专利名称：一种谷糠抗肿瘤活性蛋白及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物蛋白的制备和应用，具体属于一种谷糠抗肿瘤活性蛋白及其制备方法，以及该蛋白在制备抗肿瘤药物和保健食品中的应用。
背景技术：
谷子，即粟(Setaria italica),—年生禾本科属植物,起源于我国黄河流域,我国的年产量占全世界的五分之四，华北为主要产区，其中山西是谷子的主要产地。谷糠是谷子加工成精米过程中得到的副产品，在工艺学上叫做谷糠。
《黄帝内经》认为“谷气通于脾，”谷糠味甘，性平，偏于补气，具有益气健脾，养血安神，补肾健脑之功效。谷糠与谷物同性，功同米而优于米，补而不滞，温而不燥，谷糠中含有丰富的甘油三酯、脂蛋白、谷维醇、维生素B、维生素E、葡萄糖、纤维素以及微量元素等，能够排出人体内的毒素，有健脑、补肾、强身、抗癌等作用，经常食用谷糠，可以增强人体的免疫功能，防病健身。所以谷糠这一资源的深度开发和有效利用将会带来很高的经济和社会价值。经对现有技术的文献检索发现，目前国内外关于谷糠的研究主要集中在其化学成分和营养价值方面，而未见关于谷糠抗肿瘤活性蛋白的报道。本发明制备的谷糠蛋白具有较强的抗肿瘤活性，而对正常细胞无毒副作用。这一发现对于谷糠的深度开发和有效增值利用具有潜在的经济价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种谷糠抗肿瘤活性蛋白及其制备方法，以及该蛋白在制备抗肿瘤药物和保健食品中的应用。本发明提供的一种谷糠抗肿瘤活性蛋白，通过包括如下步骤的方法制得第一步取谷糠，粉碎后，加入预冷的蛋白提取液，4°C下浸泡并搅拌12-16小时，离心后取上清液，即为谷糠蛋白粗提液；离心后的滤渣可重复提取1-2次；所述的蛋白提取液为20mmol/L Tris-HCl 溶液，含 O. 85% NaCl, lmmol/L PMSF,pH8. O ;所述的谷糠和蛋白提取液的重量体积比(W/V)为I : 4-6，优选I : 5;第二步在谷糠蛋白粗提液中加入2-3倍体积的-20°C预冷的丙酮沉淀蛋白1-2小时，离心，收集沉淀，在-20°C下放置20-30min，使丙酮完全挥发，冷冻干燥，得到谷糠粗蛋白；第三步将谷糠粗蛋白用pH8. 0、20mmol/L Tris-HCl缓冲液溶解，离心后取上清液，按硫酸铵溶液饱和度计算表(0°C )先加入30%饱和度的硫酸铵粉末，充分搅拌溶解后，静置30min，离心，收集上清液，再向上清液中加入85%饱和度的硫酸铵粉末，充分搅拌溶解后，静置30min，离心，收集沉淀，用pH8. 0、20mmol/L Tris-HCl缓冲液溶解、透析、浓缩即得到谷糠抗肿瘤粗蛋白；第四步将抗肿瘤粗蛋白用pH8. 0、20mmol/L Tris-HCl缓冲液溶解,过Q阴离子交换层析柱，紫外检测仪于280nm波长处检测，收集穿透峰；第五步将上述穿透液过SP-阳离子柱交换层析柱,用含O. Imol/LNaCI的pH8. O、20mmol/LTris-HCl缓冲液洗脱，紫外检测仪于280nm波长处检测，收集洗脱峰得到谷糠抗肿瘤活性纯蛋白(FMB)。第三步、第四步、第五步均在0_4°C条件下进行。采用SDS-PAGE凝胶电泳技术，通过与标准分子量比对，预估谷糠抗肿瘤活性蛋白的分子量约为36kDa。经体外抗肠癌肿瘤活性检测显示，该谷糠蛋白可明显抑制大肠癌细胞增殖和转移，用该蛋白处理大肠癌细胞48小时，平均致死率约为40%，而对正常细胞生长无明显毒副作用。该蛋白可以在制备抗肿瘤药物中应用，也可在保健食品中应用。与现有技术相比，本发明获得的抗肿瘤活性的谷糠蛋白经体外抗肿瘤活性检测，该蛋白具有良好的抗大肠癌细胞的活性，对大肠癌细胞增殖以及迁移有明显抑制作用，而对正常细胞没有明显毒副作用。
图I谷糠抗肿瘤活性蛋白SDS-PAGE电泳图(经SP柱纯化后所得纯蛋白样品，上样量为3 μ g ；FMB :目的蛋白；Marker :标准分子量)图2谷糠抗肿瘤活性蛋白FMB对细胞生长的影响图3A细胞划痕实验观察谷糠抗肿瘤活性蛋白对细胞迁移的影响图3B细胞划痕实验观察谷糠抗肿瘤活性蛋白对细胞迁移的影响(X4)
具体实施例方式实施例I谷糠抗肿瘤活性蛋白的制备(I)取30g谷糠，粉碎，加入150mL4°C下预冷的蛋白提取液(20mmol/L Tris-HCl溶液，含O. 85% NaCl，lmmol/L PMSF，pH8. O)，放在搅拌器上搅拌，于4°C冰箱中浸泡并搅拌12小时，IlOOOrpm离心30min，取上清液，滤渣再次加入150mL的蛋白提取液，同上操作，合并上清液即为谷糖蛋白粗提液。(2)将(I)中获得的谷糠蛋白粗提液中缓慢加入600mL的_20°C下预冷的丙酮，边加边摇，然后将其放入_20°C下沉淀I小时，IIOOOrpm离心30min,弃上清,收集沉淀，将沉淀放入-20°C下20min，使丙酮完全挥发，将沉淀冷冻干燥，获得75mg的谷糠粗蛋白。(3)将⑵得到的谷糠粗蛋白用IOOmL的pH8. 0、20mmol/L Tris-HCl缓冲液溶解，IIOOOrpm离心后取上清液，向溶液中逐量缓慢加入16. 4g硫酸铵粉末，饱和度达到30%，放 置30min, IlOOOrpm离心30min,收集上清。将上清液中再缓慢加入36. 2g的硫酸铵固体,达到85%的饱和度,放置30min, IlOOOrpm,离心30min,收集沉淀。将沉淀用pH8. 0、20mmol/LTris-HCl缓冲液溶解、透析(采用截留分子量IOkDa的透析袋)、浓缩获得谷糠抗肿瘤活性粗蛋白。(4)将(3)获得的谷糠抗肿瘤活性粗蛋白用pH8. 0,20mmol/LTris-HCl缓冲液溶解后，进行Q阴离子柱交换层析，用PH8. 0、20mmol/L Tris-HCl缓冲液洗脱，紫外检测仪于280nm波长处检测，收集穿透峰。
(5)将上述穿透液上样于SP阳离子层析柱，用含有O. lmol/L NaCl的pH8. O、20mmol/LTris-HCl缓冲液洗脱,紫外检测仪于280nm波长处检测，收集洗脱峰,透析,浓缩后获得浓度为O. 561mg/mL的谷糠抗肿瘤活性纯蛋白(FMB)4. 668mg。步骤(3)、⑷、(5)均在0-4 °C条件下进行。实施例2 :谷糠抗肿瘤活性蛋白FMB对细胞生长的影响将对数生长期的DLD1、SW480、SW620、HL-7702细胞，以I X IO4个/孔传入96孔培养板。37C含5%的CO2培养箱孵育24h后，分别加入实施例I的谷糠活性蛋白20 μ L，设五个复孔，并用相同体积的ΡΗ8. 0、20mmol/L Tris-HCl缓冲液作为对照。孵育48h后吸弃孔内液体。PBS洗涤2次后加入新培养基，每孔加MTT溶液(5mg/mL) 20 μ L，继续孵育4h后终止培养。小心吸弃孔内培养上清液，每孔加150μ LDMS0，振荡lOmin，使结晶物充分融解。在酶联免疫监测仪上570nm波长处，测定各孔光吸收值。 本发明所得谷糠活性蛋白FMB，对人大肠癌细胞株进行上述体外抗肿瘤活性检测，结果表明当FMB的终浓度为O. 09 μ g/μ L时，对DLDl细胞生长的抑制率约为40 %、对SW480细胞生长抑制率约为38%、对SW620细胞生长抑制率约为38%、而对人正常肝细胞HL-7702生长基本无影响(如图2所示)。实施例3 :细胞划痕实验观察谷糠抗肿瘤活性蛋白对细胞迁移的影响将DLDl和HL-7702细胞以5 IOX IO5个/孔密度接种到24孔板上，细胞贴壁并形成单层细胞后，用10 μ L无菌移液枪枪头垂直划线，PBS洗涤，显微镜下测量划痕直径，并分别设有实验组和对照组。实验组加入实施例I的谷糠抗肿瘤活性纯蛋白(FMB) 100 μ L，对照组加入相同体积的ΡΗ8. 0、20mmol/L Tris-HCl缓冲液。分别孵育24h、48h后，显微镜下测量划痕处细胞向外移动的距离。细胞划痕实验结果表明本发明纯化获得的谷糠活性蛋白FMB，当FMB的终浓度为
O.09 μ g/ μ L时，对大肠癌DLDl细胞株的迁移有抑制作用，且该抑制作用在蛋白处理24h、48h时均达到极显著(P < O. 01);而对正常肝细胞HL-7702的迁移无明显作用(P > O. 05)，(如图3A、图3B所示)。
权利要求
1.一种谷糠抗肿瘤活性蛋白，其特征在于，通过包括如下步骤的方法制得 第一步取谷糠，粉碎后，加入预冷的蛋白提取液，4°c下浸泡并搅拌12-16小时，离心后取上清液，即为谷糠蛋白粗提液； 所述的蛋白提取液为 20mmol/L Tris-HCl 溶液，含 O. 85% NaCl，lmmol/L PMSF,pH8. O ；所述的谷糠和蛋白提取液的重量体积比为I : 4-6; 第二步在谷糠蛋白粗提液中加入2-3倍体积的-20°C预冷的丙酮，沉淀蛋白1-2小时，离心，收集沉淀，在-20°C下放置，使丙酮完全挥发，冷冻干燥，得到谷糠粗蛋白； 第三步将谷糠粗蛋白用PH8. 0、20mmol/L Tris-HCl缓冲液溶解，离心后取上清液，按(TC下硫酸铵溶液饱和度计算表，先加入30%饱和度的硫酸铵粉末，充分搅拌溶解后，静置，离心，收集上清液，再向上清液中加入85%饱和度的硫酸铵粉末，充分搅拌溶解后，静置，离心，收集沉淀，用pH8. 0、20mmol/L Tris-HCl缓冲液溶解、透析、浓缩即得到谷糠抗肿瘤粗蛋白； 第四步将抗肿瘤粗蛋白用pH8.0、20mmol/L Tris-HCl缓冲液溶解，过Q阴离子交换层析柱，紫外检测仪于280nm波长处检测，收集穿透峰； 第五步将上述穿透液过SP-阳离子柱交换层析柱，用含O. Imol/LNaCI的pH8. O、20mmol/LTris-HCl缓冲液洗脱，紫外检测仪于280nm波长处检测，收集洗脱峰得到谷糠抗肿瘤活性蛋白。
2.如权利要求I所述的一种谷糠抗肿瘤活性蛋白，其特征在于，第一步中所述的谷糠和蛋白提取液的重量体积比为I : 5。
3.如权利要求I所述的一种谷糠抗肿瘤活性蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。
4.如权利要求I所述的一种谷糠抗肿瘤活性蛋白在制备保健食品中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种谷糠抗肿瘤活性蛋白及其制备方法，以及该蛋白在制备抗肿瘤药物和保健食品中的应用。其制备方法是将纯天然谷糠粉碎，加入蛋白提取液低温过夜提取，随后加入预冷的丙酮低温沉淀蛋白，得到谷糠粗蛋白。在粗蛋白提取液中加入不同饱和度的硫酸铵粉末，分级沉淀蛋白，将硫酸铵沉淀的蛋白过Q阴离子交换层析柱，收集穿透液，再将其过SP阳离子交换层析柱，用0.1mol/L Tris-NaCl洗脱液洗脱，收集洗脱峰得到谷糠抗肿瘤活性纯蛋白(FMB)。该蛋白可明显抑制大肠癌细胞增殖和转移，可以在制备抗肿瘤药物和保健食品中应用。
文档编号A61P35/00GK102617718SQ201210084160
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月27日 优先权日2012年3月27日
发明者单树花, 李卓玉, 李宗伟, 李砧, 武海丽 申请人:山西大学