本发明内容作进一步说明。所举之例并不限制本发明的保护范围。
实施例中的KB-A-1癌细胞株的供应商是中国科学院上海细胞库，其中文医学名称为口腔表皮样癌细胞株，英文医学名称为cell line of epidermalcarcinoma of the mouth。它是一种来源于人口腔上皮的癌细胞株，该细胞株表现出可诱导的多药耐药性特性。
实施例1GA-Me和GA-T对KB-A-1细胞的毒性作用GA-Me和GA-T均为从发酵生产的灵芝菌丝体中分离得到的纯天然产物，纯度大于99％，用DMEM培养液稀释成所需浓度。
采用噻唑蓝(MTT)快速比色法测定GA-Me和GA-T对HeLa细胞的毒性作用。将对数生长期细胞(106cell·ml-1)接种于96孔培养板，每孔0.2ml，分别加入一定浓度的GA-Me和GA-T处理，每浓度平行4孔，对照组加等量体积的培养液，置37℃，5％CO2及饱和湿度的培养箱培养1-4天，实验终止前4小时每孔加入5mg·ml-1MTT 10μl，培养结束后每孔加入0.04N二甲基亚砜(DMSO)，每孔150μl，振荡10min，待MTT还原产物完全溶解，用BioRad 550型酶标仪，以550nm为实验波长，655nm为参照波长测定其吸收度，计算药物对细胞的抑制率，并以药物的不同浓度和细胞的抑制率作图，确定细胞的半数抑制浓度(IC50)。实验结果如下图1所示。
图1中，1为GA-Me，2为GA-T。
以上实施例说明，GA-Me和GA-T均具有良好的杀灭KB-A-1肿瘤细胞的作用，而且这种抑制效果还呈现出剂量依赖性。
实施例2GA-Me和GA-T增加KB-A-1细胞对抗癌药阿霉素的敏感作用GA-Me和GA-T均为从发酵生产的灵芝菌丝体中分离得到的纯天然产物，纯度大于99％，用RPMI-1640培养液稀释成所需浓度。采用噻唑蓝(MTT)快速比色法测定GA-Me和GA-T对95-D细胞的毒性作用。将对数生长期细胞(106cell·ml-1)接种于96孔培养板，每孔0.2ml，在5μg/ml灵芝酸的存在下，分别加入一定浓度的阿霉素处理，每浓度平行4孔，对照组加等量体积的培养液，置37℃，5％CO2及饱和湿度的培养箱培养3天，实验终止前4小时每孔加入5mg·ml-1MTT 10μl，培养结束后每孔加入0.04N DMSO，每孔150μl，振荡10min，待MTT还原产物完全溶解，用BioRad 550型酶标仪，以550nm为实验波长，655nm为参照波长测定其吸收度，计算阿霉素对癌细胞的抑制率，并以药物的不同浓度和细胞的抑制率作图，确定IC50。实验结果见图2。图2中，3为阿霉素，4为阿霉素与5％的GA-T的混合物，5为阿霉素与5％的GA-Me的混合物。
以上实施例说明，GA-Me和GA-T均具有良好的增加KB-A-1细胞对阿霉素的敏感性作用。
实施例3
GA-Me和GA-T增加KB-A-1细胞内阿霉素的含量细胞内的阿霉素含量用高效液相色谱(HPLC)检测。敏感性对数生长期细胞接种在24孔板中，浓度为105个/ml，细胞在阿霉素和灵芝酸联合作用下处理4小时，对照为单独阿霉素处理的细胞。处理后的细胞以冷PBS洗三次后，悬浮细胞，统一各组细胞浓度，加入0.5m水，反复冻融三次，12000rpm离心30分钟，上清用于阿霉素检测。分析条件为检测器为荧光监测器，激发和发射波长为495和560nm。流动相为5mM的磷酸/甲醇/乙腈/异丙醇8∶7∶2∶3(体积比)，使用前用0.45μm滤膜过滤，流速为0.8ml/min。结果见图3。其中6为阿霉素，7为GA-T，8为GA-Me。
以上实施例说明，GA-Me和GA-T使癌细胞内的抗癌药物浓度增加，增加了多药耐药性癌细胞对阿霉素的敏感性。
实施例4GA-Me和GA-T增加KB-A-1细胞内Rhodanmin123的含量细胞内累集的Rhodamine 123用荧光分光光度计检测。敏感性对数生长期细胞接种在96孔板中，浓度为105个/孔，细胞首先贴壁培养4小时，然后细胞在灵芝酸作用下处理4小时，对照为单独阿霉素(0.75μM)处理和单独灵芝酸处理的细胞。然后加入罗丹名123，终浓度为20μM，继续培养60分钟。处理后的细胞以冷PBS洗三次后，悬浮细胞，统一各组细胞浓度，加入0.5ml水，反复冻融三次，12000rpm离心30分钟，上清用于Rhodamine 123检测。荧光分光光度计，激发和发射波长分别为485nm和530nm。结果如图4所示。图中，9为阿霉素，10为GA-T，11为GA-Me。
以上实施例说明，GA-Me和GA-T能使癌细胞内的抗癌药物浓度增加，增加了多药耐药性癌细胞对抗癌药物的敏感性。
实施例5
GA-Me和GA-T增加荷瘤裸鼠对阿霉素的敏感性实验采用裸鼠进行实验。敏感性的对数生长期KB-A-1细胞接种在6只裸鼠腋下，细胞浓度为105个/0.2ml，SPF条件下生长15天。处死裸鼠，剥取实体瘤，无菌条件下剪碎至0.5mm大小，用大号接种针打入实验裸鼠腋下，左右各一。每组5只，三天后进行对照药物和阳性药物给药。对照药物和阳性药物均以腹腔注射方式给药。对照药物给药完5小时后，阳性药物给药，隔四天后阳性药物再次给药，共给药2次，对照药物连续给药12天，停药6天后处死裸鼠，剥取实体瘤，称重并分析实体瘤的抑制率。
肿瘤抑制率(％)＝[(对照组实体瘤平均重量数-给药组实体瘤平均重量数)/对照组实体瘤平均重量数]×100结果见附5，在图5中阳性药物阿霉素(1mg/kg)组，为图中的12；阳性药物阿霉素(1mg/kg)+灵芝酸T(25mg/kg)组，为图中的13；阳性药物阿霉素(1mg/kg)+灵芝酸Me(25mg/kg)组，为图中的14。
以上实施例说明，GA-Me和GA-T能增加荷瘤裸鼠对阿霉素的敏感性，具有增敏增效作用。
实施例6GA-Me和GA-T抑制裸鼠体内多药耐药性实体瘤的实验采用裸鼠进行实验。无菌条件下取对数生长期的KB-A-1细胞，制备成约2.5×105/mL细胞悬液，于两只裸鼠上肢下侧皮下接种0.2mL/鼠，生长15天后，处死动物，无菌条件下剖取小鼠的实体瘤，剪开，除去瘤中心的死细胞，剪碎外表活组织至0.5mm大小，用PBS清洗。于实验裸鼠上肢下侧皮下接种，生长3天后，待长出米粒大小，可触摸到的硬实体瘤后，按实验设计方案给药，5周后处死各组动物，剖取各组小鼠的实体瘤，测每鼠实体瘤的重量，按下列公式计算肿瘤抑制率肿瘤抑制率(％)＝[(对照组实体瘤平均重量数-给药组实体瘤平均重量数)/对照组实体瘤平均重量数]×100结果见附6，在图6中灵芝酸T(25mg/kg)组，图中为15；灵芝酸Me(25mg/kg)组，图中为16。
以上实施例说明，GA-Me和GA-T能抑制裸鼠体内多药耐药性实体瘤的生长，具有抑制多药耐药性肿瘤增殖的活性。
实施例7将1重量份的GA-Me或GA-T与199份蒸馏水混合均匀，分装，即获得口服液。
实施例8将1重量份的GA-Me或GA-T与199重量份的注射用生理盐水混合均匀，即获得注射液。
实施例9采用噻唑蓝(MTT)快速比色法测定GA-Me和GA-T对KB，HeLa和95-D肿瘤细胞以及HLF人正常细胞的毒性作用。将对数生长期的各种细胞(106cell·ml-1)接种于96孔培养板，每孔0.2ml，分别加入50，100，150和200μg ml-1浓度的GA-Me和GA-T处理，每浓度平行4孔，对照组加等量体积的培养液，置37℃，5％CO2及饱和湿度的培养箱培养1-4天，实验终止前4小时每孔加入5mg·ml-1MTT 10μl，培养结束后每孔加入0.04N二甲基亚砜(DMSO)，每孔150μl，振荡10min，待MTT还原产物完全溶解，用BioRad 550型酶标仪，以550nm为实验波长，655nm为参照波长测定其吸收度，计算药物对细胞的抑制率，并以细胞的半数抑制浓度(IC50)作图。统计实验数据的结果如图7所示。图中，17为GA-T，18为GA-Me。
以上实施例说明，GA-Me和GA-T均具有良好杀灭KB，HeLa和95-D肿瘤细胞株的作用，而对人体正常细胞株的毒性较小。
权利要求
1.灵芝酸在制备多药耐药性癌症化疗增敏增效剂和抑制剂中的应用，所说的灵芝酸为灵芝酸Me或灵芝酸T。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所说的多药耐药性肿瘤为医学上所属的各类肿瘤，包括良性肿瘤和恶性肿瘤。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所说的恶性肿瘤包括恶性黑色素瘤，恶性淋巴瘤，消化器官的肿瘤(胃癌，肠癌，肝癌，胆囊癌，胆道癌，胰腺癌)，肺癌，乳癌，睾丸癌，卵巢癌，子宫癌，前列腺癌，上颚癌，舌癌，口腔癌，咽喉癌，甲状腺癌，脑部肿瘤，各类肉瘤，骨肉瘤，白血病，神经系统肿瘤，膀胱肿瘤，皮肤癌，皮肤附属器官癌或皮肤转移癌。
4.一种组合物，包括治疗有效量的灵芝酸Me或灵芝酸T和医药学上可接受的载体。
全文摘要
本发明公开了灵芝酸Me(Ganoderic acid Me)和灵芝酸T(Ganoderic acid T)在制备多药耐药性肿瘤生长或增殖的抑制剂和增敏增效剂中的应用。体内和体外实验研究证明灵芝酸Me或灵芝酸T具有显著的抑制人类多药耐药性肿瘤及细胞生长或增殖作用以及增加多药耐药性肿瘤及细胞对抗癌药物敏感性的作用，同时对正常细胞的毒性较小，具有良好的应用前景。
文档编号A61K31/704GK1823788SQ20051011230
公开日2006年8月30日 申请日期2005年12月29日 优先权日2005年12月29日
发明者钟建江, 刘建文, 唐文, 洪映波 申请人:华东理工大学, 上海颖兴生物科技有限公司