专利名称：海龙抗肿瘤活性蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种医药技术领域的产品，具体的说，是涉及一种海龙抗肿瘤活性蛋白。
背景技术：
目前国内外用于临床的抗肿瘤药物有很多，化学合成药物的毒副作用都比较大，从天然产物中分离纯化具有抗肿瘤、增强免疫活性的药物成为研究的热点。近年来对动物中活性蛋白和多肽的研究日趋活跃，从中寻找抗肿瘤蛋白和多肽成为研究开发新热点。由于海洋生物和内陆生物的差异性，来自于海洋动物的蛋白质组分更具有开发和应用价值，目前国际上已有数百个海洋生物多肽和蛋白质进入临床研究。来源于北极豹蛙卵和早期胚胎中的RNA酶-Onconase(P-30蛋白，分类号EC 3.1.27-)，成为首个进入III期临床研究(临床名称Ranpirnase)的抗肿瘤核糖核酸酶药物。海龙(Syngnathus)为一常用中药材，2005版《中华人民共和国药典》规定为尖海龙Syngnathus acus Linnaeus、刁海龙Solenognathus hardwickii(Gray)和拟海龙Syngnathoides biaculeatus(Bloch)干燥体，用于阳萎遗精、癥瘕积聚、瘰疬痰核、跌扑损伤及痈肿疔疮。除药典收载品种外，粗吻海龙Trachyrhamphus serratus(Temminck et Schlegel)在我国不少地方也常作海龙药用。
经对现有技术的文献检索发现，李士敏等在海龙的体外抗肿瘤活性研究中发现，粗吻海龙经95％乙醇提取，再用石油醚、氯仿、正丁醇萃取，获得的石油醚萃取物经皂化后再用乙醚萃取，回收乙醚得非皂化物，其非皂化物部分具有不同程度的抑制人癌细胞株KB、Hela、Bcap37、K-562、PAA细胞的作用，并有明显的量效关系(李士敏，吴筱丹，曾苏，等.海龙体外抗肿瘤活性研究[J].中国中药杂志，2001，26(3)198-201)。目前粗吻海龙仍以全体入药，用于跌打损伤和阳萎遗精的治疗，未见用于抗肿瘤和增强免疫功能的相关技术文献的报道。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种海龙抗肿瘤活性蛋白，使其具有抗肿瘤活性，同时有低毒、增强免疫的特点。
本发明是通过以下技术方案实现的。本发明是一种以粗吻海龙为原料提取的分子量为55kDa的海龙抗肿瘤活性蛋白，其中，蛋白质含量在99-100％之间，糖含量在0-1％之间。本发明海龙抗肿瘤活性蛋白是经乙醇-水溶液提取、树脂分离、硫酸铵盐析、凝胶过滤和离子交换层析制得。
本发明所提供的海龙抗肿瘤活性蛋白外观为白色粉末，SDS-PAGE显示是单一条带。
发明所提供的海龙抗肿瘤活性蛋白，经测试具有良好的抗肿瘤活性小鼠及人癌细胞株给药剂量在0.1-100μg/ml范围内可抑制多种肿瘤细胞的生长；小鼠给药剂量在1-100mg/kg范围内可抑制动物体内移植肿瘤的生长，同时可以显著改善荷瘤小鼠体征性状。
本发明所提供的海龙抗肿瘤活性蛋白，单独或与其它药物联合使用均有抗肿瘤作用，主要用于各种癌症的治疗和辅助治疗，如肺癌、肝癌、宫颈癌、结肠癌、白血病等，尤其对A-549、Bel-7402、Hela、Lovo、P-388细胞株有较强杀伤作用；同时还具有增强免疫的作用。
图1为本发明SDS-PAGE图谱具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的描述。
从粗吻海龙中纯化该抗肿瘤活性蛋白，具体如下(1)以粗吻海龙为原料，粉碎后过筛，待用。
(2)在粗吻海龙粗粉中加入4～12倍量的体积百分比为0～90％的乙醇-水溶液，匀浆、低温浸泡，离心后取上清液，即为海龙蛋白粗提液。
(3)将蛋白粗提液于20～60℃减压蒸发浓缩后，与HZ-801大孔树脂接触，充分吸附后用蒸馏水洗脱，收集蛋白组分，得到海龙蛋白分离液。
(4)将海龙蛋白分离液减压蒸发浓缩，加入硫酸铵粉末使硫酸铵浓度达到20％-90％饱和度，充分搅拌后4℃静置，离心，收集沉淀，将沉淀用少量Tris-HCl缓冲液溶解后透析、浓缩、冷冻干燥，即得到海龙粗蛋白。
(5)将海龙粗蛋白用pH 7.2、20mM Tris-HCl缓冲液溶解后，与凝胶过滤介质接触，用pH 7.2、20mM Tris-HCl缓冲液洗脱，收集分子量在10-100kDa的蛋白质洗脱液，透析、浓缩、冷冻干燥后，经体外抗肿瘤活性检测，获得海龙抗肿瘤粗蛋白，蛋白质成分含量达95-100％。
(6)将海龙抗肿瘤粗蛋白用pH 8.4、20mM Tris-HCl缓冲液溶解，与离子交换介质接触，梯度NaCl缓冲液洗脱，得到数个不同浓度NaCl缓冲液的洗脱组分，第四个洗脱峰经透析、浓缩、冻干后即为本发明所述的海龙抗肿瘤活性蛋白。
实施例1本发明所提供的海龙抗肿瘤活性蛋白，外观为白色粉末，经Lowry法检测蛋白质含量为99.5％，经苯酚-浓硫酸法检测糖含量为0.5％。
对该蛋白进行SDS-PAGE，分离胶浓度为12％、浓缩胶浓度为5％，以分子量在14.4-116kDa的混合标准蛋白做对照，结果见图1，其中Marker蛋白质分子量标准；Sample本发明中的海龙抗肿瘤活性蛋白。由图1可见本发明所提供的海龙抗肿瘤活性蛋白在SDS-PAGE中显示单一条带，分子量为55kDa。
对该蛋白进行抗肿瘤活性测试，经MTT法检测，当药物浓度为100μg/ml时，对Lovo(人结肠癌细胞株)、A549(人肺癌细胞株)、Hela(人宫颈癌细胞株)、CCRF-CEM(人白血病细胞株)的抑制率分别为55.8％、69.8％、62.8％和52.7％。
该蛋白10μg/ml与甲胺蝶呤或顺铂联合使用，对人结肠癌细胞株Lovo进行抗肿瘤活性体外测试，经MTT法检测当甲胺蝶呤浓度为2.5μg/ml时，细胞生长抑制率增加40.3％，当顺铂浓度为0.025μg/ml时，细胞生长抑制率增加70.4％。
实施例2本发明所提供的海龙抗肿瘤活性蛋白，外观为白色粉末，经Lowry法检测蛋白质含量为100％，经苯酚-浓硫酸法检测糖含量为0％；SDS-PAGE显示分子量为55kDa的单一条带。
对该蛋白采用动物移植性肿瘤实验法考察其体内活性荷S180肉瘤的ICR小鼠(42±2日龄、体重18-22g、雌性)10只，自接种肿瘤后第一天开始以20mg/Kg·天的剂量连续七天腹腔注射给药；阳性对照为静脉注射5-氟尿嘧啶的荷瘤小鼠10只(75mg/kg，于肿瘤接种后1、4天给药两次)；阴性对照为不给药的荷瘤小鼠10只。在第10天称小鼠体重后，剖取各小鼠的肿瘤并称重，同时测量其各项免疫指标。
从表1中可以看出，该蛋白对荷S180肉瘤小鼠的肿瘤抑制率为42.88％。虽然阳性对照组的肿瘤抑制率达到了88.5％，但在实验期间有3只小鼠死亡，存活小鼠的平均体重仅为19.48g，解剖时发现部分小鼠胆发黑，肠暗红色，说明5-氟尿嘧啶有比较强的毒性；而给药该蛋白组小鼠无死亡，平均体重为33.91g，说明本发明所提供的海龙抗肿瘤活性蛋白具有低毒的特性。
与正常小鼠相比给药该蛋白组小鼠的肝、脾和胸腺重量分别增加了21.2％、385％和51.2％；白细胞和血小板分别增加了624％和62.7％；淋巴细胞、单核细胞和中性细胞分别增加了275％、521％和856％。这些变化表明，本发明所提供的海龙抗肿瘤活性蛋白还能显著提高荷瘤小鼠的免疫力。
表1海龙抗肿瘤活性蛋白对荷S180肉瘤小鼠的疗效
实施例3本发明所提供的海龙抗肿瘤活性蛋白，外观为白色粉末，经Lowry法检测蛋白质含量为99％，经苯酚-浓硫酸法检测糖含量为1％；SDS-PAGE显示为分子量55kDa的单一条带。
对该蛋白采用动物移植性肿瘤实验法考察其体内活性，实验方法同实施例2。当给药剂量为30mg/Kg·天时，对荷S180肉瘤小鼠的肿瘤抑制率为51.14％。
权利要求
1.一种海龙抗肿瘤活性蛋白，其特征在于，以粗吻海龙为原料提取的分子量为55kDa的活性蛋白，其中，蛋白质含量在99-100％之间，糖含量在0-1％之间。
2.根据权利要求1所述的海龙抗肿瘤活性蛋白，其特征是，其外观为白色粉末，SDS-PAGE显示是单一条带。
全文摘要
一种医药技术领域的海龙抗肿瘤活性蛋白，以粗吻海龙为原料提取的分子量为55kDa的活性蛋白，其中，蛋白质含量在99－100％之间，糖含量在0－1％之间，其外观为白色粉末，SDS－PAGE显示是单一条带。本发明所提供的海龙抗肿瘤活性蛋白，具有抗肿瘤活性，同时有低毒、增强免疫的特点。本发明单独或与其它药物联合使用均有抗肿瘤作用，主要用于各种癌症的治疗和辅助治疗，如肺癌、肝癌、宫颈癌、结肠癌、白血病等，尤其对A－549、Bel－7402、Hela、Lovo、P－388细胞株有较强杀伤作用；同时还具有增强免疫的作用。
文档编号A61P35/00GK1793174SQ20051011223
公开日2006年6月28日 申请日期2005年12月29日 优先权日2005年12月29日
发明者李晓波, 张朝晖, 秦孙星, 王威, 王梦月 申请人:上海交通大学