专利名称：尖海龙抗肿瘤活性蛋白的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种医药技术领域的方法，具体的说，是涉及一种尖海龙抗肿瘤 活性蛋白的制备方法。
技术背景海龙为一常用中药材，《中华人民共和国药典》(2005版)规定海龙为尖 海龙Syngnathus acus Linnaeus、 刁海龙Solenognathus hardwickii (Gray) 和拟海龙Syngnathoides biaculeatus (Bloch)干燥体，用于阳萎遗精、癥瘕 积聚、瘰疠痰核、跌扑损伤及痈肿疔疮。近年来动物类药材活性蛋白和多肽的研 究日趋活跃，尤其是抗肿瘤蛋白和多肽成为研究开发的热点。由于海洋生物和内 陆生物的差异，来自于海洋药用动物的蛋白质组分更具有开发和应用价值。海龙 以动物全体入药，用于跌打损伤和阳萎遗精的治疗，其抗肿瘤功能没有得到充分 研究和开发。经对现有技术的文献检索发现，李晓波等发明了一种粗吻海龙抗肿瘤蛋白的 制备方法(李晓波，张朝晖，秦孙星，等.粗吻海龙抗肿瘤蛋白的制备方法，中 国专利，专利申请号200510112236.5)。在文献检索未见关于尖海龙抗肿瘤活 性蛋白分离方法的报道。发明内容本发明针对现有技术的不足，提供一种尖海龙抗肿瘤活件蛋白的制备方法， 使其以尖海龙为原料，经提取分离制得。本发明相对于上述背景技术提及的粗吻 海龙抗肿瘤蛋白的制备方法，药材资源丰富，工艺更加简化，易操作，产率大幅 提高，纯度高，成本降低。本发明是通过以下技术方案实现的，包括以下步骤第一步，以尖海龙为原料，粉碎后过筛，待用；第二步，在尖海龙粗粉中加入蒸馏水，匀浆、浸泡，离心后取上清液，即为 尖海龙蛋白粗提液；第三步，将尖海龙蛋白粗提液减压蒸发浓縮后，加入硫酸铵粉末，充分搅拌 后静置，离心，收集沉淀，将沉淀用少量蒸馏水溶解后透析、浓縮、冷冻干燥， 即得到尖海龙粗蛋白；第四步，将尖海龙粗蛋白用Tris-HCl缓冲液溶解，进行离子交换层析，用 梯度NaCl缓冲液洗脱，紫外检测仪于280nm波长处检测，得到数个浓度NaCl 缓冲液的洗脱组分，经透析、浓縮、冻干后经体外抗肿瘤活性检测，0. 3mol/L NaCl 缓冲液洗脱部分具有抗肿瘤活性，即为尖海龙抗肿瘤粗蛋白；第五步，将尖海龙抗肿瘤粗蛋白用Tris-HCl缓冲液溶解后，进行凝胶过滤 层析，用Tris-HCl缓冲液洗脱，紫外检测仪于280nm波长处检测，收集蛋白质 洗脱液，透析、浓縮、冷冻干燥后，经体外抗肿瘤活性检测，第一个洗脱峰具有 抗肿瘤活性，即获得海龙抗肿瘤活性蛋白。所述的第一步中，加入尖海龙粗粉6倍-12倍重量的蒸馏水。 所述的第二步中，浸泡是指置于4 'C冰箱中浸泡8小时-16小时。 所述的第三步中，蛋白粗提液减压蒸发浓縮是在4(TC -50 °C条件下。 所述的第三步中，加入硫酸铵粉末使硫酸铵浓度达到55%-85%饱和度。 所述的第三步中，在4 °C静置。所述的第四和第五步中，Tris-HCl缓冲液是指pH8.4、 20mmol/L Tris-HC1 缓冲液。所述的第四步中，梯度NaCl缓冲液洗脱是指依次用含有0 mol/L、 0.1 mol/L、 0. 2mol/L、 0. 3 mol/L和0. 5 mol/L NaCl的pH8. 4、 20mmol/L Tris-HCl 缓冲液进行洗脱。本发明为了提高蛋白质提取率，采用匀浆搅拌提取方法。本发明获得的海龙抗肿瘤活性蛋白外观为白色粉末。SDS-PAGE凝胶电泳显 示是单一条带，HPLC显示为单一峰，为一纯蛋白。经体外抗肿瘤活性检测，该 蛋白具有良好的抗肿瘤活性，给药剂量在0.05-1 mg/ml范围内可抑制多种小鼠 及人癌细胞株的生长；给药剂量在10-200 mg/kg范围内可抑制小鼠体内移植肿 瘤的生长，同时可以显著改善荷瘤小鼠体征性状，荧光显微镜观察和流式细胞术 分析发现该蛋白可诱导肿瘤细胞的凋亡。本发明海龙抗肿瘤活性蛋白可以与传统化疗药物配合组成抗癌复方制剂，包括甲胺蝶呤、5—氟尿嘧啶、顺铂、长春新碱、环磷酰胺、丝裂霉素等。用本 发明制备的活性蛋白质单独或与其它药物联合使用均有抗肿瘤作用，主要用于各 种癌症的治疗和辅助治疗，如肺癌、肝癌、宫颈癌、结肠癌、白血病等，尤其对A549、 CCRF-CEM、 L0V0、 P388细胞株有较强抑制作用。本发明采用蛋白质SDS-PACE凝胶电泳测定蛋白质分子量海龙抗肿瘤活性 蛋白分子量为60 kDa。采用MTT法测试本发明所得活性蛋白与甲胺蝶呤、5-氟尿嘧啶联合使用， 对L0V0 (人结肠癌细胞株)进行抗肿瘤活性体外测试，当活性蛋白浓度为 0.2mg/ml，甲氨蝶呤浓度为2. 5ug/ml时，细胞生长抑制率增加39.3% ，当活 性蛋白浓度为0.2mg/ml， 5-氟尿嘧啶浓度为25 y g/ml时，细胞生长抑制率增 加68.4%。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下 进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限 于下述的实施例。实施例1(1) 尖海龙药材低温烘干，粉碎，过20目筛。(2) 取100g尖海龙粉末，加入800ml蒸馏水，匀浆3次，每次30s，于4 °C 冰箱中冷浸8h， 4800rpm离心30min，移出上清液，残渣再次加入400 ml蒸馏 水，同上操作，合并提取液即为尖海龙蛋白粗提液。(3) 将(2)中获得的尖海龙蛋白粗提液于50 °C减压浓縮至300ml，得尖海 龙蛋白分离液。(4) 在搅拌的同时向尖海龙蛋白分离液中加入硫酸铵粉末至85%饱和度，4 。C静置过夜使其充分沉淀，4800rpm离心30min ，收集沉淀，将沉淀用少量 蒸馏水溶解后透析、浓縮、冷冻干燥，即得尖海龙粗蛋白。(5) 尖海龙粗蛋白用pH8. 4、 20mmol/LTris-HC1缓冲液溶解，用DEAE离子 交换层析柱进行离子交换层析，依次用含0、 0.1、 0.2、 0.3和0. 5 mol/L NaCl 的pH8.4、 20腿ol/L Tris-HCl缓冲液洗脱，紫外检测仪于280nm波长处检测，收集0. 3 mol/L NaCl的洗脱组分，透析、浓縮、冷冻干燥后，获得尖海龙抗肿 瘤粗蛋白。(6)海龙抗肿瘤粗蛋白用pH8.4、 20mmol/L Tris-HC1缓冲液溶解，用 Superdex-75凝胶柱进行凝胶过滤层析，用pH 8. 4、 20mmol/L Tris-HCl缓冲液 洗脱，紫外检测仪于280nm波长处检测，收集第一个洗脱峰组分，透析、浓縮后 冷冻干燥，即得到本实施例所述海龙抗肿瘤活性蛋白13mg。采用MTT法测试本实施例所得活性蛋白的抗肿瘤活性，当药物浓度为 0.2mg/ml时，海龙抗肿瘤活性蛋白对L0V0 (人结肠癌细胞株)、A549 (人肺癌 细胞株)、L1210 (小鼠白血病细胞株)、CCRF-CEM (人白血病细胞株)的抑制率 分别为53.6%、 56.8%、 51.2%和52.7%。采用MTT法测试本实施例所得活性蛋白与甲胺蝶呤、5-氟尿嘧啶联合使用， 对Lovo (人结肠癌细胞株)进行抗肿瘤活性体外测试，当活性蛋白浓度为 0.2mg/ml，甲氨蝶呤浓度为2. 5yg/ml时，细胞生长抑制率增加39.3% ，当活 性蛋白浓度为0.2mg/ml， 5-氟尿嘧啶浓度为25 n g/ml时，细胞生长抑制率增 加68.4%。采用荧光显微镜观察和流式细胞术分析发现所得活性蛋白可诱导LOVO、 A549等肿瘤细胞的凋亡。采用动物移植性肿瘤实验法考察海龙抗肿瘤活性蛋白对昆明种小鼠S180肉 瘤的抑制率，当给药剂量为50mg/kg时，小鼠肿瘤抑制率为31.3%。实施例2(1) 尖海龙药材低温烘干，粉碎，过20目筛。(2) 取100g尖海龙粉末，加入900ml蒸馏水，匀浆3次，每次30s,于4 。C 冰箱中冷浸12小时，4800rpm离心30min，移出上清液，即为尖海龙蛋白粗提 液。(3) 将(2)中获得的尖海龙蛋白粗提液于45 °C减压浓縮至250ml，得尖海 龙蛋白分离液。(4) 在搅拌的同时向尖海龙蛋白分离液中加入硫酸铵粉末至70%饱和度，4 °C静置过夜使其充分沉淀，4800rpm离心30min ，收集沉淀，将沉淀用少量蒸馏水溶解后透析、浓縮、冷冻干燥，即得尖海龙粗蛋白。(5) 尖海龙粗蛋白用pH8. 4、 20鹏ol/L Tris-HCl缓冲液溶解，用DEAE离子 交换层析柱进行离子交换层析，依次用含0、 0. 1、 0. 2、 0. 3和0. 5 mol/L NaCl 的pH8.4、 20mmol/L Tris-HCl缓冲液洗脱，紫外检测仪于280nm波长处检测， 收集0. 3 mol/L NaCl的洗脱组分，透析、浓縮、冷冻干燥后，获得尖海龙抗肿 瘤粗蛋白。(6) 海龙抗肿瘤粗蛋白用pH8.4、 20mraol/L Tris-HCl缓冲液溶解，用 Superdex-75凝胶柱进行凝胶过滤层析，用pH8. 4、 20腿ol/L Tris-HCl缓冲液 洗脱，紫外检测仪于280nm波长处检测，收集第一个洗脱峰组分，透析、浓縮后 冷冻干燥，即得到本实施例所述海龙抗肿瘤活性蛋白10mg。采用MTT法测试本实施例所得活性蛋白的抗肿瘤活性，当药物浓度为 0.2mg/ml时，海龙抗肿瘤活性蛋白对LOVO人结肠癌细胞株)、A549 (人肺癌细 胞株)、L1210 (小鼠白血病细胞株)、CCRF-CEM (人白血病细胞株)的抑制率分 别为53.2%、 57.2%、 51.3%、 58.4%。实施例3(1) 尖海龙药材低温烘干，粉碎，过20目筛。(2) 取100g尖海龙粉末，加入600ml蒸馏水，匀浆3次，每次30s，于4 。C 冰箱中冷浸16小时，4800rpm离心30min，移出上清液，即为尖海龙蛋白粗提 液。(3) 将(2)中获得的尖海龙蛋白粗提液于4(TC减压浓縮至200ml，得尖海 龙蛋白分离液。(4) 在搅拌的同时向尖海龙蛋白分离液中加入硫酸铵粉末至55%饱和度，4 。C静置过夜使其充分沉淀，4800rpm离心30min ，收集沉淀，将沉淀用少量 蒸馏水溶解后透析、浓縮、冷冻干燥，即得尖海龙粗蛋白。(5) 尖海龙粗蛋白用pH8. 4、 20mmol/LTris-HCl缓冲液溶解，用DEAE离子 交换层析柱进行离子交换层析，依次用含0、 0.1、 0.2、 0.3和0. 5 mol/L NaCl 的pH8.4、 20咖ol/L Tris-HCl缓冲液洗脱，紫外检测仪于280nm波长处检测， 收集0.3mol/L NaCl的洗脱组分，透析、浓縮、冷冻干燥后，获得尖海龙抗肿瘤粗蛋白。(6)海龙抗肿瘤粗蛋白用pH8.4、 20ramol/L Tris-HC1缓冲液溶解，用 S叩erdex-75凝胶柱进行凝胶过滤层析，用pH8. 4、 20ramol/L Tris-HCl缓冲液 洗脱，紫外检测仪于280nm波长处检测，收集第一个洗脱峰组分，透析、浓縮后 冷冻干燥，即得到本实施例所述海龙抗肿瘤活性蛋白6.8mg。釆用MTT法测试本实施例所得活性蛋白的抗肿瘤活性，当药物浓度为 0.2mg/ml时，海龙抗肿瘤活性蛋白对LOVO人结肠癌细胞株)、A549 (人肺癌细 胞株)、L1210 (小鼠白血病细胞株)、CCRF-CEM (人白血病细胞株)的抑制率分 别为71.2%、 56.2%、 54.3%、 63.4%。
权利要求
1.一种尖海龙抗肿瘤活性蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤第一步，以尖海龙为原料，粉碎后过筛，待用；第二步，在尖海龙粗粉中加入蒸馏水，匀浆、浸泡，离心后取上清液，即为尖海龙蛋白粗提液；第三步，将尖海龙蛋白粗提液减压蒸发浓缩后，加入硫酸铵粉末，充分搅拌后静置，离心，收集沉淀，将沉淀用少量蒸馏水溶解后透析、浓缩、冷冻干燥，即得到尖海龙粗蛋白；第四步，将尖海龙粗蛋白用Tris-HCl缓冲液溶解，进行离子交换层析，用梯度NaCl缓冲液洗脱，紫外检测仪于280nm波长处检测，得到数个浓度NaCl缓冲液的洗脱组分，经透析、浓缩、冻干后经体外抗肿瘤活性检测，0.3mol/L NaCl缓冲液洗脱部分具有抗肿瘤活性，即为尖海龙抗肿瘤粗蛋白；第五步，将尖海龙抗肿瘤粗蛋白用Tris-HCl缓冲液溶解后，进行凝胶过滤层析，用Tris-HCl缓冲液洗脱，紫外检测仪于280nm波长处检测，收集蛋白质洗脱液，透析、浓缩、冷冻干燥后，经体外抗肿瘤活性检测，第一个洗脱峰具有抗肿瘤活性，即获得海龙抗肿瘤活性蛋白。
2. 根据权利要求1所述的尖海龙抗肿瘤活性蛋白的制备方法，其特征是， 所述的第一步中，加入尖海龙粗粉6倍-12倍重量的蒸馏水。
3. 根据权利要求1所述的尖海龙抗肿瘤活性蛋白的制备方法，其特征是， 所述的第二步中，浸泡，是指置于4 'C冰箱中浸泡8小时-16小时。
4. 根据权利要求1所述的尖海龙抗肿瘤活性蛋白的制备方法，其特征是， 所述的第三步中，蛋白粗提液减压蒸发浓縮是在40。C -50 。C条件下。
5. 根据权利要求1或4所述的尖海龙抗肿瘤活性蛋白的制备方法，其特征 是，所述的第三步中，加入硫酸铵粉末使硫酸铵浓度达到55%-85%饱和度。
6. 根据权利要求1或4所述的尖海龙抗肿瘤活性蛋白的制备方法，其特征 是，所述的第三步中，在4 。C静置。
7. 根据权利要求1所述的尖海龙抗肿瘤活性蛋白的制备方法，其特征是，所述的第四和第五步中，Tris-HC1缓冲液是指pH8.4、 20mmol/L Tris-HCl缓 冲液。
8.根据权利要求l或7所述的尖海龙抗肿瘤活性蛋白的制备方法，其特征 是，所述的第四步中，梯度NaCl缓冲液洗脱是指依次用含有Omol/L、0. 1 mol/L、 0.2 mol/L、 0.3 mol/L和0. 5 mol/L NaCl的pH8. 4、 20,1/L Tris-HCl缓冲 液进行洗脱。
全文摘要
一种医药技术领域的尖海龙抗肿瘤活性蛋白的制备方法，步骤为(1)以尖海龙为原料，粉碎后过筛；(2)在尖海龙粗粉中加入蒸馏水，制取尖海龙蛋白粗提液；(3)将蛋白粗提液减压蒸发浓缩后，加入硫酸铵粉末进行沉淀，将沉淀用少量蒸馏水溶解，透析，浓缩，冻干后得到尖海龙粗蛋白；(4)将尖海龙粗蛋白用Tris-HCl缓冲液溶解后，进行离子交换层析，梯度NaCl缓冲液洗脱获得尖海龙抗肿瘤粗蛋白；(5)将尖海龙抗肿瘤粗蛋白用Tris-HCl缓冲液溶解，进行凝胶过滤层析，获得尖海龙抗肿瘤活性蛋白。本发明制得的尖海龙抗肿瘤活性蛋白，纯度高，经检测具有抗肿瘤活性。
文档编号C07K1/00GK101215317SQ20081003274
公开日2008年7月9日 申请日期2008年1月17日 优先权日2008年1月17日
发明者李晓波, 王梦月, 聂玉晓, 鞠培俊 申请人:上海交通大学