专利名称：一种压电蛋白芯片的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物芯片的制作方法，特别是一种压电蛋白芯片的制作方法。
背景技术：
目前，蛋白芯片可分为化学型蛋白芯片和生物化学型蛋白芯片两种。其中化学型蛋白芯片是基于经典的色谱介质，其基本原理是在蛋白芯片表面铺上特定的介质，通过介质的疏水力、静电力以及共价键等结合样品中的蛋白质，然后用特定的洗脱液洗去杂质蛋白，而保留特定的蛋白质进行分析。而生物化学型蛋白芯片是把生物活性分子(如抗原、抗体或受体、配体等)固定到芯片表面，用于结合样品中的互补靶蛋白。由于生物化学型蛋白芯片具有较高的特异性和生物活性分子的多样性，因此其应用范围和前景都远远超过了化学型蛋白芯片。但是，目前这些传统的蛋白芯片对实验操作要求高，反应体系严格，由于人为因素产生的误差较大，结果不稳定，并且检测仪器设备价格昂贵，检测成本高，因而无法大批量生产和使用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用石英晶体的压电原理及酶的免疫反应原理制成通过检测自身工作时产生的谐振频率进行免疫学检测、分析和诊断，且检测精确度高、稳定性好、操作简单、制作工艺简单的压电蛋白芯片的制作方法。
本发明的技术方案是这样实现的
一种压电蛋白芯片的制作方法，其特点在于包括如下步骤(1)预处理将晶体依次用丙酮、无水乙醇、净水进行清洗；清洗后将晶体置于氮气或洁净空气环境下进行干燥和测频，然后再用净水进行清洗，再置于氮气或洁净空气环境下进行干燥和测频，反复直至相邻两次频率小于10HZ；(2)在晶体表面固定聚乙烯亚胺用点样器在晶体表面滴加聚乙烯亚胺，并将晶体置于20℃～40℃环境下晾干，然后依次用无水乙醇、净水进行清洗；清洗后将晶体置于氮气或洁净空气环境下进行干燥和测频，再用净水进行清洗，再置于氮气或洁净空气环境下进行干燥和测频，反复直至相邻两次频率小于10HZ；(3)在晶体表面固定戊二醛用点样器在晶体表面滴加戊二醛，并将晶体放置在20℃～40℃环境下反应10～30分钟；然后用净水进行清洗，清洗后将晶体置于氮气或洁净空气环境下进行干燥和测频，再用净水进行清洗，再置于氮气或洁净空气环境下进行干燥和测频，反复直至相邻两次频率小于10HZ；(4)在晶体表面固定抗体或抗原用点样器在晶体表面滴加抗体或抗原，并将晶体放置在20℃～40℃环境下反应30～100分钟，然后依次用含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲溶液、净水进行清洗；清洗后将晶体置于氮气或洁净空气环境下进行干燥和测频，再用净水进行清洗，再置于氮气或洁净空气环境下进行干燥和测频，反复直至相邻两次频率小于10HZ，最后制得压电蛋白芯片。
其中，上述方法步骤最后还包括对晶体进行封阻用点样器在晶体表面滴加封阻剂，并将晶体放置在20℃～40℃环境下反应15～45分钟，然后依次用含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲溶液、净水进行清洗；清洗后将晶体置于氮气或洁净空气环境下进行干燥和测频，再用净水进行清洗，再置于氮气或洁净空气环境下进行干燥和测频，反复直至相邻两次频率小于10HZ，最后制得进行免疫反应检测所需的压电蛋白芯片。
本发明由于采用将生物芯片做成通过检测自身工作时产生谐振频率来进行免疫学检测的压电蛋白芯片的制作方法，使本发明利用该方法制成压电蛋白芯片，通过检测仪器检测压电蛋白芯片在没有滴加检测样品之前工作时产生频率与滴加检测样品并发生免疫反应之后的频率差而实现对临床样品(如对输血四项指标乙肝、丙肝、艾滋、梅毒；禽流感、肿瘤标志物等)的检测、分析与诊断。不仅检测速度快、精确度高、稳定性好，而且对检测仪器要求低、检测操作过程简单，可广泛推广和应用。本发明具有制作工艺过程简单，制作方法简便，适合于批量生产，和可实现对多种蛋白质样品进行检测与分析等特点。
下面对本发明作进一步的详细说明具体实施方式
本发明所述的一种压电蛋白芯片的制作方法，其包括如下步骤(1)预处理将晶体依次用丙酮、无水乙醇、净水进行清洗；清洗后将晶体置于氮气或洁净空气环境下进行干燥和测频，然后再用净水进行清洗，再置于氮气或洁净空气环境下进行干燥和测频，反复直至相邻两次频率小于10HZ；(2)在晶体表面固定聚乙烯亚胺用点样器在晶体表面滴加聚乙烯亚胺，并将晶体置于20℃～40℃环境下晾干，然后依次用无水乙醇、净水进行清洗；清洗后将晶体置于氮气或洁净空气环境下进行干燥和测频，再用净水进行清洗，再置于氮气或洁净空气环境下进行干燥和测频，反复直至相邻两次频率小于10HZ；(3)在晶体表面固定戊二醛用点样器在晶体表面滴加戊二醛，并将晶体放置在20℃～40℃环境下反应10～30分钟；然后用净水进行清洗，清洗后将晶体置于氮气或洁净空气环境下进行干燥和测频，再用净水进行清洗，再置于氮气或洁净空气环境下进行干燥和测频，反复直至相邻两次频率小于10HZ；(4)在晶体表面固定抗体或抗原用点样器在晶体表面滴加抗体或抗原，并将晶体放置在20℃～40℃环境下反应30～100分钟，然后依次用含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲溶液、净水进行清洗；清洗后将晶体置于氮气或洁净空气环境下进行干燥和测频，再用净水进行清洗，再置于氮气或洁净空气环境下进行干燥和测频，反复直至相邻两次频率小于10HZ，最后制得压电蛋白芯片。
其中，上述方法步骤最后还包括对晶体进行封阻用点样器在晶体表面滴加封阻剂，并将晶体放置在20℃～40℃环境下反应15～45分钟，然后依次用含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲溶液、净水进行清洗；清洗后将晶体置于氮气或洁净空气环境下进行干燥和测频，再用净水进行清洗，再置于氮气或洁净空气环境下进行干燥和测频，反复直至相邻两次频率小于10HZ，最后制得进行免疫反应检测所需的压电蛋白芯片。然而，在实际制作过程，根据不同免疫反应检测需要，封阻这一步骤在有一些免疫反应检测过程中是不需要封了阻的压电蛋白芯片，但在另一些免疫反应检测过程中，必须要求封了阻的压电蛋白芯片。因此，这一步骤在实际制作过程，可根据需求对应压电蛋白芯片进行封阻或不执行封阻这一步骤。而在这一步骤中所用到的封阻剂可以有很多种如可以是牛血清蛋白，或者是兔血清蛋白，又或者是牛血清蛋白和兔血清蛋白相结合而成的混合血清蛋白等等。本发明所用的晶体为双面或单面镀金的石英晶体，或者为双面镀银或单面镀银的石英晶体。在实际制作时，可根据需要进行选择晶体的构造。本发明所述20℃～40℃环境可以采用恒温装置(如恒温箱、水浴锅等)来实现。如在本步骤中本实施例是采用将晶体放置在37℃的恒温装置中反应15～45分钟作为其中一反应条件示例。本发明所述净水可为符合实验室用水国家标准GB6682-2000的一级水、或符合电子行业超纯水国家标准GB/T1146.1-1997的EW-I级水、EW-II级水等。
本发明根据上述方法步骤制作时，首先对选用的晶体进行预处理将晶体依次用丙酮、无水乙醇、净水进行清洗；清洗后将晶体置于氮气或洁净空气环境下进行干燥和测频，然后再用净水进行清洗，再置于氮气或洁净空气环境下进行干燥和测频，反复直至相邻两次频率小于10HZ。在这一步骤中，用丙酮、无水乙醇对晶体进行清洗，主要利用丙酮具有很强去油污功效和无水乙醇具有很好脱水功效，做到将晶体上沾有的油污物彻底清洗掉，保证晶体上不残留任何油污物。然后再用净水将晶体上残留的丙酮和无水乙醇冲洗掉，并将晶体置于氮气或洁净空气环境下进行干燥，然后检测晶体的频率，反复重复“用净水清洗—干燥—测频”这一工序，主要是为了确保了经预处理后的晶体洁净，表面无任何杂质残留，保证制得芯片的特性稳定。而进行晶体测频，是为了检验清洗后的晶体的洁净程度，小于10HZ是指晶体洁净的数值指标。然后在晶体表面固定聚乙烯亚胺用点样器在晶体表面滴加聚乙烯亚胺，并将晶体置于20℃～40℃环境下晾干，然后依次用无水乙醇、净水进行清洗；清洗后将晶体置于氮气或洁净空气环境下进行干燥和测频，再用净水进行清洗，再置于氮气或洁净空气环境下进行干燥和测频，反复直至相邻两次频率小于10HZ；在这一步骤中，用无水乙醇进行清晶体，主要是为了将未固定稳的聚乙烯亚胺冲洗掉，以保证制得芯片的特性稳定。然后再用净水进行冲洗，是为了将残留在晶体上的无水乙醇清洗掉，确保晶体的洁净。而进行测频和反复重复“用净水清洗—干燥—测频”这一工序的目的与上述预处理步骤中所述目的相同，不作重复。20℃～40℃晾干环境可采用恒温装置来实现。所述聚乙烯亚胺的涂附量与聚乙烯亚胺的浓度有关，当浓度较高是，涂附量则适当减少；反之，涂附量则适当增加；晾干反应时间，亦与涂附量多少相关。在此步骤中，如果聚乙烯亚胺的涂附量过少，则容易影响下一步骤中戊二醛的固定，过多则容易造成非特异性吸附，给清洗造成负担。如在本实施例中以聚乙烯亚胺的涂附量为10μL/面，并将晶体放置在35℃的恒温装置中反应1～15分钟，使其固定量为70～500HZ作为其中一示例。然后接着，再进行在晶体表面固定戊二醛用点样器在晶体表面滴加戊二醛，并将晶体放置在20℃～40℃环境下反应10～30分钟；然后用净水进行清洗，清洗后将晶体置于氮气或洁净空气环境下进行干燥和测频，再用净水进行清洗，再置于氮气或洁净空气环境下进行干燥和测频，反复直至相邻两次频率小于10HZ。在这一步骤中，用净水进行冲洗晶体，是为了将未固定稳的戊二醛清冼掉，确保制得芯片的特性稳定。本步骤的其余工序的作用和目的与前面步骤所述相同，不作重复。而其反应时间长短还与戊二醛的浓度有关，例如戊二醛的浓度为0.3mol/L，则要适当延长干燥时间，20分钟为宜；固定量则控制在70～500HZ为宜，如果过少则直接影响下一步骤抗体的固定量，过多则容易和血清结合，造成假阳性。例如，本实施例中以戊二醛的涂附量为10μL/面，并将晶体放置在37℃的恒温装置中反应15分钟作为其中一示例。然后再接着，进行在晶体表面固定抗体或抗原用点样器在晶体表面滴加抗体或抗原，并将晶体放置在20℃～40℃环境下反应30～100分钟，然后依次用含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲溶液、净水进行清洗；清洗后将晶体置于氮气或洁净空气环境下进行干燥和测频，再用净水进行清洗，再置于氮气或洁净空气环境下进行干燥和测频，反复直至相邻两次频率小于10HZ，最后制得压电蛋白芯片。在此步骤中，根据实际应用需要，可选择在晶体表面固定抗体，或选择固定抗原。因为从应用技术角度来说，选择在晶体表面固定抗体，可使制得的压电蛋白芯片用于检测抗原；而选择在晶体表面固定抗原，则可使制得的压电蛋白芯片用于检测抗体。例如在实际应用中，检测乙肝，选用固定抗原的压电蛋白芯片；而检测丙肝、艾滋、梅毒等，则选用固定抗体的压电蛋白芯片。因此，在这一步骤的制作时，可根据实际需要选择抗体或抗原中的其中一种进行制作。而在这一步骤中，用含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲溶液进行冲洗，是为了将未固定稳的抗体清冼掉，以确保制得芯片的特性稳定；然后用净水进行清洗是为了将残留在晶体上的含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲溶液清洗掉。本步骤的其余工序的作用和目的与前面步骤所述相同，不作重复。在本步骤中，本实施例是采用将晶体放置在37℃的恒温装置中反应60分钟作为其中一反应条件示例。紧接着，最后一步骤是对晶体进行封阻。这一步骤正如前面所述，可以根据实际需要，可执行封阻这一步骤对芯片封阻，或不进行封阻。
权利要求
1.一种压电蛋白芯片的制作方法，其特征在于包括如下步骤(1)预处理将晶体依次用丙酮、无水乙醇、净水进行清洗；清洗后将晶体置于氮气或洁净空气环境下进行干燥和测频，然后再用净水进行清洗，再置于氮气或洁净空气环境下进行干燥和测频，反复直至相邻两次频率小于10HZ；(2)在晶体表面固定聚乙烯亚胺用点样器在晶体表面滴加聚乙烯亚胺，并将晶体置于20℃～40℃环境下晾干，然后依次用无水乙醇、净水进行清洗；清洗后将晶体置于氮气或洁净空气环境下进行干燥和测频，再用净水进行清洗，再置于氮气或洁净空气环境下进行干燥和测频，反复直至相邻两次频率小于10HZ；(3)在晶体表面固定戊二醛用点样器在晶体表面滴加戊二醛，并将晶体放置在20℃～40℃环境下反应10～30分钟；然后用净水进行清洗，清洗后将晶体置于氮气或洁净空气环境下进行干燥和测频，再用净水进行清洗，再置于氮气或洁净空气环境下进行干燥和测频，反复直至相邻两次频率小于10HZ；(4)在晶体表面固定抗体或抗原用点样器在晶体表面滴加抗体或抗原，并将晶体放置在20℃～40℃环境下反应30～100分钟，然后依次用含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲溶液、净水进行清洗；清洗后将晶体置于氮气或洁净空气环境下进行干燥和测频，再用净水进行清洗，再置于氮气或洁净空气环境下进行干燥和测频，反复直至相邻两次频率小于10HZ；最后制得压电蛋白芯片。
2.根据权利要求1所述压电蛋白芯片的制作方法，其特征在于上述方法步骤最后还包括对晶体进行封阻用点样器在晶体表面滴加封阻剂，并将晶体放置在20℃～40℃环境下反应15～45分钟，然后依次用含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲溶液、净水进行清洗；清洗后将晶体置于氮气或洁净空气环境下进行干燥和测频，再用净水进行清洗，再置于氮气或洁净空气环境下进行干燥和测频，反复直至相邻两次频率小于10HZ；最后制得进行免疫反应检测所需的压电蛋白芯片。
3.根据权利要求1所述压电蛋白芯片的制作方法，其特征在于上述晶体为表面镀金的石英晶体。
4.根据权利要求1所述压电蛋白芯片的制作方法，其特征在于上述晶体为表面镀银的石英晶体。
5.根据权利要求1所述压电蛋白芯片的制作方法，其特征在于上述方法步骤(2)中聚乙烯亚胺的涂附量为10μL/面，并将晶体放置在35℃的恒温装置中反应1～15分钟，使其固定量为70～500HZ。
6.根据权利要求1所述压电蛋白芯片的制作方法，其特征在于上述方法步骤(3)中戊二醛的涂附量为10μL/面，并将晶体放置在37℃的恒温装置中反应15分钟。
7.根据权利要求1所述压电蛋白芯片的制作方法，其特征在于上述方法步骤(4)是将晶体放置在37℃的恒温装置中反应60分钟。
8.根据权利要求2所述压电蛋白芯片的制作方法，其特征在于上述方法中是将晶体放置在37℃的恒温装置中反应15～45分钟。
全文摘要
一种压电蛋白芯片的制作方法。本发明利用石英晶体的压电原理及酶的免疫发应原理以及蛋白固定技术制成压电蛋白芯片，使本发明利用该方法制成压电蛋白芯片，通过检测仪器检测压电蛋白芯片在没有滴加检测样品之前工作时产生频率与滴加检测样品并发生免疫反应之后的频率差而实现对临床样品(如对输血四项指标乙肝、丙肝、艾滋、梅毒；禽流感、肿瘤标志物等)的检测、分析与诊断。不仅检测速度快、精确度高、稳定性好，而且对检测仪器要求低、检测操作过程简单，可广泛推广和应用。本发明具有制作工艺过程简单、制作方法简便、适合于批量生产、和可实现对多种蛋白质样品进行检测与分析等特点。
文档编号G01N33/68GK1908662SQ20061003704
公开日2007年2月7日 申请日期2006年8月15日 优先权日2006年8月15日
发明者何桂华 申请人:佛山分析仪有限公司