检测卵巢癌肿瘤标志物he4蛋白的方法

专利名称：检测卵巢癌肿瘤标志物he4蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测卵巢癌肿瘤标志物HE4蛋白的方法，尤其涉及一种使用具有 高敏感性和特异性的时间分辨荧光免疫检测技术实时监测血液样品中HE4蛋白的方法。
背景技术：
卵巢恶性肿瘤(卵巢癌)由于发病隐匿，被形容为最致命的癌症之一。卵巢癌的 早期症状很不明显，初期症状只是腹部疼痛或膨胀、肠胃消化不良，而未引起足够的重视。 仅2004年，美国约有24，000名妇女患卵巢癌，而有14，000名妇女死于卵巢癌。全世界范 围内，估计每年有190，000新增病例，有114，000例死亡病例。如果能在早期诊断将会提高治愈率，不幸的是，卵巢癌患者发现时往往已经到了 晚期，四例卵巢癌病人中三例在晚期才被诊断，延误了病情。传统的治疗方法，包括手术、化 学药物治疗、放射治疗及综合治疗等，仍难以治愈卵巢癌，其存活率小于20%，并容易旧病 复发。因此，提高卵巢癌的早期诊断水平、监测其治疗效果是新近妇科肿瘤研究关注的热点。目前使用CA125标志物的检测方法能够诊断出末期的卵巢癌，但不能够非常有效 地诊断出初期的卵巢癌，且有时还会呈现“误导性”的结果。CA125是一种肿瘤表面抗原。 上皮组织产生病变，体内就会产生CA125，因此上皮组织的癌症一般会使血液中的CA125上 升。但与其他多数肿瘤标记物一样，CA125没有百分百的“标准值”，即不是只有癌症才会使 CA125上升，子宫内膜异位症、骨盆腔发炎时，也会导致CA125上升，所以利用CA125来诊断 是否患有癌症，并不是那么准确。此外，不是每一种卵巢癌都是属于上皮细胞肿瘤，有些是 胚胎组织或腺体细胞的肿瘤，因此CA125不会出现变化。使用CA125标志物的检测方法不 可避免的存在一些缺陷。因此，迫切需要一个特异性和敏感性较强的标志物来提高卵巢癌 的诊断水平。现今，将基因与蛋白质组技术相结合，已筛选出卵巢癌HE4差异蛋白，并且证明 HE4是WFDC2基因的产物。HE4这一新的标志物在良性肿瘤及正常组织中含量极低，但在卵 巢癌中含量很高。基因芯片技术也显示，HE4与MSLN在卵巢癌中高表达，更重要的是，HE4 在19例CA125 > 30U/ml的良性肿瘤组织中不增殖。双盲实验的结果也显示，HE4在卵巢 癌方面的诊断优于CA125。更多的实验可以证明HE4是一个非常有诊断意义的肿瘤标记物， 也有报道称HE4在卵巢癌中高表达，而在肺癌、肝癌、肾癌、甲状腺癌中未见表达。尽管有报 道称HE4基因也表达于正常组织中，这暗示HE4蛋白并非肿瘤特异性蛋白，但是，能作为新 的标记物来提高卵巢癌诊断的敏感性。目前世界上对于卵巢癌的诊断用的最多的还是检测CA125，已建立的方法主要包 括酶联免疫吸附法(ELISA)，免疫荧光法(FAT)和化学发光(CLIA)。其中，ELISA方法和 FAT方法由于受其灵敏度和特异性的限制，无论是检测抗原还是抗体，都很难满足早期诊断 的需要。时间分辨荧光检测(TR-FIA)仪(DELFIA1235，Wallac)检测荧光值(CPS)。TR-FIA技术是利用能够发射长寿命荧光的荧光化合物作为示踪物，标记被检分子(配体或配基) 并形成络合物例如镧系金属离子络合物，通过免疫学反应即可在具有较短寿命的本底荧光 消失后对被标记物发出的荧光信号进行时间分辨检测。其中被标记物可以是参与反应体系 (如抗原抗体反应、核酸探针杂交、生物素亲和素反应以及靶细胞对效应细胞的杀伤反应 等)的任何一种配体或配基。待反应体系形成并发生配体与其配基的反应后，可使用时间 分辨荧光免疫方法检测反应结合物的荧光强度。基于对反应结合物的荧光强度与已知量分 析物所产生的相对荧光强度的比较，即可利用标准曲线确定反应体系中分析物的浓度。在常规荧光测定中，由于样品检测体系中含有多种荧光成分(例如来自样品中的 胶体颗粒和溶剂分子引起的散射光，以及血清中蛋白质和其他化合物发出的非特异性荧 光)，导致本底荧光过大，从而限制了荧光分析方法的广泛使用。与常规免疫荧光方法不同， 时间分辨荧光免疫检测技术(TR-FIA)则是基于镧系金属元素(特别是铕)能够发射具有 较长衰变期(约为传统荧光的103-106倍)和较大Mokes位移(为普通荧光素Mokes位 移的10倍以上)的特殊荧光(发射波波长为615nm)这一性质，以其标记构成检测体系的 配体或配基。因此，可以几乎完全避免体系中与某些类型的蛋白质有关的激发波(波长为 340nm)和瞬时本底荧光(波长为350-600nm)的干扰，从而可借助时间延迟和波长分辨，大 大提高检测的准确性和灵敏度。与目前普遍使用的放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA) 及化学发光免疫分析和电化学发光免疫分析(ECLIA)相比，TR-FIA方法具有灵敏度高、示 踪物稳定、不受样品自然荧光干扰、无放射性污染等多方面的优点，是各种生物医学研究和 临床超微量生化检验手段中的一种优选方法。该技术已在病原体检测、内分泌检查、肿瘤检 查、遗传学检查、血液学检测和细胞学检查等多方面得到普遍应用。发明目的本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供了一种针对卵巢癌的更为高效率、 高敏感性的检测方法。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的一种检测卵巢癌肿瘤标志物HE4蛋白的方法，包括以下步骤(1)HE4基因的获取和克隆；(2)重组表达质粒的构建及鉴定；(3)表达产物分析；(4)抗HE4蛋白抗体的制备；(5)抗HE4蛋白抗体的纯化和Eu3+标记；(6)使用本发明的抗HE4蛋白抗体，以双抗体夹心时间分辨荧光检测技术 (TR-FIA)检测血液样品中HE4蛋白的含量。本发明的有益效果是本发明提供了抗HE4蛋白抗体，再结合已知的时间分辨荧 光检测技术，可以在卵巢癌发生的早期从极微量临床样品中准确地检测到HE4的存在。因 此，基于TR-FIA技术的高度灵敏度、特异性和选择性，本发明建立的卵巢癌标志物HE4蛋白 检测方法为实现卵巢癌的早期诊断提供了重要的临床判断依据。本发明建立了一套行之有 效的可以在早期诊断卵巢癌的检测方法，为早期卵巢癌的诊断提供了一种高灵敏度、高特 异性的检测手段。


图1是经RT-PCR扩增HE4基因的结果。其中，泳道1是分子量标志；泳道2是PCR 产物；图2是T-A克隆重组子的酶切鉴定。其中，泳道2-4是T-A重组载体的EcoRI+Xhol I酶切片段；泳道1是分子量标志；图3显示重组蛋白的SDS-PAGE分析。其中，泳道5是蛋白质分子量标准；泳道1_2 是PGEX-HE4/BL21在IPTG诱导前后工程菌全细胞(1，诱导后；2，诱导前)；3 4含空载体 PGEX-4T-1的受体菌全细胞(4，诱导前；5，诱导后)；图4是重组蛋白的ffestern-blot分析。其中，泳道1是蛋白质分子量标准；泳道2 是经诱导的HE4蛋白的Western blot分析，泳道3是经诱导的PGEX-4T-1的Western blot 分析；图5是抗HE4蛋白单克隆抗体的亚型分析结果；图6是纯化的抗HE4蛋白的单克隆抗体的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)图谱 其中A是6B8，B是10D2 ；图7是按本发明方法检测HE4蛋白得到的标准曲线。
具体实施例方式将基因与蛋白质组技术相结合，成功筛选出卵巢癌HE4差异蛋白，并且证明HE4是 WFDC2基因的产物。HE4这一新的标志物在良性肿瘤及正常组织中含量极低，但在卵巢癌中 含量很高。基因芯片技术也显示，HE4与MSLN在卵巢癌中高表达，更重要的是，HE4在19例 CA125 > 30U/ml的良性肿瘤组织中不增殖。通过设计针对HE4蛋白的高效检测方法，可以 更特异、更敏感地检测早期卵巢癌的发病情况，从而可以有效提高初期卵巢癌的检测及诊 断水平。本发明建立的卵巢癌标志物HE4蛋白检测方法，是通过以下步骤实现的1.获取并克隆HE4基因卵巢癌细胞在含10% (M/V)的小牛血清的1640培养基中培养，当细胞数达到 1 X 107，用TRIzol试剂提取总RNA，按Genebank中HE4的cDNA编码区序列设计引物。上游引物Pl :5，ACTGAGAATTCATGCCTGCTTGTCGCC，(SEQ ID NO 1)下游引物P2 :5，ATGCTCTCGAGTCAGAAATTGGGAGTGAC，(SEQ ID NO:2)以提取的适量 总RNA为模板进行反转录，然后PCR扩增目的条带，电泳显示在约400bp处有一特异扩增条 带，与报道的Genebank中的序列(Accession number AY212888)大小一致(图1)。2.构建并鉴定重组表达质粒获得目的基因HE4后，将HE4基因克隆至T载体中，然后进行DNA测序，确证序列 的正确性。PCR产物经酚/氯仿抽提、乙醇沉淀后溶解于水中。将PCR产物与PMD18T载体 置16°C水浴连接过夜。将连接混合物转化入感受态细胞。被转化的细胞经37°C培养过夜挑 取9个单菌落，分别培养后，以提取的质粒DNA为酶消化的底物，用EcoRI、Xhol I双酶切， 消化后的片段经DNA电泳产生一条约400bp的片段(图2)。将酶切产物克隆至PGEX-4T-1 表达载体中，命名为PGEX-HE4重组载体。3.表达产物分析
将阳性克隆株活化后，加入IPTG 30°C诱导培养4小时收菌。经SDS-PAGE检测， 可见重组子表达产物显示为一条分子量约为39KDa的新的蛋白条带(图幻。将重组蛋白 纯化后作为抗原并使用鼠抗HE4蛋白血清对表达产物进行ELISA分析，结果可见鼠抗HE4 蛋白血清能够与PGEX-HE4表达产物反应，而与BL21和pGEX_4T_l转化菌的表达产物无反 应。然后将工程菌的表达产物电转移至硝酸纤维素膜上，以鼠抗HE4蛋白血清为抗体进行 Western印迹分析，结果显示在39KDa蛋白处出现一特异性反应条带，而pGEX_4T_l转化的 细菌则未见相应的带(图4)。4.制备抗HE4蛋白的抗体使用19-21周龄的Balb/C小鼠作为被免疫动物。首先用纯化的重组HE4蛋白 75 μ g加等体积完全弗氏佐剂乳化后，皮下多点注射进行基础免疫。再进行两次加强免疫。 末次免疫后，从动物的尾静脉采血并测试抗体效价。必要时，可于处死动物分离脾细胞前3 天，再加强免疫一次。血清抗体效价达到足够的水平后，分离脾细胞，按适当比例将被免疫 小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞混合并在PEG-4000作用下融合之。适当稀释纯化的重组HE4蛋白后，用所得稀释液包被微量滴定板，然后以间接 ELISA法检测杂交瘤阳性克隆，并用有限稀释法对检出的阳性克隆进行亚克隆。经四次亚克 隆后，共筛选出15株分泌抗HE4蛋白的杂交瘤细胞株。经配对实验得到两株可与HE4蛋白 发生反应，且可与不同结合位点结合的单克隆抗体(6B8和10D2)。ELISA试验表明，在体外 培养条件下，得自杂交瘤培养物上清的抗体6B8和10D2的效价分别为1 512、1 256。 在体内培养条件下，得自动物腹水液的抗体效价为分别1 25600、1 12800。进一步的抗 体分型实验结果显示，6B8和10D2杂交瘤细胞分泌的抗体类型均为IgGl。5.纯化并Eu3+标记抗HE4蛋白抗体纯化腹腔内接种杂交瘤(细胞株10拟)后得到的小鼠腹水液，然后充分透析。最 后将其中的蛋白质浓度调整到5.0mg/ml。SDS-PAGE分析可见，纯化后的抗体在电泳凝胶上 显示为两条带(轻链和重链，见附图6)。ELISA检测结果表明抗体效价与纯化前基本相同。向111^(20(^1^)单抗1002溶液中加入0.511^ DTTA并调整pH值至8. 5，然后于4°C 保温4小时。保温后将溶液对生理盐水透析6小时以上，然后加入EuCl3溶液(33mmol/L， 3(^0，并于41下继续保温10小时，以标记抗体蛋白质。标记反应完成后，用Superdex 200柱纯化所得到的反应溶液，并用含0. 9% (MA)NaCl的Tris-HCl缓冲液(50mmol/L，pH 7. 6)洗脱液洗脱。参照Eu3+标准品，计算标记产物中平均每个抗体蛋白分子所结合的Eu3+ 离子数目。过滤标记产物后，并加入终浓度为0. 1% (M/V)胎牛血清白蛋白(BSA)，于-20°C 或-70°C保存备用。6.使用本发明的抗HE4蛋白抗体，以双抗体夹心时间分辨荧光检测技术(TR-FIA) 检测血液样品中HE4蛋白的含量。实验采用标准的双抗体夹心法完成。其中所使用的参考标准品是分别有以下浓 度的冊4蛋白的溶液0、0.2、1、5、25和150叫/!111。所使用的洗涤液是含有0. 1 % (V/V) Tween-20 和 0. 9% NaCl 的 Tris-HCl 缓冲液(50mmol/L，ρΗ7· 6)。用 Na2C03/NaHC03 缓冲溶 液将如上方法纯化的抗HE4蛋白抗体6B8 (作为第一抗体)蛋白浓度稀释至5 μ g/ml，并按 每孔200μ 1的体积加至96孔微量滴定板的各孔中，然后4°C孵育M小时。孵育后，用洗涤 液冲洗3次，并于每孔内各加入含0. 1% Tween-20的1% (M/V)FBSA 250 μ 1。37°C封闭孵育8小时后，再次用洗涤液洗3次，然后冻干即制成单克隆抗体包被的微量滴定板。于4°C 或-20°C下保存备用。实际检测时，按顺序分别向抗体预包被的小孔内加入阴性和阳性对照样品、参考 标准品及待检样本各100 μ 1。用薄膜贴封后，缓慢振荡下室温孵育1小时。孵育后，用洗 涤液洗涤小孔4次并风干，然后每孔内再加入上述铕标记的抗ΗΕ4蛋白抗体10D2(100y 1) (作为第二抗体)。用薄膜贴封各小孔，并在缓慢振摇下室温孵育1小时。孵育后再用洗涤 液洗6次并风干，每孔各加入增强液100 μ 1，密封和缓慢振荡条件下继续室温孵育5分钟。 然后用时间分辨荧光检测仪(DELFIA1235，Wallac)检测荧光值(CPS)。本发明的一个目的是提供一种检测生物学体液样品中可能存在的卵巢癌标记物 HE4抗原的方法，该方法包括(1)提供可与卵巢癌标记物HE4抗原结合的第一抗体并用所说的抗体包被固相载 体；(2)向步骤⑴的被包被的固相内加入待检生物学体液样品和对照样品并于适当 的条件下保温；(3)反应后充分洗涤所说的固相并加入适当量镧系金属离子标记的、可与HE4蛋 白结合的第二抗体并再次保温；(4)反应后充分洗涤所说的固相并检测与第二抗体结合的镧系金属离子发射的荧 光值；(5)将所测得的荧光值与平行测得的已知量标准品的荧光相比较以确定样品中 HE4蛋白的存在及其相对量。根据本发明的一个优选实施方案，所说的第一抗体和第二抗体是可分别与HE4蛋 白的不同抗原表位结合的单克隆抗体。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的镧系金属离子是铕。根据本发明的另一个优选实施方案，其中所说的生物学体液样品选自血清。根据本发明的再一个优选实施方案，其中所说的固相是具有足够的免疫球蛋白吸 附能力的微量滴定板。根据本发明的再一个优选实施方案，其中所说的检测是使用时间分辨荧光免疫技 术完成的。本发明的另一个目的是提供用于本发明的检测方法的抗HE4蛋白的抗体，特征在 于所说的抗体可与HE4蛋白的特定抗原决定基区域结合，并可与镧系金属离子形成络合 物。根据本发明的再一个优选实施方案，如上限定的抗体包括可与HE4蛋白的不同抗 原决定簇特异性结合的第一和第二抗体。根据本发明的再一个优选实施方案，如上限定的抗体是单克隆抗体。本发明的再一个目的是提供用于检测生物学血清样品中HE4蛋白的时间分辨荧 光免疫检测方法的试剂盒，其中包括可同时与固相和HE4蛋白结合的第一抗体，以及可与 HE4蛋白结合并且偶联了镧系金属离子的第二抗体。使用本发明提供的抗HE4蛋白抗体和已知的时间分辨荧光检测技术，可以在卵巢 癌发生的早期从极微量临床样品中准确地检测到HE4的存在。因此，基于TR-FIA技术的高度灵敏度、特异性和选择性，本发明建立的卵巢癌标志物HE4蛋白检测方法为实现卵巢癌 的早期诊断提供了重要的临床判断依据。在实验室研究的基础上，我们使用本发明的方法检测了包括89例已确诊病例、56 例疑似病例和93例正常人群的共238份临床血清样品。结果显示，89例临床病人的样品 中，有64例确定为HE4蛋白阳性(阳性检出率为71. 9% ) ；56例疑似病人中，有18例检测 为HE4蛋白阳性(阳性检出率为32. 1%) ；93例健康自愿者的样品则全部为HE4蛋白阴性。 如果以所有89例临床确诊病例作为真阳性病例，并将所有93例正常人定为真阴性，由此可 以计算出本发明方法的灵敏度为71.9%，特异性为100%，而且检测的灵敏度很高(可检测 的HE4蛋白浓度下限在0. 2ng/ml以下)。因此，本发明的方法足可以为卵巢癌的早期诊断 提供可靠的临床检验数据。另外，还应指出的是，虽然用于本发明方法和试剂盒的第二抗体通常是与预先标 记或结合了镧系金属离子(例如铕)的，但第二抗体也可以是与所说的镧系金属离子分离 并在检测样品时临时偶联在一起的。实施例实施例1本实施例举例描述本发明的HE4蛋白检测方法中所涉及的材料及其制备。(1)HE4基因的获取和克隆卵巢癌细胞在含10%的小牛血清的1640培养基中培养，当细胞数达到1X107，用 TRIzol试剂提取总RNA，按Genebank中HE4的cDNA编码区序列设计引物。上游引物Pl :5，ACTGAGAATTCATGCCTGCTTGTCGCC，(SEQ ID NO 1)下游引物P2 :5，ATGCTCTCGAGTCAGAAATTGGGAGTGAC，(SEQ ID NO 2)反应体系 50μ 1 :RNase Free dH20 27 μ1、Total RNA 2μ IUOXone step RNA PCR buffer 5 μ UdNTP Mixture 1 μ 1、MgCl2 10 μ URNase inhibitor 1 μ UAMV RTase XL 1 μ l.AMV-Optimized Taq 1 μ 1、上游引物、下游引物各1 μ 1。混勻，在50°C RT反应15 分钟，再在94°C中变性anin灭活RTase。按下列条件于进行PCR，94°C变性Imin，62°C退火 lmin，72°C延伸lmin，共进行35次循环，最后再于72°C延伸lOmin。扩增产物用琼脂 糖凝胶电泳检测。电泳显示在约400bp处有一特异扩增条带，与报道的Genebank中的序列 (Accession number AY212888) 一致(图 1)。(2)重组表达质粒的构建及鉴定获得目的基因HE4后，在构建重组表达载体前，将HE4基因克隆至T载体中，然后 进行DNA测序，确证序列的正确性。具体方法如下PCR产物经酚/氯仿抽提、乙醇沉淀后溶解于水中。按照PMD18T试剂盒说明书，将 PCR产物与PMD18T载体置16°C水浴连接过夜。取30 μ 1连接混合物转化TGl感受态细胞。 被转化的细胞经37°C培养过夜挑取9个单菌落，分别培养后，以提取的质粒DNA作为酶消化 的底物，用EcoR I.Xhol I双酶切，消化后的片段经DNA电泳产生一条约400bp的片段(图 2)。将酶切产物克隆至PGEX-4T-1表达载体中，命名为pGEX-HE4重组载体。(3)表达产物分析将阳性克隆株接种于含有氨苄青霉素的LB培养基中保温过夜，次日按(V/ V)比例转入相应的新鲜培养液中。当培养物的OD6tltl值达到0.8时，加入IPTG至终浓度为1. 0mmOl/L，3(TC诱导培养4小时收菌。经SDS-PAGE检测，可见重组子表达产物显示为 一条分子量约为39KDa的新的蛋白条带(图3)。用制备性电泳法纯化的重组蛋白为抗原 并使用鼠抗HE4蛋白血清对表达产物进行ELISA分析，结果可见鼠抗HE4蛋白血清能够与 PGEX-HE4表达产物反应，而与BL21和pGEX_4T_l转化菌的表达产物无反应。然后将工程菌 的表达产物电转移至硝酸纤维素膜上，以鼠抗HE4蛋白血清为抗体进行Western印迹分析， 结果显示在39KDa蛋白处出现一特异性反应条带，而pGEX-4T-l转化的细菌则未见相应的 带(图4)。(4)抗HE4蛋白抗体的制备使用19-21周龄的Balb/C小鼠作为被免疫动物。首先用纯化的重组HE4蛋白 75 μ g加等体积完全弗氏佐剂乳化后，皮下多点注射进行基础免疫。2周后，以在不同完全 弗氏佐剂中乳化的同样剂量蛋白进行追加免疫。追加免疫后2周，再次用不含弗氏佐剂的 同样剂量HE4蛋白腹腔注射，以进行加强免疫。末次免疫后，从动物的尾静脉采血并测试抗 体效价。必要时，可于处死动物分离脾细胞前3天，再加强免疫一次。血清抗体效价达到足够的水平后，处死动物并分离脾细胞，按适当比例将被免疫 小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞混合并在PEG-4000作用下融合之。适当稀释纯化的重组HE4蛋白后，用所得稀释液包被微量滴定板，然后以间接 ELISA法检测杂交瘤阳性克隆，并用有限稀释法对检出的阳性克隆进行亚克隆。经四次亚克 隆后，共筛选出15株分泌抗HE4蛋白的杂交瘤细胞株。经配对实验得到两株可与HE4蛋白 发生反应，且可与不同结合位点结合的单克隆抗体(6B8和10D2)。ELISA试验表明，在体外培养条件下，得自杂交瘤培养物上清的抗体6B8和10D2 的效价分别为1 512、1 256。在体内培养条件下，得自动物腹水液的抗体效价为分别 1 25600,1 12800。进一步的抗体分型实验结果显示，6B8和10D2杂交瘤细胞分泌的抗 体类型均为IgGl。(5)抗HE4蛋白抗体的纯化和Eu3+标记用蛋白G Sepharose 4Fast Flow柱(Amersham)纯化腹腔内接种杂交瘤(细胞株 10D2)后得到的小鼠腹水液，然后于4°C磁力搅拌下对过量妝20)3溶液(pH9.3，50mmol/L) 充分透析(12小时)。最后将其中的蛋白质浓度调整到5.0mg/ml。SDS-PAGE分析可见，纯 化后的抗体在电泳凝胶上显示为两条带(轻链和重链，见附图6)。ELISA检测结果表明抗 体效价与纯化前基本相同。向111^(20(^1^)单抗1002溶液中加入0.511^ DTTA并调整pH值至8. 5，然后于4°C 保温4小时。保温后将溶液对生理盐水透析6小时以上，然后加入EuCl3溶液(33mmol/L， 30 μ L)，并于4°C下继续保温10小时，以标记抗体蛋白质。标记反应完成后，用Superdex 200柱(Amersham)纯化所得到的反应溶液，并用含 0.9% NaCl 的 Tri s-HCl 缓冲液(50mmol/L, pH 7. 6)洗脱液洗脱。参照Eu3+标准品，计算标记产物中平均每个抗体蛋白分子所结合的Eu3+离子数 目。用0. 22 μ m超滤膜过滤如此得到的标记产物，并加入终浓度为0. 胎牛血清白蛋白 (BSA)，于-20 V或-70 V保存备用。实施例2本实施例举例描述使用本发明的抗HE4蛋白抗体，以双抗体夹心时间分辨荧光检测技术(TR-FIA)检测血液样品中HE4蛋白的方法。 实验采用标准的双抗体夹心法完成。其中所使用的参考标准品是分别有以下浓度 的HE4蛋白的溶液:0、0· 2、1、5、25和150ng/ml。所使用的洗涤液是含有0. 1 % Tween-20和 0. 9% NaCl 的 Tris-HCl 缓冲液(50mmol/L, pH 7. 6)。用Na2C03/NaHC03缓冲溶液(50mmol/L，pH9. 6)将如上方法纯化的抗HE4蛋白抗 体6B8 (作为第一抗体)蛋白浓度稀释至5 μ g/ml，并按每孔200 μ 1的体积加至96孔微量 滴定板的各孔中，然后4°C孵育24小时。孵育后，用洗涤液冲洗3次，并于每孔内各加入含 0. 1% Tween-20的FBSA 250 μ 1。37°C封闭孵育8小时后，再次用洗涤液洗3次，然后 冻干即制成单克隆抗体包被的微量滴定板。于4°C或-20°C下保存备用。实际检测时，按顺序分别向抗体预包被的小孔内加入阴性和阳性对照样品、参考 标准品及待检样本各100μ 1。用薄膜贴封后，缓慢振荡下室温孵育1小时。孵育后，用洗涤液洗涤小孔4次并风干，然后每孔内再加入上述铕标记的抗ΗΕ4蛋 白抗体10D2 (100 μ 1)(作为第二抗体)。用薄膜贴封各小孔，并在缓慢振摇下室温孵育1小 时。孵育后再用洗涤液洗6次并风干，每孔各加入增强液100 μ 1，密封和缓慢振荡条件下继 续室温孵育5分钟。然后用时间分辨荧光检测仪(DELFIA1235，WallaC)检测荧光值(CPS)。TR-FIA技 术是利用能够发射长寿命荧光的荧光化合物作为示踪物，标记被检分子(配体或配基)并 形成络合物例如镧系金属离子络合物，通过免疫学反应即可在具有较短寿命的本底荧光消 失后对被标记物发出的荧光信号进行时间分辨检测。其中被标记物可以是参与反应体系 (如抗原抗体反应、核酸探针杂交、生物素亲和素反应以及靶细胞对效应细胞的杀伤反应 等)的任何一种配体或配基。待反应体系形成并发生配体与其配基的反应后，可使用时间 分辨荧光免疫方法检测反应结合物的荧光强度。基于对反应结合物的荧光强度与已知量分 析物所产生的相对荧光强度的比较，即可利用标准曲线确定反应体系中分析物的浓度。根据平行检测的已知HE4蛋白浓度的参考标准品所制作的标准曲线(附图7)，由 电脑程序自动计算出各样品的浓度值。其中同一样品平行孔间的变异系数(CV)应不高于 10%。蛋白浓度值彡0. 2ng/ml的样品判断为HE4蛋白阳性，小于0. 2ng/ml的样品则定为 阴性。上述实验证明，使用本发明提供的分别作为第一和第二抗体的两种可与HE4蛋白 的不同抗原结合位点结合的抗体(6B8和10D2)，以时间分辨荧光检测技术检测未知临床样 品中存在的HE4蛋白，其所能够检测到的最低蛋白浓度可低至0. 2ng/ml。统计学分析表明， 该方法的灵敏度约为71.9%，特异性达100 %。因此，本发明的基于时间分辨荧光检测技术的HE4蛋白检测方法，是一种检测临 床样品中HE4蛋白存在的十分准确、灵敏和快捷的方法。该方法的推广使用必将为卵巢癌 的早期诊断作出贡献。
权利要求
1.一种检测卵巢癌肿瘤标志物HE4蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)HE4基因的获取和克隆。(2)重组表达质粒的构建及鉴定。(3)表达产物分析。(4)抗HE4蛋白抗体的制备。(5)抗HE4蛋白抗体的纯化和Eu3+标记。(6)使用本发明的抗HE4蛋白抗体，以双抗体夹心时间分辨荧光检测技术(TR-FIA)检 测血液样品中HE4蛋白的含量。
2.根据权利要求1所述检测卵巢癌肿瘤标志物HE4蛋白的方法，其特征在于，所述步骤(1)具体为卵巢癌细胞在含10%(M/V)的小牛血清的1640培养基中培养，当细胞数达到 1 X IO7,用TRIzoI试剂提取总RNA，按Genebank中HE4的cDNA编码区序列设计引物；以提 取的适量总RNA为模板进行反转录，然后PCR扩增目的条带，电泳显示在约400bp处有一特 异扩增条带，该特异扩增条带即为目的基因HE4。
3.根据权利要求1所述检测卵巢癌肿瘤标志物HE4蛋白的方法，其特征在于，所述步骤(2)具体为获得目的基因HE4后，将HE4基因克隆至T载体中，然后进行DNA测序，确证序 列的正确性。PCR产物经酚/氯仿抽提、乙醇沉淀后溶解于水中。将PCR产物与PMD18T载 体置16°C水浴连接过夜。将连接混合物转化入感受态细胞。被转化的细胞经37°C培养过 夜挑取9个单菌落，分别培养后，以提取的质粒DNA为酶消化的底物，用EcoR I, Xhol I双 酶切，消化后的片段经DNA电泳产生一条约400bp的片段。将酶切产物克隆至PGEX-4T-1 表达载体中，命名为PGEX-HE4重组载体。
4.根据权利要求1所述检测卵巢癌肿瘤标志物HE4蛋白的方法，其特征在于，所述步骤(3)具体为将阳性克隆株活化后，加入IPTG30°C诱导培养4小时收菌。经SDS-PAGE检测， 可见重组子表达产物显示为一条分子量约为39KDa的新的蛋白条带。将重组蛋白纯化后作 为抗原并使用鼠抗HE4蛋白血清对表达产物进行ELISA分析，结果可见鼠抗HE4蛋白血清 能够与PGEX-HE4表达产物反应，而与BL21和pGEX_4T_l转化菌的表达产物无反应。然后 将工程菌的表达产物电转移至硝酸纤维素膜上，以鼠抗HE4蛋白血清为抗体进行Western 印迹分析，结果显示在39KDa蛋白处出现一特异性反应条带，而pGEX-4T-l转化的细菌则未 见相应的带。
全文摘要
本发明公开了一种检测卵巢癌肿瘤标志物HE4蛋白的方法，本发明提供了抗HE4蛋白抗体，再结合已知的时间分辨荧光检测技术，可以在卵巢癌发生的早期从极微量临床样品中准确地检测到HE4的存在。因此，基于TR-FIA技术的高度灵敏度、特异性和选择性，本发明建立的卵巢癌标志物HE4蛋白检测方法为实现卵巢癌的早期诊断提供了重要的临床判断依据。
文档编号G01N33/68GK102103144SQ20101053055
公开日2011年6月22日 申请日期2010年11月2日 优先权日2010年11月2日
发明者朱晓龙, 赵同峰, 黄晓 申请人:浙江大学