专利名称：一种肿瘤抑制蛋白及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及新的肿瘤抑制蛋白及编码该蛋白的多核苷酸。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的用途和制备。本发明的多肽是一种抑制肿瘤恶性增殖的肿瘤抑制蛋白。
背景技术：
恶性肿瘤是威胁人类健康的重要疾病，成为造成人类死亡的第二大病因。据统计，我国死于恶性肿瘤的前五位癌症依次为胃癌、肝癌、肺癌、食管癌和大肠癌。肿瘤是一种细胞的异常增生。癌细胞可以不受控制地生长繁殖，侵犯邻近正常组织并转移到远处的组织器官。癌的发生是一个多因素，多阶段的复杂渐进的过程。
正常细胞的癌变与其改变了的遗传特性有关。通常细胞内有两套基因。一类是参与细胞的生长代谢，促进与调节细胞繁殖和分化的，如原癌基因。另一类是正常细胞内能抑制细胞转化和肿瘤发生的，如肿瘤抑制基因或抑癌基因。两类基因的突变紊乱，包括点突变，DNA片段的缺失或移位等会使细胞无限增殖，使机体发生癌变。
近年来外科手术，放疗和化疗构成肿瘤治疗的三大模式。这些治疗方法基于直接杀伤肿瘤细胞，常难彻底消灭肿瘤细胞，又易损伤正常组织，特别是伤害机体免疫系统，影响正常的细胞免疫。随着现代分子生物学和基因工程技术的发展，生物治疗已成为肿瘤治疗的第四模式。在通常情况下，肿瘤与机体防御之间存在动态平衡，平衡的失调导致肿瘤的增殖与播散。肿瘤的生物治疗指通过肿瘤宿主防御机制或生物制剂的作用以调节机体自身的生物学反应，从而抑制或消除肿瘤生长的治疗方法。例如利用肿瘤的抑癌基因治疗，通过借助于基因转移法恢复或添加肿瘤细胞中失活或缺乏的抑癌基因，恢复抑癌基因的功能，从而对肿瘤的恶性增殖或转移产生一定的抑制和治疗作用为了有效地治疗和预防肿瘤，本领域迫切需要开发研究肿瘤抑制蛋白及其激动剂/抑制剂。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的肿瘤抑制蛋白多肽以及其片段、类似物和衍生物。
本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。
本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途。
在本发明的第一方面，提供了一种分离的肿瘤抑制蛋白，该蛋白选自下组(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有肿瘤抑制功能(如抑制肝癌细胞恶性增殖)的由(a)衍生的多肽。
较佳地，所述的肿瘤抑制蛋白的序列如SEQ ID NO2所示。
在本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，该多核苷酸编码本发明上述的肿瘤抑制蛋白。较佳地，该多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO2。更佳地，该多核苷酸的序列选自下组(c)SEQ ID NO1的全长序列，或(d)SEQ ID NO1中第151-1341位序列。
在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。
在本发明的第四方面，提供了制备肿瘤抑制蛋白的制备方法，该方法包含(a)在表达条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出肿瘤抑制蛋白。
在本发明的第五方面，提供了与上述的肿瘤抑制蛋白特异性结合的抗体。还提供了可用于检测的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中连续10个核苷酸至全长核苷酸，较佳地它含有连续的约15-1000个核苷酸。
在本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明的肿瘤抑制蛋白或编码本发明肿瘤抑制蛋白的多核苷酸，以及药学上可接受的载体。这些药物组合物可治疗癌症以及细胞异常增殖等病症。本发明还提供了本发明蛋白和多核苷酸的用途，它们被用于制备治疗肿瘤(尤其是肝癌)的药物。
在本发明的第七方面，提供了一种检测肝癌的方法，它包括步骤检测肝细胞样本中HCRP1转录本的数量，如果样本中HCRP1转录本的数量低于正常对照，就表明样本中存在肝癌细胞的几率大于正常组织。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图1、Northern杂交检测HCRP1的mRNA在人各组织中的表达。表明HCRP1基因在人正常肝组织中高量表达。
图2、软琼脂克隆形成实验检测HCRP1抑制肝癌细胞的恶性增殖能力。图中(a)，稳定转染空载体pcDNA3的SMMC-7721细胞株作对照；(b)，稳定转染HCRP1基因的SMMC-7721细胞株克隆形成受抑制；(c)，稳定转染反义HCRP1 cDNA的SMMC-7721细胞株克隆形成能力明显增强。
图3、裸鼠成瘤性实验检测HCRP1抑制肿瘤生长的能力。图中(a)，稳定转染空载体pcDNA3的SMMC-7721细胞株作为对照；(b)，稳定转染HCRP1基因的SMMC-7721细胞株成瘤性减弱；(c)，稳定转染反义HCRP1 cDNA的SMMC-7721细胞株的成瘤性明显增强。
具体实施例方式
本发明人利用定位候选克隆的方法分离到一个新的肿瘤抑制相关基因HCRP1。它位于人染色体8p22区域，这个区域在很多肿瘤中发生高频的杂合性缺失，是克隆抑癌基因的热点区域。全序列测定表明HCRP1cDNA全长为1917bp(SEQ ID NO1)，包含有一个完整的蛋白编码框(第151-1341位)，编码了一个由397个氨基酸组成的肿瘤抑制蛋白HCRP1(见SEQ ID NO2)。
本发明还进行了HCRP1基因的组织表达分布实验，通过与8种正常人组织mRNA的Northern杂交实验，表明HCRP1在肝组织中表达量最高，在肺、脾、肌肉和睾丸中表达量中等，在脑、心、胃中微量表达或不表达。此外，软琼脂克隆形成实验表明，HCRP1高表达会抑制SMMC-7721细胞在软琼脂上的克隆形成。而且利用反义cDNA减弱HCRP1的表达促进了SMMC-7721细胞在软琼脂上的克隆形成。这证明了HCRP1具有抑制肝癌细胞恶性增殖的能力。在裸鼠中进行的成瘤性实验也表明，HCRP1具有的抑制肿瘤生长的作用。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的肿瘤抑制蛋白或多肽”或“分离的HCRP1”是指肿瘤抑制蛋白HCRP1基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化肿瘤抑制蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
如本文所用，“本发明多肽”指肿瘤抑制蛋白HCRP1或其具有抑制肿瘤功能的活性片段、衍生物和类似物。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括HCRP1的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然HCRP1相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”是指编码具有SEQ IDNO2的蛋白质，但与SEQ ID NO1所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码成熟多肽的多核苷酸包括只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在95％以上，更好是97％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO3所示的成熟多肽具有相同的生物学功能(以FP3361蛋白为例)和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码HCRP1的多聚核苷酸。
本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。
本发明的HCRP1核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中的各种DNA分子(如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明也涉及包含本发明多核苷酸的载体，以及用本发明载体或HCRP1编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的HCRP1。一般来说有以下步骤(1).用本发明的编码HCRP1的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，HCRP1多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于在细菌中表达的基于T7的表达载体；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含HCRP1编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。可供选择的是用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可包被于细胞内、细胞外或在细胞膜上表达或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
重组的HCRP1或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)直接做为药物治疗HCRP1功能低下或丧失所致的疾病(如肝癌)，和用于筛选促进或对抗HCRP1功能的抗体、多肽或其它配体。例如，抗体可用于激活或抑制HCRP1的功能。用表达的重组HCRP1筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激HCRP1功能的多肽分子。
本发明也提供了筛选药物以鉴定提高(激动剂)或阻遏(拮抗剂)HCRP1的药剂的方法。HCRP1的拮抗剂包括筛选出的抗体、化合物、受体缺失物和类似物等。HCRP1的拮抗剂可以与HCRP1结合并消除其功能，或是抑制HCRP1的产生，或是与多肽的活性位点结合使多肽不能发挥生物学功能。
本发明的多肽可直接用于疾病治疗，例如，各种恶性肿瘤、和细胞异常增殖等。
本发明的多肽，及其片段、衍生物、类似物或它们的细胞可以用来作为抗原以生产抗体。这些抗体可以是多克隆或单克隆抗体。
可以将本发明的多肽和拮抗剂与合适的药物载体组合后使用。这些载体可以是水、葡萄糖、乙醇、盐类、缓冲液、甘油以及它们的组合。组合物包含安全有效量的多肽或拮抗剂以及不影响药物效果的载体和赋形剂。这些组合物可以作为药物用于疾病治疗。
本发明还提供含有一种或多种容器的药盒或试剂盒，容器中装有一种或多种本发明的药用组合物成分。与这些容器一起，可以有由制造、使用或销售药品或生物制品的政府管理机构所给出的指示性提示，该提示反映出生产、使用或销售的政府管理机构许可其在人体上施用。此外，本发明的多肽可以与其它的治疗化合物结合使用。
药物组合物可以以方便的方式给药，如通过局部、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻内或皮内的给药途径。HCRP1以有效地治疗和/或预防具体的适应症的量来给药。施用于患者的HCRP1的量和剂量范围将取决于许多因素，如给药方式、待治疗者的健康条件和诊断医生的判断。
HCRP1的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于HCRP1的无表达或异常/无活性的HCRP1的表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常。重组的基因治疗载体可用于治疗HCRP1表达或活性异常所致的疾病。来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将HCRP1基因转移至细胞内。构建携带HCRP1基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook，et al.)。另外重组HCRP1基因可包装到脂质体中转移至细胞内。
多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。
本发明还提供了针对HCRP1抗原决定簇的抗体。这些抗体包括(但不限于)多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段和Fab表达文库产生的片段。这些抗体可用常规方法制备。抗HCRP1的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的HCRP1。
抗体也可用于设计针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如HCRP1高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，红豆碱等)共价结合。
多克隆抗体的生产可用HCRP1或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。
HCRP1单克隆抗体可用杂交瘤技术生产(Kohler and Milstein.Nature，1975，256495-497)。将人恒定区和非人源的可变区结合的嵌合抗体可用已有的技术生产(Morrison et al，PNAS，1985，816851)。而已有的生产单链抗体的技术(U.S.PatNo.4946778)也可用于生产抗HCRP1的单链抗体。
本发明还涉及定量和定位检测HCRP1水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的HCRP1水平，可以用作解释HCRP1在各种疾病中的重要性和用于诊断HCRP1起作用的疾病。
HCRP1的多聚核苷酸可用于HCRP1相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，HCRP1的多聚核苷酸可用于检测HCRP1的表达与否或在疾病状态下HCRP1的异常表达。如HCRP1DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断HCRP1的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(Microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用HCRP1特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测HCRP1的转录产物。
检测HCRP1基因的突变也可用于诊断HCRP1相关的疾病。HCRP1突变的形式包括与正常野生型HCRP1 DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。
本发明的主要优点在于1、提供了一个全新的肿瘤抑制蛋白HCRP1，该蛋白对于加深了解肿瘤发生、发展的分子机制具有重要的意义。
2、本发明发现HCRP1可以抑制肝癌细胞株在软琼脂上的克隆形成和减弱裸鼠的成瘤性，表明HCRP1参与细胞生长的负凋控，可以作为药物或作为药物的靶序列等应用临床，包括肿瘤相关疾病的早期诊断和治疗。
3、HCRP1在正常人组织中的表达有特异性，在肝中高量表达，在肺、脾、肌肉和睾丸中中量表达，在脑、心、胃中微量表达或不表达，显示该基因在肝组织中具有特别重要的功能。可应用于作为肝、肺、脾和睾丸相关疾病的诊断和治疗制剂。
4、由于本发明的HCRP1具有源自人的天然氨基酸序列，因此，与来源于其他物种的同族蛋白相比，预计在施用于人时将具有更高的活性和/或更低的副作用(例如在人体内的免疫原性更低或没有)。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、HCRP1全长基因克隆根据定位候选克隆的方法与人类基因组的核酸序列数据库，设计多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)引物P1(SEQ ID NO3)，引物P2(SEQ ID NO4)。以肝脏的cDNA文库质粒(GIBCO BRL公司产品)为模板，PCR扩增获得HCRP1基因cDNA，PCR反应条件为94℃2分钟预变性，循环反应为94℃30秒，50℃30秒，72℃2分钟，共进行35个循环。PCR产物用低熔点琼脂糖凝胶回收纯化，方法参照《分子克隆.实验指南》(Sambrook，J.，Fritsh，E.F.，and Maniais，T.，MolecularCloning，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。全序列测序(由博亚公司测定)。
获得的cDNA全长为1917bp(SEQ ID NO1)，包含了一个完整的蛋白编码区(第151-1341位)，编码了一个由397个氨基酸组成的蛋白质(SEQ ID NO2)。
实施例2、HCRP1在人正常组织中的表达分析将固定有正常人的8种不同组织的poly(A)+RNA杂交膜放入杂交管中，加入5mL杂交液(君轩公司提供)，65℃预杂交30分钟，加入变性的32P随机标记的HCRP1片段的探针(Random Primer DNA标记试剂盒，TaKaRa公司)，65℃杂交过夜。杂交膜用洗涤缓冲液I(0.3M NaCl，0.03M柠檬酸钠(PH7.0)，0.05％十二烷基磺酸钠)于室温30分钟；然后用洗涤缓冲液II(15mM NaCl，1.5mM柠檬酸钠(pH7.0)，0.1％十二烷基磺酸钠(SDS))于50℃洗两次，每次20分钟。然后，压X光片，-70℃放射自显影。
实验结果如图1所示。表明HCRP1基因在肝中高量表达，在肺、脾、睾丸和肌肉中中量表达，在脑、心、胃中微量表达，表达产物大小约为2Kb。
实施例3、HCRP1真核表达载体的构建与蛋白产物的表达与检测。
根据HCRP1的cDNA序列设计引物P3(SEQ ID NO5)与引物P4(SEQ ID NO6)，引物的两侧分别有XbaI与EcoRI的酶切位点。以经过测序验证的HCRP1序列为模板，进行PCR反应。PCR产物经过低熔点琼脂糖凝胶回收纯化，加入限制性内切酶XbaI与EcoRI(TaKaRa公司产品)。37℃消化一个小时后，回收纯化。同时将载体pCMV-Tag2A(Stratagene公司产品))用相同的限制性内切酶XbaI与EcoRI酶切一个小时，低熔点琼脂糖凝胶回收纯化。将两种回收产物用T4 DNA连接酶(TaKaRa公司产品)16℃连接过夜，转化至DH5α菌株中。通过筛选，得到重组的HCRP1质粒，命名为pcDNA3-Flag-HCRP1。根据HCRP1的cDNA序列设计引物P5(SEQ ID NO7)与引物P6(SEQ ID NO8)，引物的两侧分别有HindIII与SalI的酶切位点。用与上述同样的方法即PCR扩增HCRP1基因，克隆入载体pcDNA3，通过筛选，得到重组的含有反义HCRP1 cDNA的质粒，命名为pcDNA3-HCRP1(-)。
人肝癌细胞SMMC-7721用RPMI 1640培养液(GIBCOL BRL公司产品)加入10％小牛血清(GIBCOL BRL公司产品)，37℃，5％CO2培养。细胞以200,000个的接种量接种入60mm的细胞培养皿，37℃培养。24小时后用10μl Lipofectamine(GIBCOL BRL公司产品)转染SMMC-7721细胞。分别加入1.5μg的pcDNA3、pcDNA3-Flag-HCRP1、pcDNA3-HCRP1(-)质粒。转染24小时后，换新鲜培基并加入G418(GIBCOL BRL公司产品)至700μg/mL。继续培养三周，中间经常换加有G418的培养基。挑取单克隆并扩大培养，筛选稳定表达HCRP1的细胞株称为SMMC-7721/HCRP1(+)，稳定转染反义HCRP1质粒的细胞株称为SMMC-7721/HCRP1(-)，稳定转染对照质粒pcDNA3的细胞株称为SMMC-7721/con。
实施例4、HCRP1抑制SMMC-7721肝癌细胞在软琼脂上的克隆形成将SMMC-7721/con、SMMC-7721/HCRP1(+)和SMMC-7721/HCRP1(-)细胞分别加入含有10％胎牛血清和700μg/mLG418的RPMI1640培养液的培养瓶中，37℃，5％CO2培养。将对数期的生长细胞消化后与含0.35％琼脂的完全培基混匀，加入已铺有0.6％琼脂的六孔板中，每孔细胞的浓度为2×104。在37℃，5％CO2的条件下培养三周后，将含有多于50个细胞数的克隆计数并拍照。
结果表明，SMMC-7721/HCRP1(+)细胞株形成克隆的能力低于SMMC-7721/con对照细胞，而SMMC-7721/HCRP1(-)在软琼脂上的克隆形成能力(包括克隆的大小和数量)高于对照细胞株(图2)。这说明HCRP1可以抑制肿瘤细胞在软琼脂上的恶性增殖。
实施例5、HCRP1抑制肝癌细胞在裸鼠中的成瘤性将对数期生长的SMMC-7721/con、SMMC-7721/HCRP1(+)和SMMC-7721/HCRP1(-)细胞消化后，用无血清的培基洗两次，悬浮于PBS中。注射于裸鼠(BALB/C，雄性，六周龄)背部两侧的皮下，每一点注射细胞数为2×106/100μL。注射11周后，处死裸鼠，拍照并取瘤称重。
实验结果如图3所示。SMMC-7721/HCRP1(+)和SMMC-7721/HCRP1(-)在裸鼠中形成的瘤子分别小于和大于SMMC-7721/con对照组，这与软琼脂克隆形成实验的结果一致，说明HCRP1能抑制肿瘤的形成。
实施例6 HCRP1蛋白重组表达和纯化将HCRP1基因通过NheI和XhoI酶切位点装入pET24a((Novagen公司)融合表达载体中，然后转化大肠杆菌BL21-DE3，扩增，抽取质粒并以相应的限制性内切酶鉴定，通过DNA测序确证。
经鉴定的转化细胞株，按照1∶20比例接种于LB培养基(每升培养基含有10gPolypepton，5g yeast extract，10g NaCl)中，37℃培养三小时左右至OD600为0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度0.5mM，诱导表达3～4小时。
菌体收获后，6000rpm，10分钟离心收集菌体；用溶液TEG(含100mMNaCl)(10mL/g菌体)重悬菌体，超声波破细胞，每次30秒，间隔1分钟，共超生波12次；加入10％脱氧胆酸钠至2％，搅拌10分钟，13000rpm离心10分钟；沉淀重悬于TEG(含50mM NaCl)，加入10％脱氧胆酸钠至2％，搅拌10分钟，13000rpm离心10分钟，重复此步骤两次；最后得到的沉淀为HCRP1包涵体蛋白，4℃保存。取包涵体蛋白走电泳，染色后将His-HCRP1蛋白条带从胶中割下，用Electro-Eluter(BioRad公司产品)回收HCRP1蛋白。
实施例7抗HCRP1蛋白抗体的制备取300μg实施例6中纯化的HCRP1融合蛋白，溶解于0.5mL PBS中，加入等体积的弗氏完全佐剂，充分混匀，皮内多点注射于2.0kg雄性新西兰大白兔背部。第三天，再次以同样蛋白量用弗氏完全佐剂充分混匀后，皮内多点注射于背部。第28天，以同样蛋白量用弗氏不完全佐剂混匀后，背部皮内注射以加强免疫。在此一周后，颈动脉放血收集血液，37℃放置3小时，4℃放置过夜以使血清完全析出，离心收集血清，分装，-70℃保存。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>中国科学院上海生命科学研究院<120>一种肿瘤抑制蛋白及其应用<130>030713<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1916<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(151)..(1341)<223>
<400>1ggcaggacag gcttagagaa gacgcggtcc ccagcgcttg ggccacggac gtcccacccc 60gctccttgtc gctggagaac cgccgggccg agccactggg agaagcaggc cagagccttc 120cagggcctcc ggcccgtgga cccgaggagg atg agc tgg ctt ttt ccc ctg acc 174Met Ser Trp Leu Phe Pro Leu Thr1 5aag agc gcc tcc tcc tcc gcg gct ggg tcc ccc ggt ggc ctc acc agc222Lys Ser Ala Ser Ser Ser Ala Ala Gly Ser Pro Gly Gly Leu Thr Ser10 15 20ctc cag cag cag aag cag cgc ctg atc gag tcc ctc cgg aac tca cac270Leu Gln Gln Gln Lys Gln Arg Leu Ile Glu Ser Leu Arg Asn Ser His25 30 35 40tcc agt ata gcc gaa ata cag aaa gat gtg gaa tac aga ttg cca ttc318Ser Ser Ile Ala Glu Ile Gln Lys Asp Val Glu Tyr Arg Leu Pro Phe45 50 55acc ata aac aac ctg aca att aac att aat ata ttg ctt cct cca cag366Thr Ile Asn Asn Leu Thr Ile Asn Ile Ash Ile Leu Leu Pro Pro Gln60 65 70ttt cct cag gaa aaa cca gtg atc agt gtt tat cca cca ata cga cat414Phe Pro Gln Glu Lys Pro Val Ile Ser Val Tyr Pro Pro Ile Arg His75 80 85cac tta atg gat aaa caa gga gtg tat gtt acc tct cca tta gta aac462His Leu Met Asp Lys Gln Gly Val Tyr Val Thr Ser Pro Leu Val Asn90 95 100
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<221>misc_feature<222>(1)..(26)<223>引物<400>7
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<221>misc_feature<222>(1)..(27)<223>引物<400>8cgcgtcgact tcctctcttg gcagttc 2权利要求
1.一种分离的肿瘤抑制蛋白，其特征在于，选自下组(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有肿瘤抑制功能的由(a)衍生的多肽。
2.如权利要求1所述的蛋白，其特征在于，其序列如SEQ ID NO2所示。
3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码权利要求1所述的多肽。
4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO2。
5.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列选自下组(c)SEQ ID NO1的全长序列，或(d)SEQ ID NO1中第151-1341位序列。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。
7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它是选自下组的一种宿主细胞(a)用权利要求6所述的载体转化或转导的宿主细胞；(b)用权利要求3所述的多核苷酸转化或转导的宿主细胞。
8.一种肿瘤抑制蛋白的制备方法，其特征在于，该方法包含(a)在表达条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出肿瘤抑制蛋白。
9.一种能与权利要求1所述的肿瘤抑制蛋白特异性结合的抗体。
10.一种药物组合物，其特征在于，它含有安全有效量的权利要求1所述的多肽或权利要求3所述的多核苷酸以及药学上可接受的载体。
全文摘要
本发明公开了一种新的肿瘤抑制蛋白HCRP1，编码此多肽的多核苷酸和经重组技术产生该多肽的方法。该肿瘤抑制蛋白HCRP1是利用定位候选克隆的方法克隆到。它定位在人染色体8p22上，cDNA全长为1917个核苷酸，编码397个氨基酸的蛋白质。将HCRP1导入肝癌细胞，能够抑制肝癌细胞的恶性转化能力。
文档编号C07K14/435GK1548454SQ03116920
公开日2004年11月24日 申请日期2003年5月14日 优先权日2003年5月14日
发明者赵慕钧, 徐振华, 梁亮, 李载平 申请人:中国科学院上海生命科学研究院