专利名称：间歇性低氧对心肌梗塞的治疗作用的制作方法
技术领域：
本发明属于医学领域，涉及间歇性低氧在心肌梗塞治疗中的用途。
背景技术：
氧是人类及绝大多数生物赖以生存的必需条件，也是机体生理功能调节的重要因子。低氧是生命发育的基本环境，人类胚胎是在低氧环境中发育的，出生后仍有部分组织处于低氧环境。因此低氧研究涉及生命科学的基本问题，研究低氧与人体组织、器官和细胞的损伤及其保护具有重要的医学价值。
众所周知，心肌梗塞随缺血程度的加重和梗塞面积的扩大，对人体造成的损害是呈进行性发展的。根据世界卫生组织的报道，在西方国家急性冠状动脉阻塞是导致死亡的主要原因，到2020年它将成为全世界的主要死因。Yellow，Downey等指出，现有的治疗手段对于缺血性心脏病的干预相当有限(Yellon DM，Downey JM.Preconditioning the myocardiumfrom cellular physiology to clinicalcardiology.Physiol Rev.2003；831113-1151.)。因此迫切需要一种更为有效的干预手段，尤其是新的方法，来限制心肌梗塞病变的进展程度。
在过去的几十年中，科学家们发现长期生活在高原地区的人们其心肌梗塞的发生率和死亡率都很低，这引起了人们对低氧研究的兴趣。这些流行学上的发现已经在实验室中得到了证实。1973年Meerson等报道每天在模拟高原环境中预生活5小时，一周连续5天，可使大鼠因冠状动脉阻塞引起的死亡率下降84％，心肌梗塞面积减少35％(Meerson FZ，Gomzakov OA，Shimkovich MV.Adaptation to high altitude hypoxia as a factor preventing development ofmyocardial ischemic necrosis.Am J Cardiol.1973；3130-34.)。在低压氧舱中给予低氧预适应后，可使动物在急性心肌缺血后，心脏颤动的发作次数和死亡率下降2-3倍，并且使心梗后的瘢痕减少1/3，还可促进瘢痕附近血管的增生(Meerson FZ，Ustinova EE，Orlova EH.Prevention and elimination of heartarrhythmias by adaptation to intermittent high altitude hypoxia.Clin Cardiol.1987；10783-789.)。在实验中研究慢性低氧常在高原低氧环境下进行，或是在实验室模拟高原环境的低压氧舱中进行。但是，这些文献说明的是低氧预适应后，心肌梗塞的病症减轻，即低氧处理发生在心肌梗塞之前，是一种预防手段而非治疗手段。
间歇性低氧(intermittent hypoxia，IH)不同于持续性低氧，它是在低氧环境中保持一段时间，然后恢复至常氧环境。近年来，许多研究表明，间歇性低氧具有与缺血预适应(ischemia preconditioning，IP)相类似的对心肌的保护作用。出生后的大鼠经间歇性低氧预适应5周后，能明显改善缺氧再灌注(ischemia-reperfusion)损伤后的心功能。间歇性低氧提高心肌对缺血再灌注损伤的耐受性，也能显著提高心肌的抗氧化能力和对氧的利用能力。雄性S.D大鼠在间歇性低氧环境中生活28天和42天后，与对照组相比具有明显的抗心肌缺血和再灌性心律失常作用，此抗心律失常作用在间歇性低氧14天后逐渐发生，并可有效维持脱离低氧处理后的二周左右时间。间歇性低氧可促进大鼠心肌组织微血管生成，增加冠脉流量，也可通过调控Bcl-2/Bax的表达抑制缺血再灌后心肌细胞的凋亡。
目前在心肌缺血损伤的研究方面，都是将间歇性低氧作为一种预适应手段(IH preconditioning)，提高心肌对缺血缺氧的抵抗力，从而起到心肌保护作用。然而，临床上迫切需要解决的却是在心肌梗塞发生后如何减少梗死面积和缺血损伤区域。但是，间歇性低氧是否能有效的改善已经发生的急性或亚急性心肌梗塞，即是否具有缓解或治疗作用尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供氧在治疗心肌梗塞中的应用。
本发明的另一目的在于提供间歇性低氧在心肌梗塞治疗中的用途。
在本发明的第一方面，提供一种氧气舱设备的用途，用于制备治疗心肌缺血、梗塞的设备，所述的氧气舱设备包括一个封闭的舱体，所述舱体中包括氧气供给装置，氧气排出装置，以及含氧量检测装置，其中，所述的氧气供给装置提供氧气，使得氧气舱内的氧气满足以下条件氧分压Po2＝84±20mmHg(或11.2±2.8kPa)。
在本发明的第二方面，提供一种氧气的用途，用于制造治疗心肌缺血、梗塞的设备或制剂。
在本发明的一个优选例中，所述的氧气在治疗心肌缺血、梗塞的设备中以低氧-常氧相间隔的方式给予，所述低氧-常氧相间隔的时间为低氧6±2小时，常氧18±2小时，并且，所述的低氧为氧分压Po2＝84±20mmHg(或11.2±2.8kPa)，所述的常氧为氧分压Po2＝159±20mmHg(或20.7kPa±3kPa)。
在本发明的一个优选例中，所述低氧-常氧相间隔的时间为低氧6±1小时，常氧18±1小时，并且，所述的低氧为氧分压Po2＝84±10mmHg(或11.2±1.4kPa)，所述的常氧为氧分压Po2＝159mmHg±10mmHg(或20.7kPa±1.5kPa)。
在本发明的第三方面，提供一种治疗哺乳动物心肌缺血、梗塞的方法，采用间歇性低氧处理来实施治疗，包括步骤使所述哺乳动物在低氧-常氧相间隔的环境中进行治疗，并且，每天将患有心肌梗塞的哺乳动物置于低氧环境中生活6±2小时，其余18±2小时生活于常氧环境；所述的低氧为环境中的氧分压Po2＝84±20mmHg(或11.2±2.8kPa)，所述的常氧为氧分压Po2＝159mmHg±20mmHg或20.7kPa±2.8kPa；连续治疗7-50天。
在本发明的一个优选例中，每天将患有心肌梗塞的哺乳动物置于低氧环境中生活6±1小时，其余18±1小时生活于常氧环境；所述的低氧为环境中的氧分压Po2＝84±10mmHg或11.2±1.4kPa，所述的常氧为氧分压Po2＝159mmHg±10mmHg或20.7kPa±1.5kPa；连续治疗7-35天。
在另一优选例中，每天将患有心肌梗塞的哺乳动物置于所述低氧环境中生活6小时，其余18小时生活于常氧环境；所述的低氧为环境中氧分压Po2＝84±20mmHg或11.2±2.8kPa，所述的常氧为氧分压Po2＝159mmHg±20mmHg或20.7kPa±2.8kPa；连续治疗10-35天。
在本发明的第四方面，提供一种提高患心肌梗塞的哺乳动物心肌组织中内新生毛细血管的方法，将所述哺乳动物置于低氧-常氧相间隔的环境中，每天在低氧环境中生活6±2小时，其余18±2小时生活于常氧环境；所述的低氧为环境中的氧分压Po2＝84±20mmHg或11.2±2.8kPa，所述的常氧为氧分压Po2＝159mmHg±20mmHg或20.7kPa±2.8kPa；连续治疗7-50天。
在本发明的一个优选例中，每天在低氧环境中生活6±1小时，其余18±1小时生活于常氧环境；所述的低氧为环境中的氧分压Po2＝84±10mmHg或11.2±1.4kPa，所述的常氧为氧分压Po2＝159mmHg±10mmHg或20.7kPa±1.4kPa；连续治疗7-35天。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图1.实验安排方案及实验动物分组图。大鼠分成不同的实验组，各自进行不同的结扎或手术处理。MI-Nor组行冠状动脉左前降支结扎手术+正常给氧；MI-IH组行冠状动脉左前降支结扎手术+间歇性低氧处理。另两组各自进行假手术，分别作为MI-Nor组和MI-IH组的对照。S-Nor组假手术+正常给氧；S-IH组假手术+间歇性低氧处理。
图2.间歇性低氧治疗对大鼠心脏射血分数(EF)、左心室舒张末期内径(LVDD)的影响。射血分数(EF，A)和左心室舒张末期内径(LVDD，B)的超声心动测量。假手术动物的EF或LVDD仅呈现微小的变化。在MI后，EF逐渐下降且LVDD逐渐上升，但是在MI 21天、35天(处理14天、28天)后，MI-IH组心脏收缩功能与常氧处理的大鼠(MI-Nor组)的心脏更好(p＜0.05)。
图3.M型超声心动图显示间歇性低氧治疗后大鼠心功能的改变。代表性M-性影像。心肌梗塞的间歇性低氧(IH)处理与提高的左心室功能相关。A在MI 21天(处理14天)后的M型影像，呈现显著的心腔扩大和左室前壁运动减弱。B在MI后21天(处理后14天)MI-IH组的M型影像，心室扩张降低和心脏收缩功能改善。C和DMI后35天(处理28天)，左心室扩张且前壁运动异常在MI-Nor组中持续，但在MI-IH组中消失了。
图4.间歇性低氧治疗减少心肌梗塞面积。Evan’s蓝和TTC染色。A.由Evan’s蓝确定心肌梗塞面积，而非梗塞的(染成红色)和梗塞的(未染色)区域在与1％氯化三苯基四氮唑孵育后确定。B.以冠状动脉左前降支结扎手术后21天和35天(处理后14天和28天)的心肌梗塞面积的百分数表示的心肌梗塞面积。结果以每组4-5个心脏的平均值±标准误差来表示。与MI-Nor组相比，*p＜0.05。
图5.间歇性低氧治疗促进心肌微血管的增生。免疫组织化学染色梗塞组织的外周的CD34。A.S-Nor(a)，S-IH(b)，MI-Nor(c)，MI-IH(d)组在MI 21天后(14天IH或正常含氧量处理后)的免疫组化染色。B.S-Nor(a)，S-IH(b)，MI-Nor(c)，MI-IH(d)组在MI35天后(28天IH或含氧量处理后)的免疫组化染色。可观察到毛细血管的内皮细胞变薄且缺少平滑肌细胞，刻度标记为50μm。C.每mm2梗塞区域中IH处理对于毛细血管的平均数的影响，与MI-Nor相比，毛细血管的平均数明显增加(*p＜0.05，**p＜0.01，MI-IH)。
图6.间歇性低氧治疗促进心肌组织VEGF蛋白的表达。A.假手术、冠状动脉左前降支结扎手术21和35天后，用大鼠心肌内免疫印迹来指示间歇性低氧处理对于VEGF表达的影响；VEGF蛋白以25kDa表达。在6个独立的实验中获得相似的结果(每个实验重复3次)。B.免疫印迹的平均光密度结果。VEGF蛋白含量以Sham-Nor组的平均值百分比表示。与相应的常氧组相比，*p＜0.05，**p＜0.01。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究，发现间歇性低氧作为一种干预治疗手段，对心肌梗塞具有缓解和治疗作用。所述间歇性低氧通过低氧系统(更特别的为低氧舱)来实施。基于此，完成了本发明。
在本发明中，术语“间歇性低氧”是一种治疗干预手段，指间隔给予动物低氧-常氧-低氧循环的环境。
在本发明中，术语“低氧”是指氧分压Po2＝84±20mmHg或11.2±2.8kPa；更特别的，氧分压Po2＝84±10mmHg或11.2±1.4kPa；最佳的，氧分压Po2＝84±5mmHg或11.2±0.5kPa。
在本发明中，术语“常氧”是指氧分压Po2＝159±20mmHg(或20.7kPa±3kPa)；更特别的，氧分压Po2＝159±10mmHg(或20.7kPa±1.5kPa)；更佳的，氧分压Po2＝159±5mmHg(或20.7kPa±0.5kPa)。
在本发明中，“低氧系统”是指一种可制造低氧环境的设备，其也可称为“低氧设备”、“低氧舱”、“低压氧舱”等。
本发明人的研究结果显示，在大鼠心肌梗塞后，给予间歇性低氧治疗，即每天在相当于5000米海拔高度(即Po2＝159±20mmHg或20.7kPa±3kPa)的低压氧舱中生活4-8小时，然后恢复常氧环境，连续治疗10-30天后，间歇性低氧能明显促进心梗后大鼠心功能的恢复，减少心梗面积，增加冠脉流量，促进微血管的增生，对大鼠心肌梗塞有明显的改善作用。由此，提示间歇性低氧对于人的心肌梗塞的缓解和治疗也可产生明显作用。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1低氧系统一种用于制备治疗心肌缺血、梗塞的氧气舱设备，所述的氧气舱设备包括一个封闭的舱体，所述舱体中包括氧气供给装置，氧气排出装置，以及含氧量检测装置，其中，所述的氧气供给装置提供氧气，所述的氧气排出装置可排出氧气。
该氧气舱可使得其内的氧气满足以下条件氧分压Po2＝84±20mmHg或11.2±2.8kPa。
在使用时，调节氧气供给装置，使氧气舱内的氧分压稳定在Po2＝84±1mmHg或11.2±0.14kPa，将哺乳动物置于其内，维持有效长时间(如6小时)后，关闭氧气供给装置，使氧气维持在常氧范围(Po2＝159mmHg±20mmHg(或20.7kPa±3kPa))小时。重复上述步骤10-30天，即可达到治疗或缓解心肌梗塞的效果。
实施例2动物分组和动物模型的建立I.动物分组雄性Sprague-Dawley大鼠(体重150-180克)均为清洁级动物，购自中国科学院上海实验动物中心。如图1所示，按实验设计要求，大鼠被随机分组。
分组后，对其中一部分大鼠行冠状动脉左前降支结扎手术(LADocclusion)，造成大鼠急性心肌梗塞。另一部分大鼠则作为假手术组(Shamsurgery)，不对其冠状动脉进行结扎。术后在常温条件下密切观察7天。然后大鼠被随机分组至常氧环境继续生活，或至低压氧舱中治疗。本发明人将心梗后的大鼠置于低压氧舱中治疗14天和28天，即大鼠心梗7天后，每天在相当于5000米海拔高度的低压氧舱中生活6小时，然后恢复至常氧环境，连续治疗14天和28天(MI-IH组)。常氧组大鼠在心梗7天后，也在常氧条件下连续生活14天和28天作为对照观察(MI-Nor组)。MI-IH和MI-Nor组分别设假手术组Sham-IH，Sham-Nor。所有的大鼠分别在术前、术后7天、术后21天(治疗14天)和术后35天(治疗28天)测量体重及动脉血压。
II.建立大鼠心肌梗塞模型1.实验器械与试剂包括动物人工呼吸机(DW2000 volume-cycled rodent ventilator，Jiapen Technology，Co，Shanghai)、心电图仪、颈内动脉穿刺针、常规手术器械、1％戊巴比妥钠、70％酒精、医用缝合线、6/0的医用无损伤缝合针、医用透气胶布。
2.实验步骤对大鼠心脏的冠状动脉左前降支进行结扎，使大鼠左心室前壁缺血造成心肌梗塞。给予大鼠腹腔内注射1％戊巴比妥钠(50mg/kg)后，将大鼠置于手术板上。颈部和左胸脱毛后，用70％酒精消毒。沿颈部正中切开然后逐层分离，暴露气管。将颈内动脉穿刺针沿大鼠甲状软骨下气管第2-3软骨环缝隙内插入，随后立即接上动物呼吸机，维持通气量45-50次/分。在左胸第3-4肋骨处，打开胸腔，剪去心外膜，暴露心脏。冠状动脉左前降支一般沿左心房与肺动脉圆锥之间的动脉沟出发，基本与室间隔平行前行。由左前降支出发点向后向下约1-2mm处用6-0医用无损伤缝合针结扎，注意结扎时避免穿破心脏。结扎成功后肉眼直接可观察到左心室前壁颜色改变，心脏收缩减弱。冠状动脉结扎后逐层缝合，关闭胸腔。术后撤去呼吸机，几秒钟后待大鼠恢复自主呼吸，直接接上心电图仪记录大鼠术后的心电。心电图监护可见肢导R波振幅升高，I，aVL导联ST段明显抬高，证明结扎成功。
实施例3间歇性低氧对大鼠生理参数的影响测量血液参数指标在心梗手术后21天，35天(也即术后常氧或间歇性低氧治疗14天，28天)，将大鼠麻醉后，从腹股沟动脉处采血1ml，分别测得外周血血红蛋白浓度、红细胞记数和白细胞记数。
结果，各组大鼠体重、动脉血压、血红蛋白及红细胞计数值见表1。在术后第7天，四组大鼠动脉血压基本一致。心梗手术后经间歇性低氧治疗14天，28天后分别发现MI-IH组大鼠的血压值较常氧组(MI-Nor)升高(14天后，间歇性低氧组比常氧组＝142.8±1.4比125.1±1.8，p＜0.01；28天后，间歇性低氧组比常氧组＝153.1±1.5比132.8±1.7，p＜0.01)，但这些大鼠的血压值均在生理范围内。由此可见，大鼠心肌梗塞后经间歇性低氧治疗14天和28天，动脉血压值有一定程度的升高，但并未导致高血压。
大鼠心肌梗塞后经间歇性低氧治疗14天、28天，其血红蛋白值和红细胞计数与常氧组(MI-Nor)相比，均无明显差异(p＞0.05)。心梗后IH治疗对血红蛋白和红细胞计数无明显影响。
表1 各组大鼠体重、动脉血压、血红蛋白及红细胞计数值
与相应的假手术值相比，*p＜0.05；与相应的正常含氧值相比，**p＜0.01；p＜0.05，p＜0.01。
实施例4间歇性低氧对大鼠心功能具有保护作用1.离体心脏Langendorff灌流1)灌流液Krebs-Henseleit buffe(mM)118 NaCl，4.7 KCl，1.2 KH2PO4，1.2 MgSO4，1.8 CaCl·2H2O，25 NaHCO3，11 Glucose。超纯水配置，pH7.4，以95％O2，5％CO2混合气体充灌30分钟。
2)恒压Langendorff灌流装置此系统主要由管道系统、恒温系统、氧合器和恒流泵组成。氧合器用于灌流液的供氧；恒流泵用于控制灌流系统的灌注压，本实验灌注压恒定于80mmHg；恒温系统则使灌流液保持恒定温度，本实验所用灌流液温度为37℃。
3)实验操作雄性S.D大鼠，1％戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔内注射麻醉。仰位固定，打开胸腔，迅速取出心脏置于冰冷的K-H液中(4℃)；剪开心包，分离主动脉，将充满灌流液的套管插入主动脉，结扎固定；注入灌流液排出心脏内剩余血液，将主动脉套管快速连于Langendorff灌流装置。在左心房侧壁剪一小口，将小乳胶水囊通过房室瓣插入左心室。和乳胶水囊相连的导管通过三通管连接压力转换器。压力转换器(model Gould P23 Db，AC Instrument Ltd.Australia)信号通过桥式放大器输入多导记录系统(PowerLab system，Australia)，通过计算机运行chart软件完成信号的实时采集和处理。流量检测装置直接连于多导记录系统，记录冠脉流量(CF)。记录的心功能参数包括心率(HR)、左心室舒张末压(LVEDP)、左心室峰压(LVPSP)、左心室发展压(LVDP＝LVPSP-LVEDP)、左心室等容期压力最大变化速率(±LVdp/dt max)。离体心脏经20分钟平衡灌流后，取下心脏，液氮速冻，用于分子生物学检测；或10％中性福尔马林固定，用于病理学检测；或进行Evan’s染色，测量心肌梗塞面积。
结果如表2所示，经常氧或间歇性低氧处理14天，28天后，各组大鼠心率值基本一致。离体心脏Langendorff灌流显示MI-Nor组与MI-IH组之间心脏收缩功能有显著差异，主要表现在LVDP，±LVdp/dt数值上。在假手术组大鼠(sham groups)，除冠脉流量之外，其各项心功能参数在常氧组与间歇性低氧组之间均无明显变化(S-Nor比S-IH，p＞0.05)。心肌梗塞大鼠在间歇性低氧治疗14天和28天后，与常氧组相比，LVDP，±LVdp/dt max各项指标均有明显改善。心肌梗塞后经间歇性低氧治疗一段时间，可促进大鼠心功能的恢复。
在假手术组大鼠，经IH处理14天和28天后，与常氧组比较，冠脉流量明显增加(14天，间歇性低氧组比常氧组＝21.2±0.8比15.1±1.5，p＜0.01；28天，间歇性低氧组比常氧组＝18.9±2.4比13.2±0.8，p＜0.01)，CF值分别增加了40.9％和43.9％。同样，心梗后的大鼠经IH治疗14天，28天后，与常氧组相比，CF也显著增加(14天，间歇性低氧组比常氧组＝15.9±0.6比12.5±0.6，p＜0.05；28天，间歇性低氧组比常氧组＝16.6±0.6比12.7±0.8，p＜0.05)，CF值分别增加了26.8％和30.8％。这说明间歇性低氧的参与能明显增加冠脉流量，改善心肌缺血状态。
表2.IH治疗对大鼠离体心功能指标的影响
与相应的假手术值相比，*p＜0.05，**p＜0.01；与相应的常氧组相比，p＜0.05，p＜0.01。
2.超声心动图评价所有试验动物在心梗前，心梗后第7天，第21天及第35天均进行了经胸超声心动图检查。以往的报道已经证实了大鼠经胸超声心动图的精确性和可重复性。超声心动图使用商业购买的15-MHz线阵探头(Philips Sonos 5500成像系统，S12)进行，检查期间所有大鼠均用戊巴比妥钠麻醉，平卧位于左侧胸骨旁切面记录图像。采用二维超声引导下M型超声心动图，在心室腔最大的短轴切面上测量室间隔厚度(IVS)，左室后壁厚度(LVPW)，左室舒张末期内径(LVDD)，左室收缩末期内径(LVDS)。仪器将自动计算出左室射血分数(EF)，以及短轴缩短率(FS)。所有的测量均由一位有经验的且不知道分组情况的技术员进行，所有测值均为3个连续心动周期的平均值。心梗后第七天EF≥90％的大鼠视为心梗不显著而被剔除。
术前，心梗后第7天，第21天(即治疗后第14天)，以及术后第35天(即治疗后第28天)的超声心动图测值列于表3。各组在术前超声心动图指标无显著差异。冠脉结扎后第7天，IH治疗的MI组(MI-IH)以及常氧(normoxia)治疗的MI组(MI-Nor)的所有心超指标较术前均有显著变化，室间隔厚度(IVS)变薄，分别下降18.2％和19.4％；左心室舒张末期内径(LVDD)扩张27.8-36.7％，射血分数(EF)和短轴缩短率(FS)分别下降27.9-29％和45.8-46.9％。心梗后第7天，MI-IH组与MI-Nor两组之间各指标无统计学差异，但与假手术组相比，两个心梗组的指标均有显著变化。这提示心梗模型的成功建立，而且MI-IH组与MI-Nor组的基础水平具有可比性。
如图2A所示，在整个实验过程中，sham组大鼠射血分数(EF％)在各个时间点，其数值基本保持稳定。MI-Nor组大鼠在心梗手术后7天，EF值明显下降(92.6％比66.7％)，而且随时间的延长，其EF值始终维持在较低水平。MI-IH组大鼠在心梗术后7天EF值下降至65.5％，但经间歇性低氧治疗14天后，其EF值与MI-Nor组相比显著上升(MI-IH比MI-Nor＝71.5±2.7％比58.2±3.5％，p＜0.05)。在IH治疗28天后，MI-IH与MI-Nor二组之间EF值的差异仍然十分显著(MI-IH比MI-Nor＝72.5±3.6％比60.6±3.5％，p＜0.05)。
如图2B所示，在整个实验过程中，sham组大鼠左室舒张末期内径(LVDD)在各个时间点无明显变化。冠脉结扎术后7天，MI-Nor与MI-IH二组大鼠LVDD明显扩大(MI-Nor组由0.5020.008至0.6420.021，p＜0.05；MI-IH组由0.4630.029至0.6330.016，p＜0.05)。心梗后第21天(即治疗后14天)，MI-Nor组大鼠LVDD继续显著扩大，而MI-IH组大鼠经间歇性低氧治疗，其LVDD增加程度明显低于MI-Nor组(0.8220.03比0.7080.03，p＜0.05)。该现象在心梗后第35天(即治疗后28天)仍然明显(0.8740.05比0.7550.03，p＜0.05)。
M型超声心动图显示(图3)，与MI-Nor组左室前壁收缩减弱或收缩消失形成对比，梗死的心脏在接受间歇性低氧治疗14天后(MI-IH)左室前壁运动改善，IH阻止LVDD的进一步扩大，心室功能良好。2周后，MI-Nor组仍持续存在左室扩张和前壁运动异常，而MI-IH组在IH治疗28天后上述现象消失，心脏收缩功能明显改善。
实施例5间歇性低氧减少心肌梗塞面积1)试剂Evan’s蓝染料(Sigma)氯化三苯基四氮唑(TTC)(Sigma)0.05M PBS缓冲液0.2M磷酸缓冲液(pH7.4)2)步骤离体心脏灌流后，从Langendorff灌流装置上取下心脏，由主动脉内注入1ml 0.5-1％的Evan’s染料，将正常心肌与缺血区心肌(area at risk)区分开。然后用生理盐水冲洗干净，将心脏放于液氮中快速冷冻20min。由液氮中取出心脏，顺房室沟从心尖部至心基部平行将大鼠心室切成0.1-0.2cm厚的心肌片，将心肌片放在1％TTC溶液中37℃温孵10-15min。染色过程中不时摇动染色液使之与心肌充分接触。染色后立即用水冲洗去多余的染料。心肌梗死区不着色，呈灰白色；缺血但仍存活的心肌被TTC染成红色。染色结束后将心肌切片置于10％中性福尔马林溶液中固定，以增强染色强度。将染色后的心肌切片平铺于二块载玻片之间，照相，扫描，用电脑软件图像分析法(image-proplus 5.0)确定心肌梗死的面积。心肌梗死范围以每一心脏总梗死面积(IF)占总缺血区面积(area at risk，AR)的百分比表示。
离体心脏灌流后，取下心脏，用Evan′s蓝和1％TTC染色后，计算心肌梗塞面积。结果显示(图4)，心梗后21天(即治疗后14天)MI-IH组心梗面积为21.7±3.1％，与MI-Nor组35.9±4.3％相比，明显减少(p＜0.05)。在心梗后35天(即治疗后28天)，MI-Nor组心梗面积达到55.0±6.4％，而MI-IH组经间歇性低氧治疗，心梗面积缩小至32.6±4.2％，二者存在显著差异(p＜0.05)。所以，大鼠心肌梗塞后经间歇性低氧治疗14天、28天，可有效减少心梗面积，提高心肌的存活能力，对心脏起到保护作用。
实施例6间歇性低氧促进心肌微血管形成(1)试剂二甲苯 无水酒精 95％酒精 3％H2O2(甲醇)0.01M PBS缓冲液pH 7.2-7.60.1M枸橼酸盐缓冲液(pH 6.0)DAB显色剂小鼠抗大鼠CD34单克隆抗体，使用浓度1∶100(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)羊抗鼠二抗(即用型，长岛公司EnVisionTM试剂)(2)免疫组织化学染色离体心脏灌流后，取下心脏，用生理盐水冲洗干净，10％中性福尔马林固定心脏标本。顺房室沟由心尖部至冠状动脉左前降支结扎处平行切取三块心脏组织，厚约2mm。常规石蜡包埋后，采用免疫组织化学EnVision二步法进行染色。玻片经APES(Sigma公司)、丙酮预处理，4～5um厚石蜡切片，60℃烘烤2h。二甲苯脱蜡，梯度乙醇入水。3％H2O2(甲醇)溶液孵育20min，灭活内源性过氧化物酶活性，蒸馏水漂洗。切片置于pH 6.0的枸橼酸盐缓冲液内，微波抗原修复98℃15min，室温冷却20min后PBS漂洗3次；然后滴加一抗，4℃湿盒孵育过夜。PBS漂洗3次，EnVisionTM二抗室温孵育30min，PBS漂洗3次，DAB显色，苏木精衬染，常规梯度乙醇脱水，树脂封片。以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。
(3)CD34免疫组化染色可以显示血管内皮细胞心肌细胞之间微血管呈单个内皮或成簇内皮细胞阳性。每个标本选三张切片，每一张切片选取5个血管密度最多的区域，然后在400倍视野下分别记数毛细血管数目，取其平均值。
计算毛细血管密度(/mm2)＝平均毛细血管数/400倍视野(0.2mm2)，观察心肌内毛细血管数量的变化。
结果本实施例应用免疫组织化学染色方法，用CD34抗体标记血管内皮细胞，来反映心肌组织中血管增生的情况。心肌梗死后在梗塞区周围的心内膜下可见较多新生毛细血管，每张切片选取五个不重叠的区域，在高倍视野下(×400倍)计数毛细血管密度(/mm2)。结果显示，心梗后21天(即治疗后14天)，MI-IH组经间歇性低氧治疗，与常氧组MI-Nor相比，毛细血管密度显著增加(624±40.7比397.1±42.5/mm2，p＜0.05)。从图5可见，MI-IH组在心梗周围毛细血管增生活跃，排列密集。心梗后35天(即治疗后28天)，MI-IH组毛细血管密度进一步增加，与MI-Nor组之间继续存在显著差异(MI-IH比MI-Nor＝919.3±98.4比516.4±50.7，p＜0.05)。
由此可见，间歇性低氧治疗可促进心肌梗塞后心肌微血管的增生，改善心肌的缺血程度。
实施例7.
间歇性低氧促进VEGF蛋白的表达(1)试剂和溶液二硫苏糖醇(DTT)、Tween-20、十二烷基硫酸钠(SDS)、牛血清白蛋白(BSA)、蛋白酶抑制剂(Protease Inhibitor Cocktail)一级抗体小鼠抗大鼠VEGF购自Santa Cruz公司(Santa CruzBiotechnology，Santa Cruz，CA)二级抗体HRP酶标羊抗鼠IgG、蛋白电泳分子量标准品均购自Sigma公司(St.Louis，MO，USA)；Triton X-100、苯甲基磺酰氟(PMSF)、TEMED购自MERCK公司(Merck KGaA，64271 Darmstadt，Germany)；丙烯酰胺(Acrylamide)、双丙烯酰胺(Bisacrylamide)为Fluka公司产品(Buchs，Switzerland)；硝化纤维素膜购自Amersham公司(Buckinghamshire，UK)；化学荧光显色剂-Western Blotting Chemiluminescence Reagent，购自PE公司(PerkinElmer Life Science.Inc)其它化学试剂包括Tris-Base、Glycine、EDTA、sodium vanadate、CoomassieBrilliant Blue G-250、Coomassie Brilliant Blue R-250、Bromophenol Blue等均为分析纯级国产试剂。
匀浆缓冲液A(mM)Tris 50.0，pH 7.4，EDTA 1.0，DTT 0.5，PMSF 0.4，Na3VO4 1.0，Protease Inhibitor Cocktail 0.02％(V/V)，pH 7.4；Bradford蛋白测定液乙醇95％w/v，磷酸85％w/v和超纯水以1∶2∶17的体积混合加入终浓度为0.1mg/ml的Coomassie Brilliant Blue G-250，以滤纸抽气过滤；2倍样本缓冲液(mM)Tris-HCl 125.0，SDS 4.0％(w/v)，Bromophenol Blue0.005％(w/v)，Sucrose 350.0，DTT 150.0，pH 6.8；丙烯酰胺贮备液30g丙烯酰胺和0.8g双丙烯酰胺溶于超纯水，终体积为100ml，以定性滤纸过滤，4℃避光存放；8倍分离胶缓冲液贮备液Tris-HCl(pH 8.8)3.0M，SDS 1.0％(w/v)，4℃存放备用；4倍浓缩胶缓冲液贮备液Tris-HCl(pH 6.8)0.5M，SDS 0.4％(w/v)，4℃存放备用；浓缩胶贮备液丙烯酰胺贮备液16.7％(v/v)，4倍浓缩胶缓冲液贮备液25％(v/v)，4℃避光存放；10％过硫酸铵(w/v)使用前新鲜配制，一周内使用；电泳槽电极液Tris-Base 25mM，Glycine 0.25M，SDS 0.1％(w/v)，pH8.3；
转移槽电极液Tris-Base 25mM，Glycine 192mM，甲醇20％(v/v)，pH 8.3；TBST缓冲液(Tris-Buffer Saline containing Tween-20)Tris-Base 20mM，NaCl 137mM，Tween-20 0.1％(v/v)，pH 7.6；抗体封闭液含有2％BSA的TBST缓冲液。
(2)蛋白的提取分离和定量蛋白的提取分离(以下所有操作均在冰水浴或低温下进行)心肌组织(约50～100mg)自液氮中取出，加入0.5ml预冷的匀浆缓冲液，在4℃以高速匀浆机将心肌组织彻底匀浆，匀浆后置于冰上30min。将匀浆液倒入1.5ml Eppendorff管，在4℃以10,000g/min的速度离心20min，将离心分层后的上清液分装，置-70℃冰箱内保存。
Bradford法蛋白定量以高纯度BSA作为标准蛋白(1mg/ml)绘制标准曲线，取10μl的样本加入1ml的Bradford蛋白测定液，混合均匀；室温静置五分钟后，以紫外可见光光度计(Lambda 2S UV/VIS型Perkin Elmer公司Germany)读取595nm之OD值，通过标准曲线计算出样本的蛋白浓度。
(3)十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)变性蛋白质样本的制备取50μg的蛋白样本加入4倍蛋白样本缓冲液，混合均匀，在沸水浴中煮沸10min后，立即放入0℃的冰水浴中冷却并分装，置-70℃冰箱冷藏。
SDS-PAGE凝胶(12％)的制备加入3.2ml的30％丙烯酰胺贮备液、1ml的8倍分离胶缓冲贮备液和3.8ml的超纯水，混合均匀；再加入10％的过硫酸铵80μl和TEMED 8μl，迅速搅拌混匀，倒入装置好的玻璃槽中约4/5高，上面轻轻地覆以超纯水隔离胶体与空气，并使表面平整；待胶体凝结后，倒掉纯水，并以超纯水冲洗干净，以定性滤纸吸干表面水分，取配制好的浓缩胶(5％贮备液)3ml，加入10％的过硫酸铵30μl和TEMED 3μl，迅速均匀后，倒入玻璃槽内，插入样品梳，待胶体凝结后取出样品梳。
电泳在电泳槽内加入电泳槽电极液，赶出样品槽内的气泡。在样品槽内分别加入蛋白电泳分子量标准品阳性对照和蛋白样本，样本上样量均为50μg；接通电源，先以80V的恒压电泳40min，再以120V的恒压继续电泳约2-3h，至溴酚兰染料跑至凝胶底部结束电泳。
转膜将取下的SDS-PAGE电泳胶体、硝化纤维素膜、定性滤纸以及纤维垫放在电泳槽转移液内，以夹三明治方式(中间为胶体和硝化纤维素膜，外面分别夹以滤纸和纤维垫)夹牢，彻底清除内部的气泡；然后放入装满电极液的转移槽内；正确接通电极和电源，通以150mA的恒流约4h，将胶体上的蛋白质转印到硝化纤维素膜上。
抗体标记将转印有蛋白的硝化纤维素膜取出，标记方向和蛋白分子量标准印记；然后浸入抗体封闭液，摇床上室温下孵育2h以封闭非特异性蛋白结合位点；将硝化纤维素膜浸于含有一抗(Primary antibodyanti-VEGF 1∶1000稀释)的一抗孵育液中，4℃孵育过夜，以TBST于摇床上洗膜10min×3次。将硝化纤维素膜浸入含有辣根过氧化酶标记的二级抗体(Secondary antibody，Goatanti-mouse horseradish peroxidase 1∶5000)的二抗孵育液中，室温下摇晃孵育2h，再以TBST洗膜15min×3次。
显色成像利用辣根过氧化酶显色剂的化学荧光方法，使X感光胶片成像来检测相关蛋白的位置及其含量；用扫描仪将图像输入计算机再用蛋白条带分析软件Gel-Pro Analyzer 3.0，Media Cybernetics，USA来对相关蛋白进行定量。
数据处理所有数据均以均数±标准误差(mean±S.E)表示。不同处理组之间比较通过单因素方差分析ANOVA或Student’st检验进行。P＜0.05时差异具有显著性。
Western Blot免疫印迹法检测心肌组织中VEGF蛋白的表达，结果显示(图6)，大鼠心肌梗塞后21天(即治疗后14天)，间歇性低氧组(MI-IH)VEGF表达值为247±34.1，显著高于常氧组(MI-Nor)134.6±19.7(p＜0.05)。在心梗后35天(即治疗后28天)，这二组VEGF表达的差异依旧十分显著(MI-IH 2 44.9±26.7比MI-Nor 123.5±5.3，p＜0.01)。这提示间歇性低氧治疗可提高大鼠心肌梗塞后心肌组织中VEGF蛋白的表达，进而促进微血管的增生。
综上，本发明证实了间歇性低氧对大鼠心肌梗塞具有明显的治疗作用。IH能促进梗塞后大鼠心功能的恢复，减少心肌梗塞面积。IH通过诱导VEGF表达增强，促进心肌组织内微血管增生，减少心肌细胞损伤，对大鼠心肌梗塞有显著的改善作用。间歇性低氧作为一种新的干预治疗手段，为心肌梗塞的临床治疗提供了新的途径。
讨论本发明在大鼠心肌梗塞后，将间歇性低氧作为一种干预治疗手段，研究间歇性低氧治疗对大鼠心肌梗塞是否具有保护作用。研究结果第一次表明，在相当于海拔高度5000米的低压氧舱中给予间歇性低氧治疗14天和28天，对于缺血和梗塞的心肌均具有明显的改善作用。这一新的心肌保护作用具体表现在通过IH治疗，可改善大鼠心梗后的心功能，有助于心功能的恢复；有效地减少心肌梗塞面积，提高心肌的存活能力；增加心肌组织内VEGF蛋白的表达，从而促进心肌内毛细血管的增生，增加冠状动脉流量，改善心肌缺血程度。同时，经IH治疗14天和28天后，与常氧对照组相比，大鼠外周血中血红蛋白浓度和红细胞计数没有明显增加，表明IH对心肌梗塞的治疗并不影响这二者的水平，从而可减少因血细胞容积增多导致血栓形成的危险性。因此，本发明的研究结果表明，IH治疗对大鼠慢性心肌缺血损伤具有一定的保护作用。
以往过多的研究集中在缺血预适应(ischemic preconditioning)对心肌的保护方面。心肌缺血预适应(IPC)是指心肌在经历了一次或多次短暂的缺血/再灌注后，对随后发生的长时间缺血损伤的耐受性明显增强。此现象在1986年首次发现以来，已在不同种属动物、不同脏器得到验证，说明IPC是广泛存在的机体保护性防御反应。间歇性低氧适应能提高心肌对缺血/再灌注损伤的耐受性)；提高心肌的抗氧化能力和对氧的利用能力，减少再灌注性心律失常；减轻心肌细胞坏死和凋亡，促进心肌功能的恢复等。间歇性低氧能提高心肌抗缺血缺氧能力，对提高人体健康状况和运动能力具有积极的意义。目前，许多实验都是将间歇性低氧作为一种预适应手段(IH preconditioning)，而未见有关将间歇性低氧用于治疗方面的研究报道。本发明第一次将间歇性低氧用于大鼠心肌梗塞后的治疗。结果发现，IH同样也具有明显的治疗作用，可改善心肌梗死后的心功能，促进心肌组织内血管的增生等。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种氧气舱设备的用途，其特征在于，用于制备治疗心肌缺血、梗塞的设备，所述的氧气舱设备包括一个封闭的舱体，所述的舱体中包括氧气供给装置，氧气排出装置，以及含氧量检测装置，其中，所述的氧气供给装置提供氧气，使得氧气舱内的氧气满足以下条件氧分压Po2＝84±20mmHg。
2.一种氧气的用途，其特征在于，用于制造治疗心肌缺血、梗塞的设备或制剂。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的氧气在治疗心肌缺血、梗塞的设备中以低氧-常氧相间隔的方式给予，并且，所述低氧-常氧相间隔的时间为低氧6±2小时，常氧18±2小时；所述的低氧为氧分压Po2＝84±20mmHg，所述的常氧为氧分压Po2＝159±20mmHg。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述低氧-常氧相间隔的时间为低氧6±1小时，常氧18±1小时；所述的低氧为氧分压Po2＝84±10mmHg，所述的常氧为氧分压Po2＝159mmHg±10mmHg。
5.一种治疗哺乳动物心肌缺血、梗塞的方法，其特征在于，采用间歇性低氧处理来实施治疗，包括步骤使所述哺乳动物在低氧-常氧相间隔的环境中进行治疗，并且，每天将患有心肌梗塞的哺乳动物置于低氧环境中生活6±2小时，其余18±2小时置于常氧环境；所述的低氧为氧分压Po2＝84±20mmHg，所述的常氧为氧分压Po2＝159mmHg±20mmHg；连续治疗7-50天。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，每天将患有心肌梗塞的哺乳动物置于低氧环境中生活6±1小时，其余18±1小时置于常氧环境；所述的低氧为氧分压Po2＝84±10mmHg，所述的常氧为氧分压Po2＝159mmHg±10mmHg；连续治疗7-35天。
7.一种提高患心肌梗塞的哺乳动物心肌组织中新生毛细血管生长的方法，其特征在于，将所述哺乳动物置于低氧-常氧相间隔的环境中，并且，每天将患有心肌梗塞的哺乳动物置于低氧环境中生活6±2小时，其余18±2小时置于常氧环境；所述的低氧为氧分压Po2＝84±20mmHg，所述的常氧为氧分压Po2＝159mmHg±20mmHg；连续治疗7-50天。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述低氧-常氧相间隔的时间为低氧6±1小时，常氧18±1小时；所述的低氧为环境中的氧分压Po2＝84±10mmHg，所述的常氧为氧分压Po2＝159mmHg±10mmHg；连续治疗7-35天。
全文摘要
本发明公开了一种低氧系统的新用途，用于心肌缺血、梗塞的治疗。本发明还公开了氧在制造心肌缺血、梗塞治疗设备中的用途。本发明还公开了一种治疗哺乳动物心肌缺血、梗塞的方法，采用间歇性低氧处理来实施治疗。本发明证实了间歇性低氧对大鼠心肌缺血、梗塞具有明显的治疗作用，其作为一种新的干预治疗手段，为心肌缺血、梗塞的临床治疗提供了新的途径。
文档编号A61K9/10GK1989920SQ200510112359
公开日2007年7月4日 申请日期2005年12月29日 优先权日2005年12月29日
发明者杨黄恬, 周兆年, 许伟青, 朱仪 申请人:中国科学院上海生命科学研究院