专利名称：一种检测动物病原微生物的方法及其专用蛋白芯片的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医学领域，特别是涉及一种动物病原微生物检测方法及其 专用蛋白芯片。
背景技术：
动物与人类的生活、生产和科学研究工作密切相关，对动物所携带的微生 物进行检测，保证动物的质量，对保障人类健康，促进经济发展和确保动物实 验准确性具有重要的意义。
传统的，也是目前应用最广的微生物检测方法是通过分离培养对微生物进 行菌落、个体形态，生理生化鉴定。这种方法工作量大，耗时长，而且对实验 操作者要求比较高。
随着现代科学发展， 一些新技术应用于微生物检测。基于分子生物学的聚
合酶链式反应(PCR)检测技术与DNA芯片技术实现了微生物的快速检测，但 是有比较严重的交叉反应现象，且取材需要是正在被感染的组织。基于免疫学 的血清凝集和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测法，取材简单，但是由于大多数 微生物之间存在某些共同的抗原决定簇，所以交叉反库非常严重，目前也只能 作为微牛物检测的辅助手段。蛋白质芯片技术是对固相载体进行特殊的化学处 理，再将己知的大量蛋白有规律的固定其上(如抗原等)，根据这些分子的特性 捕获能与之特异性结合的待测蛋白(如存在于血清中的抗体等)，然后用激光扫 描系统或电感耦合器件(CCD)获取数据图像，最后用专门的计算机软件进行 图像分析，结果定量和解释。由于蛋白纯化较困难，且操作过程中极易失活， 所以蛋白芯片技术的发展明显滞后于基因芯片，目前用于微生物检测的蛋白芯 片有交叉反应现象，检测效果不佳。
发明内容
鉴于以上问题，本发明的主要目的是提供一种动物病原微生物的检测方法 及其专用蛋白芯片，该种方法提高了检测效率，同时具有很好的检测特异性。
为了达到以上目的，本发明提供的该种动物病原微生物的检测方法，其主 要包括以下步骤
4a. 制备蛋白芯片，通过实验挑选多种病原微生物的多组不同的特异性抗原
固定到合适的修饰过的载体上，如聚赖氨酸修饰、氨基修饰、酸基修饰、环氧
基修饰及三维立体修饰等，同时将不同抗原按预先设定的矩阵规则排列；
b. 检测，将待检动物的血清与上述蛋白芯片反应,，再与标记的—级抗体杂 交，通过适当的检测手段检测杂交阳性信号，并通过扫描分析获取动物血清与 芯片的杂交结果，感染不同病原微生物的动物血清，反应后在蛋白芯片上会呈 现不同的阳性信号组合模式，这样就可以确定被检动物是否正在感染或感染过 蛋白芯片上标记的病原微生物。
上述步骤a中，对每一种病原微生物通过多项实验选择3组或3组以上不 同的具有一定特异性的蛋白抗原，并同时把这些抗原都固定在同一张芯片上， 这样有效的避免了细菌间因有某些共同的抗原决定簇而产生的交叉反应问题， 提高了检测的特异性。 .
上述步骤a中，所述挑选病原微生物的特异性抗原的实验方法具体可以为 将培养好的病原微生物用磷酸盐缓冲液(PBS， pH7.4)洗涤两次，洗去培养基; 之后再用磷酸盐缓冲液重悬，通过机械法、超声处理法或溶菌酶法将病原微生 物裂解，离心取上清液；将上清液走SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)， 转膜后与抗不同细菌的抗血清杂交，通过对杂交结果的分析，初步选择几种具 有一定特异性的抗原；接着再通过凝胶过滤层析、离子交换层析及SDS-PAGE 胶回收电泳等方法提取上清液屮的不同蛋白；对提取的蛋白进行SDS-PAGE结 合蛋白印迹(westernblot)或酶联免疫吸附试验(ELISA)分析，最终对每一种 病原微生物确定3组及3组以上的不同的具有一定特异性的抗原。
本发明还提供的一种用于上述动物病原微生物检测方法的专用蛋白芯片， 该种蛋白芯片通过将多种微生物的多组不同的特异性抗原固定到合适的修饰过 的载体上，不同抗原按预先设定的矩阵规则排列；
所述载体的修饰可通过聚赖氨酸修饰、氨基修饰、醛基修饰、环氧基修饰、 及三维立体修饰等方式；
针对每一种病原微生物，优选通过实验选择3组或3组以上不同的具有一 定特异性的蛋白抗原；
本发明提供的该种蛋白芯片具有很大的容量，本发明对每种微生物选定多 种不同的特异性抗原，并把多种病原微生物的预先选定的抗原固定在同一张芯片上，可以通过一次反应检测多种微生物，提高了检测效率，节约了检测时间 和检测成本。
本发明通过将多种病原微生物抗原固定在同一张芯片上，每一种病原微生 物选择多组特异性抗原，与待检动物血清杂交后，通过不同的阳性信号组合模 式来判定检测结果。这样既可以同时检测多种病原微生物，提高了检测效率， 又避免了由于某种共同抗原决定簇而导致的普通血清学检测中的交叉反应问 题，具有很好的检测特异性，因此，本发明在动物病原微生物检测方面具有良 好的应用前景。
图l为本发明具体实施例中的芯片点样示意图。
具体实施例方式
以下结合具体实施例及说明书附图对本发明所提供的技术特征进一步说 明，但不作对其的限定
实施例一
制备微生物蛋白抗原芯片
选择国标(GB14922.2—2001)中规定无特定病原体(SPF)级小鼠必须排 除的细菌中的四种伤寒沙门氏菌 (& /mo"e〃a T)^/n'mw7'wm)、嗜肺巴氏杆菌 (Pa他wre〃a/ we謂c^ra/ /ca)、假结核耳卩尔森氏菌(1fera/刚-fliw/os)、 念珠状链杆菌 (6y^pto&"7/船mcw'/z/orm^)。通过多次蛋白印迹(western blot) 实验，每种细菌选定了5种特异性抗原，通过细菌裂解、离子交换层析、SDS-PAGE 胶回收电泳等方法制备了这些抗原，共计20种。抗原用磷酸盐缓冲液(PBS， pH7.4)适当稀释后，用BioDot公司的AD3200芯片点样仪将抗原点在氨基化处理 过的玻片上，每种抗原点三个重复点，然后将点好的黄白芯片置于湿盒中，4°C 过夜；第二天将芯片在湿盒中置室温平衡lh，接着用PB'S洗涤蛋白芯片3次，3min/ 次，洗去未结合的蛋白；然后将芯片放入3。/。脱脂奶粉-PBS中，37t封闭lh，再 用PBS洗芯片一次，芯片制备完成。最后将制备好的蛋白质芯片室温晾干后，于 -3(TC冰箱中保存备用。芯片点样示意图如图l所示，每种细菌选择的五种特异性 抗原，纵向排列，每种抗原横向三个重复点，按顺序点在芯片上，其屮A1-A5为鼠伤寒沙门氏菌的五种抗原；B1-B5为嗜肺巴氏杆菌的五种抗原；C1-C5为假 结核耶尔森菌的五种抗原；D1-D5为念珠状链杆菌的五种抗原。
实施例二
感染鼠伤寒沙门氏菌(&/mo"e〃a ^p/H'mw/wm)的小鼠血清学检测 感染鼠伤寒沙门氏菌的小鼠血清，用0.5%牛血清白蛋白组分V- PBS (BSA-PBS)l: 100体积比稀释后，与实施例一制备的微生物蛋白抗原芯片杂交， 37°C孵育lh，之后将芯片用PBS洗3次，3min/次，洗去未结合的抗体。接着 将芯片与标记的二级抗体杂交，标记的—级抗体为用PBS 1:200体积比稀释的辣 根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG， 37。C孵育lh，然后再用PBS洗漆芯片3 次，3min/次。最后芯片用3,3-二氨基联苯胺(DAB)显色，脱水，封片。应用 微阵列扫描仪对芯片的显色结果进行扫描，应用软件对扫描结果进行分析。结 果显示，伤寒沙门氏菌抗原均产生了较强的阳性信号；其'他菌抗原只有部分有 微弱的信号。 实施例三
感染嗜肺巴氏杆菌(PWewre〃a/ "ewmo/rap/ca)的小鼠血清学检测 感染嗜肺巴氏杆菌的小鼠血清，用0.5%BSA-PBS1:100体积比稀释后，与 实施例一制备的微生物蛋白抗原芯片杂交，按照实施例二的操作方法进行杂交 实验。结果显示，嗜肺巴氏杆菌抗原均产生较强的阳性信号，其他菌抗原没有 信号。
实施例四
感染假结核耶尔森氏菌(:re/^"/"/^^o励w^&)'的小鼠血清学检测
感染假结核耶尔森氏菌的小鼠血清，用0.5。/。BSA-PBS1:200体积比稀释后，
与实施例一制备的微生物蛋白抗原芯片杂交，按照实施例二的操作方法进行杂 交实验。结果显示，假结核耶尔森氏菌抗原均产生较强的阳性信号，其他菌抗 原只有部分有微弱信号。 实施例五
感染念珠状链杆菌 (Sfrepto&"7/ws wo"仏/onw's)的小鼠血清学检测 感染念珠状链杆菌的小鼠血清，用0.5%BSA-PBS1:100体积比稀释后，与 实施例一制备的微生物蛋白抗原芯片杂交，按照实施例二的操作方法进行杂交 实验。结果显示，念珠状链杆菌抗原均产生较强的阳性信号，其他菌抗原信号很微弱。
实施例六
混合感染四种细菌的小鼠血清学检测
将分别感染鼠伤寒沙门氏菌(&/mo e〃" &/7/H>m^'ww)，嗜肺巴氏杆菌 (PasteMre〃a / "et/mc^ra/ /cfl！)，假结核耳卩尔森氏菌(Jfen7."/a psewfifo^ferctz/os^)， 念珠状链杆菌 (wom7z/o^7m's )的小鼠血清混合，用 0.5%BSA-PBS1:100体积比稀释后，与实施例一制备的微生物蛋白抗原芯片杂 交，按照实施例二的操作方法进行杂交实验。结果显示，四种菌的所有抗原均 产生较强的阳性信号。
上述结果显示，实施例一制作的微生物蛋白抗原芯片，在检测感染不同微 生物的小鼠血清时，呈现唯一的、不同的阳性信号模式，所以芯片具有良好的 检测特异性。
以上已对本发明其内容作了详尽说明。对本领域一般技术人员而言，在不 背离本发明原理的前提下对它所做的任何显而易见的改动，都不会超出本申请 所附权利要求的保护范围。
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权利要求
1、一种动物病原微生物的检测方法，其特征在于，主要包括以下步骤a.制备蛋白芯片，通过实验挑选多种病原微生物的多组不同的特异性抗原固定到合适的修饰过的载体上，同时将不同抗原按预先设定的矩阵规则排列；b.检测，将待检动物的血清与上述蛋白芯片反应，再与标记的二级抗体杂交，通过适当的检测手段检测杂交阳性信号，并通过扫描分析获取血清与芯片的杂交结果，感染不同病原微生物的动物血清，反应后在蛋白芯片上会呈现不同的阳性信号组合模式，从而确定被检动物是否正在感染或感染过蛋白芯片上标记的病原微生物。
2、 根据权利要求1所述的一种动物病原微生物的检测方法，其特征 在于，所述歩骤a中载体的修饰优选采用聚赖氨酸修饰、氨基修饰、醛 基修饰、环氧基修饰、及三维立体修饰其中任意一种或几种结合的修饰 方式。
3、 根据权利要求1所述的一种动物病原微生物的检测方法，其特征 在于，所述步骤a中，优选将多种病原微生物的多组不同的特异性抗原 都固定在同一张芯片上。
4、 根据权利要求1所述的一种动物病原微生物:的检测方法，其特征 在于，所述步骤a中，挑选病原微生物特异性抗原的实验方法优选采用 蛋白印迹或酶联免疫吸附试验。
5、 根据权利要求1所述的一种动物病原微生物的检测方法，其特征 在于，所述步骤a中，针对每一种病原微生物选择至少3组不同的特异 性抗原。
6、 一种蛋白芯片，其用于上述权利要求1所述的动物病原微生物检 测方法，其特征在于，通过将多种病原微生物的多组不同的特异性抗原 固定到合适的修饰过的载体上，并将不同抗原按预先设定的矩阵规则排 列。
7、 根据权利要求6所述的蛋白芯片，其特征在于，所述载体的修饰 优选采用聚赖氨酸修饰、氨基修饰、醛基修饰、环氧基修饰、及三维立 体修饰其中任意一种或几种结合的修饰方式。
8、 根据权利要求6所述的蛋白芯片，其特征在于，针对每一种病原微生物选择至少3组不同的特异性抗原。
9、 根据权利要求6所述的蛋白芯片，其特征在于，将多种病原微生 物的多组不同的特异性抗原都固定在同一张芯片上。:，''
全文摘要
本发明属于生物医学领域，提供一种动物病原微生物的检测方法及其专用蛋白芯片，所述检测方法主要包括以下步骤a.制备蛋白芯片，通过实验挑选多种病原微生物的多组不同的特异性抗原固定到合适的修饰过的载体上，b.检测，将待检动物的血清与上述蛋白芯片反应，再与标记的二级抗体杂交，通过适当的检测手段检测杂交阳性信号，并通过扫描分析获取血清与芯片的杂交结果，感染不同病原微生物的动物血清，反应后在蛋白芯片上会呈现不同的阳性信号组合模式，从而确定被检动物是否正在感染或感染过蛋白芯片上标记的病原微生物。本发明可以同时检测多种病原微生物，提高了检测效率，针对每一种病原微生物选择多组不同的具有一定特异性的抗原，使检测具有很好的特异性，在动物病原微生物检测方面具有良好的应用前景。
文档编号G01N33/569GK101629957SQ20091008808
公开日2010年1月20日 申请日期2009年7月8日 优先权日2009年7月8日
发明者张连峰, 李万波, 林树柱, 川 秦 申请人:中国医学科学院实验动物研究所