专利名称：女性不孕不育检测蛋白芯片及其试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛋白芯片疾病检测产品，具体地说，涉及一种女性不孕不育检测蛋白芯片及其试剂盒。
背景技术：
据世界卫生组织预测，在21世纪，不孕不育将成为仅次于肿瘤和心脑血管病的第三大疾病。权威的数据显示，在已婚夫妇中非意愿性不孕发生率为7％～46％。尽管不同地域存在差异，但一般被认为在8％～15％。目前国内不孕患者占已婚妇女总数的10％，国外要占15％，发病率都有逐年上升趋势。一般而言，不孕因素女方要占2/3，男方要占1/3。
女性的不孕不育症从时间顺序上讲有原发和继发之分。原发是指女性性成熟后从未怀孕或生育过，继发是指过去曾有过妊娠或分娩史而再次出现不孕不育。从病理上讲，女性不孕不育的原因归纳起来有器质性病变、内分泌因素、免疫因素与精神因素等。根据黄绍坤等人的文章(760例继发性不孕不育女性患者的免疫学检查结果分析，中国优生与遗传杂志，1006-9534(2003)01-0076-02)显示，免疫性因素造成的女性不孕不育是大部分不明原因不孕不育、继发性不孕不育和反复流产的主要原因，对继发性不孕不育患者进行一整套免疫因素的诊断和治疗是非常有必要的。
女性不孕不育的免疫学诊断是近年才开展的较新诊断方法。目前主要包括抗卵巢抗体(AOA，anti-ovarian antibody)、抗子宫内膜抗体(AEA，anti-endometrial antibody)、抗精子抗体(ASA，anti-spermatozoa antibody)、抗透明带抗体(AZP，anti-zona pellucidantibody)、抗心磷脂抗体(ACA，anti-cardiolipin antibody)、抗人绒毛膜促性腺激素抗体(HCG-ab，human chorionic gonadotropin antibody)、抗滋养细胞膜抗体(ATA，anti-trophoblast membrane antibody)等指标。
抗卵巢抗体(AOA)的产生是由于卵巢损伤、感染、炎症等原因造成卵巢抗原的外溢而导致的。其中约42％-52％的不孕及流产患者中有抗卵巢抗体(AOA)的高表达。AOA的表达会进一步加重卵巢的损伤，并导致子宫、胎盘的功能不健全，从而引起不孕和流产。
抗子宫内膜抗体(AEA)是由于子宫在病理状态下，如子宫内膜炎、子宫内膜异位症及子宫腺肌症等，可转化成抗原或半抗原，刺激机体而产生的抗体。此外，人工流产刮宫时，胚囊也可能作为抗原刺激机体产生抗体。一旦女性体内有抗子宫内膜抗体存在，便会导致不孕、停孕或发生流产。
精子作为一种独特的抗原，与机体免疫系统接触后可引起自身或同种免疫反应，产生抗精子抗体(ASA)，抗精子抗体所致不孕占不孕患者的10％～30％。男女体内都可能存在抗精子抗体。在男性抗精子抗体存在于血清或精浆中，在女性则存在于血清或宫颈粘液中。ASA与宫颈粘液蛋白结合，可干扰精子穿过排卵期宫颈粘液；ASA的调理作用可促进生殖道局部吞噬细胞对精子的吞噬；抗精子头部的抗体还能阻断精卵结合，引起补体介导的受精卵的融解，损害胚胎植入及前期胚胎发育导致早期流产。
抗透明带抗体(AZP)是由妇女自身免疫性反应产生的。透明带是披覆于卵子表面的糖蛋白)抗体。每一月经周期总有一些卵泡变为闭锁卵泡，其中的透明带如有活性，可成为抗原刺激而产生抗透明带抗体，或由于感染致使透明带变性，刺激机体产生抗透明带抗体。抗透明带抗体遮盖了位于透明带上的精子受体，使精子不能认识卵子，也就无从与卵子结合。同时抗体可以稳定透明带表面结构，因而能抵抗精子顶体酶对透明带的溶解作用，使精子穿透不了透明带。如已受精，因透明带结构的稳定，致胚胎被封固在透明带内，而无法着床。
抗心磷脂抗体(ACA)是一种以血小板和内皮细胞膜上带负电荷的心磷脂作为靶抗原的自身抗体。常见于系统性红斑狼疮(SLE)及其他自身免疫性疾病。该抗体与血栓形成、血小板、自然流产或宫内死胎关系密切。ACA阳性者死胎发生率为76％左右，反复的自然流产和宫内死胎与ACA呈显著正相关。ACA阳性率的孕妇在妊娠早期易反复流产，在妊娠中，后期易发生宫内胎儿死亡，特别是ACA-IgG水平中至高度升高者。Oshiro对检测过ACA且流产2次以上妇女进行回顾性研究发现，ACA阳性妇女发生宫内胎儿死亡是较发妊娠早期流产更具特点的类型。而Lockshin等的研究揭示ACA能更早更敏感地预测自发性流产。
人绒毛膜促性腺激素(HCG)是维持早期妊娠的主要激素。但是有自然流产史、人工流产史及生化妊娠史的女性，在流产过程中，绒毛组织中的HCG可能作为抗原刺激母体产生抗体。曾接受过HCG注射，以促进排卵的女性，体内的抗HCG抗体也有可能为阳性。此类患者可能在临床上表现为不孕或习惯性流产。另外，在不明原因流产的妇女血清中，抗滋养层细胞抗体(ATAb)比正常孕妇明显增高，这种抗体的增高与流产之间有着密切联系。其机制可能与封闭抗体的减少有关。
目前对女性不孕不育免疫学指标的检测方法主要集中在免疫荧光法或间接免疫荧光法。操作繁琐且费时。国外已有部分指标的ELISA检测试剂盒，但只能进行单指标检测，成本和时间代价都比较高。因此亟待一种能够高通量、快速而准确的检测方法。
生物芯片是近年发展起来的高效率检测方法，能够快速得到所要的检测结果，大大提高检测效率、节约成本。专利申请号为200510102466.3的一项能够检测6项不孕不育指标的生物芯片符合了快速、高通量、高特异性和灵敏度市场要求。但是仍有一定的缺陷，如①该试剂盒缺乏对目前应用广泛的ACA指标的检测②该试剂盒为定性试剂盒，仅能判断阴、阳性，不能做到定量检测。而定量检测对于病人疾病严重程度评价以及其相应治疗方法是十分有意义的。因此，现在的检测手段仍待改进。
发明内容
本发明要提供一种专门用于女性不孕不育检测的多指标蛋白芯片及其试剂盒。解决目前市场上自身免疫学检测产品检测功能单一、检测指标滞后，并且没有集成化的缺点。除了添加专利申请号为200510102466.3产品缺乏的ACA指标外，也能够做到定量检测各个指标的浓度，并消除了指标间的交叉反应，不仅做到了高特异性和高灵敏度，也具有很高的准确度和精确度。
本发明的技术方案如下提供一种不孕不育检测蛋白芯片，由基片和阵列式分布于基片上的蛋白检测指标以及对照检测指标涂层组成，所述的蛋白检测指标包括卵巢抗原(OvarinAntigen，OAg)、子宫内膜抗原(Endometrial Antigen，EAg)、精子抗原(Spermatozoa Antigen，SAg)、透明带抗原(Zona pellucid Antigen，ZAg)、人绒毛膜促性腺激素(Human chorionicgonadotropin，HCG)、滋养层细胞膜抗原(Trophoblast membrane Antigen，TAg)，以共价键或非共价键固定在基片上面；所述的蛋白检测指标还包括心磷脂抗原(CardiolipinAntigen，CAg)。
所述的基片是塑料、尼龙膜或硝酸纤维素膜。
上述的对照检测指标涂层包括阳性对照和阴性对照；阳性对照为兔IgG抗体，阴性对照为抗体点样所用的稀释液。
上述涂层上的每个阵列中蛋白检测指标每个有2-10个重复，对照指标有1-5个重复。
阵列的多少和大小与待检样品的数目，基片大小，以及点样直径有关。
上述蛋白检测指标与检测阵列的优选例是当蛋白检测指标点样直径为0.1mm时，点间距0.6mm，阵列大小为6mm×5mm，可在硝酸纤维素膜蛋白芯片上设置24个阵列。
本发明还提供了包含上述不孕不育检测蛋白芯片的试剂盒，还包括标准品和质控品；标准品与质控品为瓶装，用纸质模板、塑料模板或海棉模板固定于包装盒内。
上述的试剂盒，还包括样本稀释液，酶标工作液，浓缩洗涤液，检测液；各液体为瓶装，与标准品和质控品一起用纸质模板、塑料模板或海棉模板固定于包装盒内。
各部分由固定模具固定于一包装盒内，不限放置方式，检测时配套使用。
上述的标准品由5-10个不同浓度梯度的蛋白混合液组成，每个蛋白混合液装入一个容器，蛋白混合液由7种女性不孕不育标志物蛋白检测指标按不同浓度混合而成。
标准品用于在每次标本检测结束后做标准曲线，可以定量测定样品中的检测指标的蛋白浓度。
上述的质控品由3-6个不同浓度的蛋白混合液组成，每个蛋白混合液装入一个容器，蛋白混合液由7种女性不孕不育标志物蛋白检测指标按不同浓度混合而成。
质控品可以监测整个检测系统的CV值，保证每次检测结果的有效性。
上述的样本稀释液是一种蛋白稳定剂；可以是由3％BSA和0.05％防腐剂(ProclinTM300)的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)配制而成； 上述的酶标工作液由含有HRP标记的相应抗原或单克隆抗体，以及HRP-羊抗兔IgG的前述样本稀释液组成； 上述的浓缩洗涤液是一种PH6.5-PH8.0的中性缓冲液；可以是磷酸盐缓冲液； 上述的检测液指配套使用的两种试剂，一种含有鲁米诺和化学发光增强剂，另一种含有过氧化氢。
图1是女性不孕不育检测蛋白芯片的外观图，1为反应区域，底部为点样涂层的基片。
图2是点样阵列示意图，第1行为阳性对照兔IgG抗体和阴性对照，各有3个重复点样；其余各行分别为蛋白检测指标点样OAg、EAg、SAg、ZAg、CAg、HCG和TAg共7个标志物，每行两个指标，第一行OAg、EAg，第二行SAg、ZAg，第三行CAg、HCG，第四行TAg，各有5个重复点样。
图3是女性不孕不育检测蛋白芯片试剂盒示意图。2代表浓缩洗涤液；3代表1瓶样本稀释液和1瓶酶标工作液；4代表2瓶配套使用的检测试剂；5代表标准品；6代表质控品。
图4为检测血清示意图，其中12个矩形表示所在加样区域加的是标准品，6个标准品每个重复2次；5个多边形表示所在加样区域加的是质控品；其余圆形表示所在加样区域加的是样本。
图5是一种主要为ACA引起的女性不孕不育检测结果示意图。其中ACA呈阳性，ASA指标呈弱阳性，其余呈阴性。
具体实施例方式 应当理解，下面实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法如萨姆布鲁克和拉塞尔主编的《分子克隆实验指南》第三版，或按照制造厂商所建议的步骤和条件。
实施例1 一种女性不孕不育检测蛋白芯片的制备 其步骤主要是(1)准备基质硝酸纤维素膜；(2)设计芯片，确定点阵的排列方式和点样位置；(3)点样针从384孔板吸出抗体喷点于硝酸纤维素膜上；(4)装配硝酸纤维素膜，并且进行封闭、干燥、包装、保存。
上述用于检测女性不孕不育标志物抗体的蛋白芯片的制备方法具体包括以下步骤 1.女性不孕不育标志物检测抗原抗体的确定 女性不孕不育标志物试剂盒检测抗原的确定 用于制备女性不孕不育检测蛋白芯片的抗原全部从动物组织或器官内提取。OAg来自猴卵巢，EAg来自牛子宫内膜，SAg来自人精液、ZAg来自牛卵泡，CAg来自牛心肌，HCG来自人类孕尿、TAg来自人绒毛膜滋养层细胞。
用于制备试剂盒中标准品的检测指标抗体的确定 所采用的检测抗体对均为小鼠杂交瘤单克隆抗体对，其检测精度和准确度明显优于多克隆抗体。
2.点样制备具检测指标涂层的膜芯片 用Gesim点样仪喷点，点样针从384孔板吸出抗体喷点于硝酸纤维素膜上，点阵形式为10×5矩形阵列，当点直径为0.1mm，点横向间距为0.6mm，抗体阵列的大小为6mm×5mm；点样后贴膜，封闭；最后将芯片干燥、包装后于4℃保存。
3.蛋白芯片组装 用具有分隔反应区域的器具将反应区域固定。组装方式见ZL032298900。组装完成后的示意图如图1。
实施例2 试剂盒的制备 一种不孕不育检测蛋白芯片试剂盒，由不孕不育检测蛋白芯片，标准品，质控品，样本稀释液，酶标工作液，浓缩洗涤液，检测液组成；各部分为瓶装，用纸质模板固定于包装盒内(如图2)，不限放置方式，检测时配套使用。以下是各部分的制备方法 1.不孕不育检测蛋白芯片为6×8孔板，由硝酸纤维素膜做为片基，组装方式见ZL032298900。完成后外观图见图1。
2.标准品提供6瓶，每瓶0.25ml。
用含有3％BSA和0.05％防腐剂(ProclinTM 300)的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)配置，其中AOA、AEA、ASA、AZP、ACA、HCG-ab、ATA标准品的终浓度见下表
3.质控品提供5瓶，每瓶0.2ml。
质控品分为5个浓度，分别是质控品I、质控品II、质控品III、质控品IV、质控品V。这五个质控品浓度分别趋近于相应标准品浓度。
质控品是用含有3％BSA和0.05％防腐剂(ProclinTM 300)的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)配制，下表显示AOA、AEA、ASA、AZP、ACA、HCG-ab、ATA标准品的终浓度及质控界限。
上述质控品质控界限测定方法如下 分别由2个实验人员按照标准实验操作检测质控品，重复4次/板，每天每人重复测2块芯片，重复检测10天，分别计算质控品的均值和标准差，质控界限为
±15％。
4.样本稀释液 由3％BSA和0.05％防腐剂(ProclinTM 300)的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)配制而成。提供1瓶，9ml。用于稀释血清样本(体积比1∶1)。
5.酶标工作液 由3％BSA和0.05％防腐剂(ProclinTM300)的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)配成溶液，含有HRP标记的7个女性不孕不育标志物特异的单克隆抗体，以及检测抗体HRP-羊抗兔IgG。提供6ml，1瓶。
6.浓缩洗涤液(10×) 为磷酸盐缓冲液。由以下方法配置而成磷酸二氢钾6.8g，磷酸氢二钠7.1g，TWEEN-2010ml，溶于1000ml纯化水。各化学物质均为分析纯。
提供50ml，浓缩洗涤液1瓶。使用前用450ml去离子水稀释，混匀。
7.检测液 使用PIERCE公司的
ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate作为配套检测液。A液、B液各1瓶，每瓶1.5ml。
实施例3 蛋白芯片及试剂盒的应用及检测 本发明所述的用于检测不孕不育的蛋白芯片的应用，主要采用抗原-抗体-酶标二抗方法检测人血液中的不孕不育标志物抗体。方法是将人血清加于芯片表面，样本中的抗体分别于固定在芯片上的相对应的抗原结合；甩干后加入酶标二抗反应，洗去未结合的二抗；加入检测液后1分钟，扫描并收集信号，样本点的信号强度与血清中抗体的浓度成正比。
在上述用于检测不孕不育的蛋白芯片试剂盒的应用中，其抗原抗体反应及检测的具体使用方法如下 (1)对喷点抗原、阳性对照、阴性对照的芯片用3％BSA溶液进行封闭，室温2小时，封闭基片表面非特异性位点； (2)甩干封闭液后，室温放置4小时，进行干燥； (3)在芯片的反应区域，加入经等1∶20稀释的人血清样品，以及6份标准品的2次重复，5份质控品(加样方式见示意图4)；每孔加100ul，置于恒温反应仪中37℃，振荡反应1小时，使抗原与抗体充分反应； (4)甩干后，每孔加入酶标二抗100ul，置于恒温反应仪中37℃，振荡反应30分钟，并且用10倍稀释的磷酸缓冲液在摇床上振荡洗涤三次，每次1分钟； (5)将PIERCE公司的
ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate的配套使用的检测液A液和B液1∶1混合，加入芯片上各反应区域上，每阵列加60ul，进行化学发光； (6)用CCD检测仪进行化学发光的扫描并收集信号，依据扫描结果显示分析检测结果。
如图5是一种主要为ACA引起的女性不孕不育检测结果示意图。
权利要求
1.一种女性不孕不育检测蛋白芯片，由基片和阵列式分布于基片上的蛋白检测指标以及对照检测指标涂层组成，所述的蛋白检测指标包括卵巢抗原(Ovarin Antigen，OAg)、子宫内膜抗原((Endometrial Antigen，EAg)、精子抗原(Spermatozoa Antigen，SAg)、透明带抗原(Zona pellucid Antigen，ZAg)、人绒毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotropin，HCG)、滋养层细胞膜抗原(Trophoblast membrane Antigen，TAg)，以共价键或非共价键固定在基片上面；其特征在于，所述的蛋白检测指标还包括心磷脂抗原(CardiolipinAntigen，CAg)。
2.如权利要求1所述的女性不孕不育检测蛋白芯片，其特征在于，所述的基片是塑料、尼龙膜或硝酸纤维素膜。
3.如权利要求1或2所述的女性不孕不育检测蛋白芯片，其特征在于，所述的对照指标包括1个阳性对照和1个阴性对照；阳性对照为兔IgG抗体，阴性对照为抗原点样所用的稀释液。
4.如权利要求3所述的女性不孕不育检测蛋白芯片，其特征在于，所述的涂层上每个检测指标有2-10个重复，对照指标有1-5个重复。
5.一种女性不孕不育检测蛋白芯片试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述女性不孕不育检测蛋白芯片，标准品和质控品；标准品与质控品为瓶装，用纸质模板、塑料模板或海棉模板固定于包装盒内。
6.如权利要求5所述的女性不孕不育检测蛋白芯片试剂盒，其特征在于，还包括样本稀释液，酶标工作液，浓缩洗涤液和检测液；各液体为瓶装，用纸质模板、塑料模板或海棉模板固定于包装盒内。
7.如权利要求5或6所述的女性不孕不育检测蛋白芯片试剂盒，其特征在于，所述的标准品由5-10个不同浓度梯度的蛋白混合液组成，每个蛋白混合液装入一个容器，蛋白混合液由7个女性不孕不育标志蛋白检测指标按不同浓度混合而成。
8.如权利要求5或6所述的女性不孕不育检测蛋白芯片试剂盒，其特征在于，所述的质控品由3-6个不同浓度的蛋白混合液组成，每个蛋白混合液装入一个容器，蛋白混合液由7个女性不孕不育标志蛋白检测指标按不同浓度混合而成。
9.如权利要求6所述的女性不孕不育检测蛋白芯片试剂盒，其特征在于各部分配制方法如下
所述的样本稀释液为蛋白稳定剂；
所述的酶标工作液由含有HRP标记的相应抗原的单克隆抗体，以及HRP-羊抗兔IgG的前述样本稀释液组成；
所述的浓缩洗涤液为PH6.5-PH8.0的中性缓冲液；
所述的检测液指配套使用的两种试剂，一种含有鲁米诺和化学发光增强剂，另一种含有过氧化氢。
全文摘要
本发明公开了一种专门用于女性不孕不育检测的多指标蛋白芯片及其试剂盒。由基片和阵列式分布于基片上的蛋白检测指标以及对照检测指标涂层组成，所述的蛋白检测指标包括卵巢抗原(OAg)、子宫内膜抗原(EAg)、精子抗原(SAg)、透明带抗原(ZAg)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、滋养层细胞膜抗原(TAg)，和心磷脂抗原(CAg)。解决目前市场上自身免疫学检测产品检测功能单一、检测指标滞后，并且没有集成化的缺点。除了添加专利申请号为200510102466.3产品缺乏的ACA指标外，也能够做到定量检测各个指标的浓度，并消除了指标间的交叉反应，不仅做到了高特异性和高灵敏度，也具有很高的准确度和精确度。
文档编号G01N33/74GK101750501SQ200810204669
公开日2010年6月23日 申请日期2008年12月16日 优先权日2008年12月16日
发明者穆海东, 汪宁梅, 穆宇豪, 刘纲, 顾蓉 申请人:上海裕隆生物科技有限公司