低氘水作为肿瘤多药耐药逆转剂的应用

低氘水作为肿瘤多药耐药逆转剂的应用
【专利摘要】本发明属于医药领域，涉及低氘水(DDW)在逆转肿瘤多药耐药性和抗肿瘤药物增敏剂的应用。低氘水是天然产物，具有肿瘤细胞多药耐药的逆转的作用，可以作为肿瘤多药耐药的逆转剂；同时，低氘水具有增加肿瘤多药耐药细胞对抗肿瘤药物的敏感性的作用，可以作为抗肿瘤细胞药物增敏剂。本发明提供了低氘水作为肿瘤治疗的辅助治疗剂，可选择性的单独使用或联合一种或一种以上抗肿瘤药物一起使用。本发明还涉及在日常的肿瘤治疗中，单独使用或联合一种或一种以上抗肿瘤药物使用低氘水，所述低氘水含氘量为0.01-100ppm。
【专利说明】
低氘水作为肿瘤多药耐药逆转剂的应用
技术领域
[0001]本发明属于肿瘤多药耐药的逆转以及增加肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性的医药学领域，具体涉及低氖水(deuterium depleted water, DDff)在逆转肿瘤多药耐药性和抗肿瘤药物增敏剂的应用。
【背景技术】
[0002]恶性肿瘤(癌症)是导致人类死亡的主要原因之一，据世界卫生组织报告，每年有700多万人死于肿瘤，其中60%死于肺癌、胃癌、乳腺癌、结直肠癌、口腔癌、肝癌、宫颈癌及食管癌，死于肿瘤者约占所有死亡人数的13%。随着世界人口日趋老龄化，预计全世界癌症死亡人数将继续上升，到2030年可能超过1310万。化疗是目前临床治疗恶性肿瘤的主要手段之一，肿瘤细胞多药耐药性(multidrug resistance，MDR)的产生是目前肿瘤化学药物治疗失败的一个主要原因。多药耐药性是指肿瘤细胞在接受抗癌药物治疗过程中对一种抗肿瘤药物产生抗药性的同时，对结构和作用靶点完全不同的抗肿瘤药物产生交叉抗药性。多药耐药一旦产生，更换药物种类或增加药物剂量，反而会进一步诱导耐药的产生和产生更强的细胞毒性。据美国癌症协会估计，90%以上的肿瘤患者死于不同程度的多药耐药。多药耐药的研究已成为目前肿瘤治疗及药物研究的热点。
[0003]肿瘤细胞的多药耐药性的产生有多种机制，原因极其复杂，主要包括药物吸收减少，细胞内药物栗出增多，细胞凋亡的抑制，药物活性作用减弱，细胞解毒作用增强，抗肿瘤药物的代偿性代谢增强，DNA损伤修复能力增强，靶分子的改变等。研究表明，肿瘤的多药耐药的形成过程复杂，这些耐药机制常常同时存在，参与肿瘤多药耐药的产生。ABC结合盒转运体(ATP-binding cassette transporters)是跨膜转运蛋白超家族，可能量依赖性的将结构和作用机制不同的抗癌药物栗出细胞外，在多药耐药形成中发挥重要作用。调控ABC转运蛋白的表达与功能成为有效逆转MDR策略之一。
[0004]目前针对ABC转运蛋白介导的肿瘤多药耐药的逆转策略有很多，其中基于化学药物逆转策略研究的最多。早在1981年Tsuruo等，就发现钙通道阻滞剂维拉帕米(verapamil)能逆转P388/VCR细胞对长春新碱的耐药性，此后又发现了环孢素A、奎宁等非特异性MDR逆转剂。虽然后来在各种化学药物的基础上进行结构改造，但由于化学药物的毒副作用，严重限制了其临床应用的前景。值得注意的是，当人们还在为努力解决化学药物的毒副作用的时候，研究人员发现许多大然产物及其衍生物具有逆转ABC转运蛋白介导的肿瘤MDR作用，如紫杉烷类衍生物、黄酮类衍生物、麦角生物碱等。由于天然产物及其衍生物具有高效低毒的特点，使其日益受到医药学界的重视并逐渐成为研究的热点。
[0005]人体中高浓度的氘能抑制某些生物酶破坏氢键的能力，损伤DNA修复酶，在DNA的螺旋结构中产生附加应力，造成双螺旋的错配、断裂、替换，是核糖核酸排列混乱，甚至重新合成，影响遗传因子功能，出现突变、恶性肿瘤。研究表明，随着生物体内到浓度的增加，氢键间交联发生改变，从而使细胞质刚性显著增加，有丝分裂受阻。大然水中，氘和氕的比率(D/Η)大约是1: 6600，即水中氘的体积分数约为0.015%。以水为原料，人们采用特殊的分离技术将水中的氘分离，降低水中氘的浓度，成为制备低氘水的主要方法。饮用低氘水可以预防疾病、延缓衰老、活化机体免疫细胞，特别是对某些肿瘤等疾病的辅助治疗，是近年来国内外核医学领域和水生理学领域对低氘水应用研究的重大突破。目前，关于低氘水作为肿瘤治疗的辅助治疗逆转肿瘤多药耐药性，增加肿瘤细胞药物敏感性尚未见报道。

【发明内容】

[0006]本发明提供了氘含量在0.0l-1OOppm的低氘水(DDW)作为肿瘤多药耐药逆转剂中的新用途。
[0007]本发明涉及具有0.0l-1OOppm氘含量的低氘水作为抗肿瘤细胞药物增敏剂中的应用。
[0008]所述的肿瘤可以是对化疗药物产生耐药性的鼻咽癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、宫颈癌或结直肠癌等各种肿瘤。所述的肿瘤细胞可以是对化疗药物产生耐药性的肺癌、肝癌、乳腺癌或宫颈癌等各种肿瘤细胞。例如实施例中所采用的多药耐药肿瘤A549/DDP细胞。
[0009]所述的抗肿瘤药物可以是抗肺癌药物、抗肝癌药物或抗乳腺癌药物等各种已知抗肿瘤药物。
[0010]低氘水作为肿瘤多药耐药逆转剂与抗肿瘤细胞药物增敏剂，可以为药物辅助溶剂，即作为药物载体，可与多种肿瘤药物组合，其组合配方可以是口服药剂、注射药剂或洗液，所述口服药剂可以为:滴丸、软胶囊、缓释制剂、控释制剂、糖浆剂或口服液等；所述注射药剂可以为:静脉注射剂、静脉注射乳剂、腹腔注射剂、腹腔注射乳剂、肌肉注射剂、肌肉注射乳剂、皮下注射剂或皮下注射乳剂等；所述洗液可以为:皮肤洗液、吸入性溶液或灌肠溶液等。
[0011]本发明所述的低氘水作为肿瘤多药耐药逆转剂以及抗肿瘤细胞增敏剂，可以单独使用或与一种或一种以上的抗肿瘤药物组成的组合物。该组合物包括低氘水和一种或一种以上的抗肿瘤药物。所述的抗肿瘤药物为已知的具有抗肿瘤活性的化学药物、中草药等。低氘水也可以与外科手术联合使用，与放射性治疗联合使用。
[0012]本发明所述的低氘水作为肿瘤多药耐药逆转剂以及抗肿瘤细胞增敏剂的机制是降低天然水中氘的含量。
[0013]另外，本发明还提供了一种体外增加多药耐药肿瘤细胞对已知的抗肿瘤药物的敏感性的实验方法，即低氘水作为培养基溶剂溶解培养基粉末，使用此培养基培养细胞。
[0014]所述的肿瘤可以是对化疗药物产生耐药性的鼻咽癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、宫颈癌或结直肠癌等各种肿瘤。所述的肿瘤细胞可以是对化疗药物产生耐药性的肺癌、肝癌、乳腺癌或宫颈癌等各种肿瘤细胞。例如实施例中所采用的多药耐药肿瘤A549/DDP细胞。
[0015]所述的抗肿瘤药物可以是抗肺癌药物、抗肝癌药物或抗乳腺癌药物等各种已知抗肿瘤药物。
[0016]上述培养基使用氘浓度为0.0l-1OOppm的低氘水配制。多药耐药肿瘤细胞能在抗肿瘤药物浓度不变的条件下，对抗肿瘤药物产生更强的敏感性，并且随着培养基中氘浓度的下降，多药耐药肿瘤细胞在抗肿瘤药物浓度不变的条件下，对抗肿瘤药物的敏感性更强。
[0017]本发明提供了低氘水作为肿瘤多药耐药逆转剂以及抗肿瘤细胞药物增敏剂的新用途。水是天然产物，通过分离技术把水中氘分离出来，降低水中氘的浓度，并不改变水的大然性质。因此低氘水作为肿瘤多药耐药逆转剂以及抗肿瘤细胞药物增敏剂应用于临床，不但本身不具有任何毒副作用，还可以克服肿瘤细胞的多药耐药性，减少抗肿瘤药物的毒性，为癌症的治疗提供了更好的方法。
【附图说明】
[0018]图1:细胞毒性MTT实验。(A)显示的是低氘水培养基(50ppm)或普通培养基(150ppm)和顺铂联合作用肺癌A549细胞；(B)显示的是低氘水培养基(50ppm)或普通培养基(150ppm)和顺铂联合作用肺癌多药耐药A549/DDP细胞。图中横坐标为培养基中顺铂的浓度，纵坐标为细胞的抑制率。实验重复3次。
[0019]图2:平皿克隆实验。(A)显示的是低氘水培养基(50ppm)或普通培养基(150ppm)和顺铂联合作用肺癌A549细胞；(B)显示的是低氘水培养基(50ppm)或普通培养基(150ppm)和顺铂联合作用肺癌多药耐药A549/DDP细胞。(C)是对㈧和⑶图中细胞克隆数目的统计结果。实验重复3次。*表示P <0.05。
[0020]图3:流式细胞术。(A)显示的是低氘水培养基(50ppm)或普通培养基(150ppm)和顺铂联合作用肺癌多药耐药A549/DDP细胞。(B)是对(A)图细胞周期变化的统计结果。实验重复3次。*表示P < 0.05。
[0021]图4:细胞ATP酶活力检测。(A)显示的是低氘水培养基(50ppm)或普通培养基(150ppm)和顺铂联合作用肺癌A549细胞；(B)显示的是低氘水培养基(50ppm)或普通培养基(150ppm)和顺铂联合作用肺癌多药耐药A549/DDP细胞。实验重复3次。*表示P< 0.05，** 表示 P < 0.01.
[0022]图5:Western blot实验检测肺癌多药耐药A549/DDP细胞多药耐药相关蛋白MRPl、MDRl、ATP的表达情况。
具体实施方案
[0023]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以相互组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再累述。
[0024]以下实施例所用的低氘水购自苏州奥特泉公司，氘含量为50ppm ;顺铂购自Sigima公司，纯度为X ;新生牛血清(NBCS)与RP頂1640培养基购自Gibco ；PI染料、RNaseA与MTT试剂购自北京索莱宝公司；ATP酶活性检测试剂盒购自南京建成公司；anti_ATP 和 ant1-MDRl 购自 Santa Cruz ；ant1-MRP-1(C-19)购自 R&D Systems ；ant1-β-actin (13E5)贝勾自 Abeam ;Alexa Flour 700 goat ant1-mouse IgG 和 Alexa Flour800 goat ant1-rabbit IgG antibody 贝勾自 invitrogen。
[0025]细胞培养
[0026]肺癌A349细胞培养于含10%新生牛血清与I %青链霉素的1640培养基中；肺癌多药耐药细胞A549/DDP细胞培养于含10%新生牛血清、I %青链霉素和I μ g/ml的1640培养基中以维持细胞的耐药性。
[0027]实施例1:
[0028]MTT法检测低氘水与顺铂对肺癌A549细胞和肺癌多药耐药A549/DDP细胞抑制影响的作用。用不含血清的1640培养基饥饿培养肺癌A549细胞和肺癌多药耐药A549/DDP细胞12小时后，用含EDTA胰酶消化，分别以5 X 13个细胞/孔的密度接种于96孔板中。于种有肺癌A549细胞的96孔板中分别加入100 μ I含顺铂浓度为0、0.5、1.0,1.5,2.0、
2.5、3.0 μ g/ml的普通1640培养基，于种有肺癌多药耐药A549/DDP细胞的96孔板中分别j^0、2、4、6、8、10、12、14、16yg/ml的低氘水培养基(50ppm)。培养24h后，每孔分别加入20 μ I的MTT溶液继续培养4b，吸去培养液，每孔分别加入150 μ I 二甲基亚砜(DMSO)，振荡lOmin。在490nm博长短检测各孔的吸光值(OD)。抑制率(％ ) = (1-实验组OD/对照组OD) X 100%。实验重复三次。结果显示，低氘水作为顺铂的辅助治疗剂，对肺癌A549细胞及肺癌多药耐药A549/DDP细胞的生存率有抑制作用，对肺癌多药耐药A549/DDP细胞抑制作用更加明显。结果见图1。
[0029]实施例2:
[0030]平皿克隆试验低氘水与顺铂对肺癌A549细胞和肺癌多药耐药A549/DDP细胞克隆形成能力的影响。用不含血清的1640培养基饥饿培养肺癌A549细胞和肺癌多药耐药A549/DDP细胞12小时后，用含EDTA胰酶消化，分别以500个细胞/孔的密度接种于6孔板中。相应地，孔板中每孔分别加入氘浓度为150ppm、75ppm、50ppm的培养基，培养基中含顺铂浓度为I μ g/ml ο 2-3周后，当孔板中细胞克隆集落快融和时，终止培养。吸去培养基，用PBS小心清洗2-3次。每孔分别加入4%多聚甲醛3ml固定15min ;吸去多聚甲醛，每孔分别加入结晶紫染液染色20min，回收结晶紫。用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。计算细胞克隆集落数。实验重复三次。结果显示，随着培养基中氘浓度的下降，在顺铂浓度不变的条件下，肺癌A549细胞及肺癌多药耐药A549/DDP细胞的克隆形成能力减弱，其中对肺癌多药耐药A549/DDP细胞的克隆形成能力抑制更加明显。结果见图2.
[0031]实施例3:
[0032]流式细胞术检测低氘水与顺铂对肺癌多药耐药A549/DDP细胞的细胞周期的影响。用不含血清的1640培养基饥饿培养肺癌多药耐药A549/DDP细胞12小时后，用含EDTA胰酶消化，以I X 14个细胞/孔的密度接种于6cm培养皿中。分别加入氘浓度为150ppm、100ppm、75ppm、50ppm的含顺铂浓度为I μ g/ml的培养基培养24h后，吸去培养基，用PBS清洗2-3次，用不含EDTA胰酶消化并收集细胞。1500rpm/min的转速离心3min，弃上清；PBS吹打重悬，1500rpm/min离心3min ;弃上清；重复一次重悬、离心、弃上清；加入70%乙醇lml，4°C固定过夜。1500rpm/min离心3min，弃上清；重复两次重悬、离心、弃上清。每管加入500 μ I染色液(500 μ I PBS+2.5 μ I ΡΙ+2 μ I RNaseA)，室温避光30min。流式细胞仪上机分析，观察细胞周期分布特征。实验重复三次。从细胞周期分布图可以看出，随着培养基中氘浓度的下降，在顺铂浓度不变的条件下，肺癌多药耐药A549/DDP细胞的生长受到抑制，主要表现为Gl其增加，S期减少，证明细胞生长受到抑制，细胞的生长更多的停留在合成前期。结果见图3.
[0033]实施例4:
[0034]超微量ATP酶活力检测实验检测低氘水与顺铂对肺癌多药耐药A549/DDP细胞ATP酶的活力的影响。用不含血清的1640培养基饥饿培养肺癌多药耐药A549/DDP细胞12小时后，用含Η)ΤΑ胰酶消化，以IX 13个细胞/孔的密度接种于6cm培养皿中。分别加入氘浓度为150ppm、100ppm、75ppm、50ppm的含顺铀浓度为I μ g/ml的培养基培养24h后，吸去培养基，用生理盐水清洗2-3次，胰酶消化并收集细胞。1500rpm/min离心3min，弃上清；生理盐水再清洗I次，1500rpm/min离心3min，弃上清；加入200 μ I生理盐水，吹打混匀后，超声粉碎，用NanoDrop微量紫外分光光度计测定蛋白含量。ATP酶活力测试按超微量ATP酶试剂盒说明书操作。ATP酶活力计算公式:组织中ATPase活力(U/mgprot)=(测定管OD值-对照管OD值)/ (标准管OD值-空白管OD值)X标准管浓度(0.02 μ mo I/ml) X 6 X 7.8/匀浆蛋白浓度(mgprot/ml)。实验重复三次。结果显示，随着培养基中氘浓度的下降，在顺铂浓度不变的条件下，肺癌多药耐药A549/DDP细胞的Na K-ATP酶、Ca Mg-ATP酶与Total-ATP酶都出现了不同程度的下降。证明低氘水能通过抑制肿瘤细胞中ATP酶的活性，从而达到抑制肿瘤细胞的增殖、代谢、迀移和凋亡等细胞活动。结果见图4.
[0035]实施例5:
[0036]Westernblot检测检测低氘水与顺铂对ATP、MRP1与MDRl蛋白表达的影响。用不含血清的1640培养基饥饿培养肺癌多药耐药A549/DDP细胞12小时后，用含EDTA胰酶消化，以5X 15个细胞/孔的密度接种于6cm培养皿中。分别加入氘浓度为150ppm、100ppm、75ppm、50ppm的含顺铂浓度为I μ g/ml的培养基培养24h后，吸去培养基，PBS清洗2_3次，加入蛋白酶抑制剂和细胞裂解液，于冰上裂解15min，细胞刮子将细胞刮下收集。4°C，12000rpm/min离心15min，吸取上清。用NanoDrop微量紫外分光光度计测定蛋白含量。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，将蛋白转移到PVDF膜上。PVDF膜浸泡于封闭液中，室温封闭2h0 PBS清洗3次，每次1min ;根据目标蛋白大小，分别孵育ATP、MRPU MDR1,β -actin为内参蛋白，4°C孵育过夜。PBST清洗3次，每次1min ;根据一抗属性，分别闭关孵育二抗 Alexa Flour 700 goat ant1-mouse IgG 和 Alexa Flour 800 goat ant1-rabbitIgG antibody两个小时。PBST避光清洗3次，每次5min。Odyssey双色红外激光成像系统显影。实验重复三次。结果显示，随着培养基中氘浓度的下降，在顺铂浓度不变的条件下，肿瘤多药耐药相关蛋白MDRUMRP1与ATP的表达都出现了不同程度的减弱。结果见图5。
[0037]结论:
[0038]低氘水作为肿瘤的辅助治疗剂，联合抗肿瘤药物治疗多药耐药肿瘤时，能够逆转肿瘤的多要耐药性以及增加肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性。
【主权项】
1.低氘水(DDW)作为肿瘤多药耐药逆转剂的应用，其特征在于，所述的应用是指低氘水在制备抗肿瘤药物的耐药逆转剂以及抗肿瘤药物细胞增敏剂的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于低氘水是肿瘤多药耐药逆转剂，或是抗肿瘤药物的增敏剂。3.根据权利要求1所述的应用，所述的肿瘤包括肺癌、肝癌、乳腺癌、口腔癌、宫颈癌、结直肠癌、胰腺癌、肾癌、前列腺癌、甲状腺癌、皮肤癌或白血病。4.根据权利I所述的应用，其特征在于，低氘水作为肿瘤治疗的辅助治疗，可单独使用或联合一种或一种以上的抗肿瘤药物使用。5.根据权利5所述的应用，其特征在于，所述的联合应用的组合配方可以是口服药剂、注射药剂或洗液，所述口服药剂可以为:滴丸、软胶囊、缓释制剂、控释制剂、糖浆剂或口服液等；所述注射药剂可以为:静脉注射剂、静脉注射乳剂、腹腔注射剂、腹腔注射乳剂、肌肉注射剂、肌肉注射乳剂、皮下注射剂或皮下注射乳剂等；所述洗液可以为:皮肤洗液、吸入性溶液或灌肠溶液。6.根据权利5所述的应用，单独使用或联合一种或一种以上的抗肿瘤药物使用的低氘水，其氖含量为0.0l-1OOppmo7.根据权利5所述的应用，其中所述的抗肿瘤药物可以是:长春新碱、柔红霉素、紫杉醇、5-氟尿嘧啶、顺铂、卡铂、赫赛汀、特罗凯、健择、吉西他滨、阿伐斯汀、爱宁达、安得卡、依立适、诺雷德、希罗达、多柔比星、伊立替康。8.一种增加体外增加多药耐药肿瘤细胞对已知的抗肿瘤药物的敏感性的实验方法，其特征在于，耐药肿瘤细胞的培养基由低氘水配制。9.根据权利9所述的方法，配制多药耐药肿瘤细胞的培养基的低氘水的含氘量为0.01-100ppmo10.根据权利9所述的方法，根据权利要求1所述的应用，所述的肿瘤包括肺癌、肝癌、乳腺癌、口腔癌、宫颈癌、结直肠癌、胰腺癌、肾癌、前列腺癌、甲状腺癌、皮肤癌或白血病D
【文档编号】A61P35/00GK105878270SQ201410858081
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年12月31日
【发明人】杨慧龄, 张瀚彬, 祝葆华, 王宏强, 陈楚言
【申请人】广东医学院