专利名称：重组人干扰素α8多肽编码cDNA序列、制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域。具体涉及重组人干扰素α-8(rhIFNα8)多肽编码cDNA序列及其在大肠杆菌中的表达和药物应用。
背景技术：
干扰素(Interferon，IFN)是由细胞分泌的一类具有抗病毒等多种生物活性的蛋白质。它通过直接或间接作用于细胞干扰素效应基因，表达多种效应蛋白，从而发挥多样性的生物学功能，作为一种细胞功能调节物质，干扰素属于细胞因子。
经国际干扰素命名委员会正式确定名称的干扰素种类有IFNα、IFNβ、IFNγ、IFNω、IFNτ等几种，同一型别的干扰素又分为若干亚型，其中IFNα研究最多。迄今为止，国内外学者已从人基因组中克隆了20余个IFNα基因。
IFNα8基因先后由Yelverton E，Leung D，Weck P，et al.，(NucleicAcids Res 1981，9(3)731-741)Goeddel，D.V.，Leung，D，W.，Dull，t，J..，etal.，(Nature 1981，290(5801)20-26)Bowden DW，Mao J，GiU T，etal.，(Gene 1984，27(1)87-99)等作者于1981、1981、1984年克隆获得。研究表明，IFNα8基因定位于染色体9P22上，编码蛋白质产物为189个aa，其中前23个aa为信号肽，成熟的编码多肽为166个aa。发明者采用健康中国人外周血及胎肝组织标本为原料，经总RNA抽提，IFNα通用引物逆转录PCR(RT-PCR)，克隆获得了中国人IFNα8基因(见图1)，经序列分析比较与先前国外作者报道的序列完全一致，这为本发明的进行奠定了良好基础。
有关IFNα8生物活性检测的研究亦见诸报道，其中较有代表的是Foster GR et al.，等的报道，研究表明，人IFNα8干扰素在IFNα各亚型中具有最高的抗病毒活性，且能诱导U1突变细胞株产生抗病毒状态。(Foster GR et al.，Different relative activities of humancell-derived interferon-alpha subtypesIFN-alpha 8 has very highantiviral potency.J.Interferon Cytokine Res，1996(12)1027-1033).
FinterNB et al.，等采用WISH(人)、Hela(人)、MDBK(牛)、L929(小鼠)、RK13(家兔)、Vero(猴)等细胞株比较了IFNα1、α2、α8、αC、αF、Le等多种型别干扰素的抗病毒活性，结果IFNα8无论采用哪个系统，其抗病毒活性均属较高。研究发现，不同重组干扰素对NK细胞的促进作用有90倍的差异，其中α8(B)、α2(A)、α1(D)、αC较高，α6(K)、αF较低，α7(J)最低。(FinterNB et al.，J.Interferon Cytokine Res，1991(s)185.)迄今为止，国内外对于IFNα8的商业开发仍未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种可大量表达、纯化的，经突变、优化的IFNα8编码cDNA序列。
本发明公开的rhIFNα8cDNA序列具有序列1、2所示的基因序列和编码氨基酸序列。该序列是在天然hIFNα8cDNA序列的基础上，根据大肠杆菌密码子的偏爱性，在保证编码氨基酸序列不变的情况下，经突变后获得的。所述的rhIFNα8多肽分子量大小为20kda，pI值为4.9。
本发明所要解决的另一技术问题是公开上述rhIFNα8在大肠杆菌中的表达方法。
天然的IFNα8cDNA序列克隆于pBV220载体上，导入大肠杆菌DH5α，经检测，基因不表达。采用DNA软件分析发现，天然的IFNα8cDNA序列中含有许多大肠杆菌稀有密码子，推测这可能就是IFNα8不表达的主要原因。本发明根据大肠杆菌密码子的偏爱性，在保证编码氨基酸序列不变的情况下，人工合成了一段编码基因均为大肠杆菌偏爱的IFNα8cDNA序列(见序列1)。为了进一步提高目的基因表达水平，在IFNα8cDNA编码区起始密码子atg前还增加了一段核糖体结合位点序列(见序列3)。此外，在IFNα8cDNA序列的5’端引入了EcoR I酶切位点，3’端终止密码子(TAA)后增加了SalI酶切位点，进而构建大肠杆菌表达载体pBV220/IFNα8，经工程菌筛选，蛋白分离、纯化、冻干后获得目的蛋白。
本发明rhIFNα8在大肠杆菌中的表达包括下列步骤一、大肠杆菌重组表达载体pBV220/IFNα8的构建1.IFNα8基因的亚克隆及与载体的连接首先将人工合成的IFNα8cDNA序列(序列1、2)及核糖体结合位点序列(序列3)亚克隆在pUC18载体上，成pUC18/IFNα8。用EcoRI/Sal I双酶切消化pUC18/IFNα8及大肠杆菌表达载体pBV220，回收IFNα8及载体片段。经纯化后，采用宝生物工程公司DNA连接试剂盒进行连接(见图2)，然后转化感受态大肠杆菌DH5α，LB平板过夜培养。
2.工程菌筛选挑取LB平板上的阳性菌落进行酶切及测序鉴定。鉴定证实后的阳性克隆接种于5ml液体LB培养液中，30℃，250rpn/min培养12-18小时。将培养液转入50ml液体LB培养液中，继续培养至OD值为0.4-0.6，突然提高温度至42℃诱导4-5小时。离心收集菌体，进行SDS-PAGE电泳分析，结果获得了一株表达量很高的工程菌株。
二、工程菌发酵条件的摸索及优化1.菌种的活化取-70℃、20％甘油保藏的菌种100ul，接种于含4ml LB培养基的试管中，加入氨苄青霉素使其终浓度为100ug/ml；32℃、220r/min培养10h左右，再按2％接种比例转种于含50mlLB的三角瓶中，加入氨苄青霉素使其终浓度为100ug/ml；32℃、220r/min培养4h，成为活化种子液，4℃保存。
2.发酵种子液培养取活化的种子液，以1∶1000接种比例接种于含500ml LB培养基的1000ml三角瓶中，加入氨苄青霉素使其终浓度为100ug/ml。32℃、220r/min培养10h，OD600约为2.5。
3.发酵罐培养使用New Brunswick Scientific公司的BioFloIII型7L自动控制发酵罐，发酵参数根据发酵液多参数监测结果及经验进行调整并优化。
4.离心收菌得湿菌体5.菌体破碎三、重组蛋白IFNα8的分离、纯化1.包涵体的洗涤(1)用20mM Tris.cl pH8.0，1mMEDTA洗涤破碎菌体，9000rpm×30min，弃上清。
(2)用0.2％Triton X-100，20mM Tris.cl pH8.0，1mM EDTA洗涤，9000rpm×30min，弃上清。
经(1)、(2)洗涤，包涵体纯度可达到了60％左右。
2.变性、复性、超滤(1)将洗涤好的包涵体以湿重计按1∶20(v/w)溶解于7M盐酸胍，50mMTris.cl pH8.0，10mM β-巯基乙醇，10mM EDTA缓冲液中，室温下搅拌4h，离心9000rpm×30min得透明上清液，即变性液。
(2)将变性液采用稀释复性的方法进行复性，复性缓冲液为2.5MVrea，50mMtris.cl，1mMETDA。复性时缓慢滴加变性液，使复性液蛋白终浓度为0.1-0.2mg/ml，复性时间36h。
(3)将蛋白复性液先过滤，再超滤(millipore)，得到超滤浓缩液。
3.柱层析纯化(1)采用Q-sepharose FF阴离子交换柱先用20mM Tris.cl pH8.0平衡Q柱，再上样，上样完后首先用20mMTris.cl pH8.0洗脱，再用100mM NaCl阶段洗脱，最后用400mMNaCl阶段洗脱，280nm检测洗脱蛋白峰，经SDS-PAGE电泳检测，纯度为85％左右。
(2)采用干扰素单抗层析柱先用PBS平衡抗干扰素单抗层析柱，再上样，最后经PBS洗脱，收集到蛋白峰，经SDS-PAGE电泳检测目的蛋白纯度大于99％。
本发明所要解决的再一技术问题是公开上述rhIFNα8在制备治疗人或动物肿瘤及病毒感染性疾病药物中的应用。
本发明rhIFNα8可作为上述药物的活性成份，制备各种生理上可以接受的各种液体制剂或冻干制剂。
本发明所述的肿瘤，包括各种恶性肿瘤，如实体癌和浆液性肿瘤等。
本发明所述的病毒感染性疾病包括HBV、HCV、HIV、HSV、HPV或流感病毒等感染引起的疾病。
用本发明rhIFNα8进行体外抗病毒活性及动物试验I.体外抗病毒活性检测方法的建立及检测分析一、原理rhIFN-α8效价测定采用细胞病变抑制法。不同浓度的rhIFN-α8加入人羊膜wish细胞培养后，用VSV水泡性口炎病毒攻击，通过比较标准品与待检品对wish细胞的病变抑制程度，计算出待检品生物活性效价。
二、材料人α型干扰素国家标准品(购自中国药品生物制品检定所)rhIFN-α8待检品wish细胞株MEM培养基(GIBCO公司)染色液50mg结晶紫加入20ml乙醇中，加水至100ml脱色液50％乙醇，50％蒸馏水，0.1％乙酸96孔培养板(NUNC公司)酶标仪(model 550，Bio-rad公司)三、方法1.用含10％牛血清的MEM培养液调整wish细胞浓度为3.0×105/mL接种于96孔培养板，每孔100μl；37℃、5％CO2条件下培养4-6h。
2.标准品与待检品均用含7％牛血清的MEM稀释至103IU/ml作为上样起始浓度，在稀释板上进行4倍倍比稀释后，(8个稀释度)分别加入96孔板，每孔50ul，(每个稀释度设复孔)同时设立细胞、病毒对照；37℃、5％CO2条件下培养18-24h。
3.细胞板弃上清，加入剂量为100TCID50VSV病毒液，每孔100ul；37℃、5％CO2条件下培养24h。
4.弃上清，每孔加入50ul结晶紫染色液，室温放置30min。
5.流水小心冲去染色液，吸干残留水分。每孔加入100ul脱色液，室温放置3-5min后于酶标仪570、630nm处测定O.D值。
6.由对照品和待测品曲线比较求出待测品活性单位。
四、结果对本实验室三批rhIFN-α8纯化样品进行效价测定，结果比活性均在107-108IU/mg范围内，表明纯化样品已初步达到生物制品规程要求。
II.rhIFNα8对HBV DNA转基因小鼠的治疗作用1.实验材料重组人IFNα8试验品由成都地奥制药集团公司制备(纯度大于99％)。
HBV DNA转基因Balb/c小鼠由空军广州医院提供，雌雄各半。出厂前血液经ELISA法检测HBsAg、HBeAg，定量PCR检测HBVDNA拷贝数，肝组织采用免疫组化检测HBsAg、HBeAg表达，证实上述指标均阳性。
HBsAg、HBeAg ELISA检测试剂由华美生物工程公司提供。
HBsAg、HBcAg免疫组化检测一抗、二抗均由Gibco公司提供。
HBV DNA定量采用中山医科大学达安基因诊断中心HBV DNA定量检测试剂盒在PE7700型PCR仪上进行。
阳性对照药重组人IFNα1b由深圳科兴生物制品公司提供。
2.实验方法HBV DNA转基因Balb/c小鼠于SPF环境中饲养。随机分成给药组(IFNα8，10万IU/只，按体重/公斤算相当于人用剂量100倍)、给药组(IFNα8，1万IU/只，按体重/公斤算相当于人用剂量的10倍)、阳性对照组(IFNα1b，1万IU/只)、阴性对照组4组，每组6只。
用药开始前、用药开始后2周、4周、8周分别采取小鼠眶静脉血各0.4ml，用药开始前、4周、8周分别手术采取小鼠肝组织标本。
给药组及阳性对照组采用胫前肌肉注射法给予相应药物，隔日一次，共5次，阴性组采用同样方法给予与阳性组等量的0.9％NS液注射。
所取血液标本用于ELISA检测、HBV DNA定量检测，肝组织标本用于HBsAg、HBeAg免疫组化检测。
3.实验结果(1)血清HBV DNA定量检测结果表1 血清HBV DNA定量检测结果(拷贝数/ml)给药组 给药组n n 阳性对照组 n 阴性组 n(10万U/只) (1万U/只)治疗前 3.51×1076 8.02×1066 4.42×1076 7.88×10762周3.90×1046 7.62×1036 7.88×1046 4.38×10664周1.25×1035 4.56×1035 6.42×1035 5.76×10768周6.50×1065 3.78×1065 5.35×1065 9.36×1076(2)血清HBsAg、HBeAg变化情况血清HBsAg在各组给药前后均阳性，阳性率无变化。HBeAg在给药前后阴性率变化见表2。
表2血清HBeAg阳性率变化情况治疗前 (％)2周 (％) 4周 (％) 8周 (％)给药组 100 1006/66/6 4/5 (80％) 5/5 (100％)(10万U/只)％％给药组100 1006/66/6 4/5 (80％) 5/5 (100％)(1万U/只) ％％阳性组 6/6100 6/6 1006/6 (100％) 6/6 (100％)阴性组 6/6100 6/6 1006/6 (100％) 6/6 (100％)(3)肝组织免疫组化变化情况阳性组及给药组均见HBsAg表达减弱，HBcAg变化不明显。
4.结论
IFNα8及IFNα1b对HBV DNA转基因小鼠均具有抗病毒作用，大剂量及小剂量IFNα8疗效无明显差异。
图1IFNα8基因琼脂糖凝胶电泳图其中M为核酸分子量Marker，由下至上依次为200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp，1为IFNα基因，长度约500bp图2重组表达载体pBV220/IFNα8质粒构建3pBV220/IFNα8重组表达载体酶切鉴定电泳图其中M为核酸分子量Marker，由下至上依次为250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp、3000bp、3500bp、4000bp、5000bp、6000bp、8000bp、9000bp、10000bp、，1、2、3、4为pBV220/IFNα8载体基因，长度约4500bp图4pBV220/IFNα8工程菌发酵产物SDS-PAGE电泳图其中M为蛋白质分子量Marker，由下至上依次为14200da、20100da、24000da、29000da、36000da、45000da、66000da，1、2、3为pBV220/IFNα8载体表达产物，1、2为经优化发酵条件产物，目的基因表达产物约为22Kda图5经纯化工程菌发酵液产物SDS-PAGE电泳图其中M为蛋白质分子量Marker，由下至上依次为14200da、20100da、24000da、29000da、36000da、45000da、66000da，1、2、3为pBV220/IFNα8载体表达产物，1为最终纯化产物。目的基因表达产物约为22Kda具体实施方式
实施例1大肠杆菌重组表达载体pBV220/IFNα8的构建1.IFNα8基因的突变和优化根据大肠杆菌密码子的偏爱性，在保证编码氨基酸序列不变的情况下，人工合成了一段编码基因均为大肠杆菌偏爱的IFNα8 cDNA序列(见序列1)。为了进一步提高目的基因表达水平，在IFNα8cDNA编码区起始密码子atg前还增加了一段核糖体结合位点序列(见序列3)。此外，在IFNα8cDNA序列的5’端引入了EcoRI酶切位点，3’端终止密码子(TAA)后增加了SalI酶切位点。
2.IFNα8基因的亚克隆及与载体的连接基因克隆及连接的具体方法参照萨姆布鲁克等所著《分子克隆实验指南》(第三版)。首先将人工合成的IFNα8 cDNA序列及核糖体结合位点序列亚克隆在pUC18载体上，成pUC18/IFNα8。用EcoRI/Sal I双酶切消化pUC18/IFNα8及大肠杆菌表达载体pBV220，回收IFα8及载体片段。经纯化后，采用宝生物工程公司DNA连接试剂盒进行连接(见图2)，然后转化感受态大肠杆菌DH5α，LB平板过夜培养。
3.工程菌筛选挑取LB平板上的阳性菌落进行酶切及测序鉴定(酶切鉴定电泳见图3)。鉴定证实后的阳性克隆接种于5ml液体LB培养液中，30℃，250rpm/min培养12-18小时。将培养液转入50ml液体LB培养液中，继续培养至OD值为0.4-0.6，突然提高温度至42℃诱导4-5小时。离心收集菌体，进行SDS-PAGE电泳分析，结果获得了一株表达量很高的工程菌株。
实施例2 工程菌发酵及IFNα8目的蛋白的分离纯化工艺一、工程菌发酵1.培养液配制(1)种子液培养基500mlTryptone5gYeast Extract2.5gNaCl 5g加去离子水定容至500ml，在121℃，1.034×105Pa高压蒸气灭菌20min。
(2)基础培养基Tryptone44gYeast Extract 22gNaCl 44g加去离子水定容至3800ml，随发酵罐在121℃，1.034×105Pa高压蒸气灭菌20min。
(3)磷酸盐缓冲液K2HPO4·3H2O 28.5gKH2PO417g加去离子水定容至120ml，在121℃，1.034×105Pa高压蒸气灭菌20min。
(4)补料培养基I葡萄糖 40g加去离子水定容至80mlMgSO4·7H2O 4g加去离子水定容至20ml在121℃，1.034×105Pa高压蒸气灭菌20min。
(5)补料培养基IITryptone20g加去离子水定容至100mlYeast Extract 40g加去离子水定容至200ml在121℃，1.034×105Pa高压蒸气灭菌20min。
维生素溶液 10ml微量金属溶液10ml(6)补料培养基IIITryptone30g加去离子水定容至150mlYeast Extract 10g加去离子水定容至50ml葡萄糖 60g
加去离子水定容至120ml在121℃，1.034×105Pa高压蒸气灭菌20min。
2.菌种的活化取-70℃、20％甘油保藏的菌种100ul，接种于含4mlLB培养基的试管中，加入氨苄青霉素使其终浓度为100ug/ml；32℃、220r/min培养10h左右，再按2％接种比例转种于含50mlLB的三角瓶中，加入氨苄青霉素使其终浓度为100ug/ml；32℃、220r/min培养4h，成为活化种子液，4℃保存。
3.发酵种子液培养取活化的种子液，以1∶1000接种比例接种于含500ml LB培养基的1000ml三角瓶中，加入氨苄青霉素使其终浓度为100ug/ml。32℃、220r/min培养10h，OD600约为2.5。
4.发酵罐培养使用New Brunswick Scientific公司的BioFloIII型7L自动控制发酵罐，发酵参数如下time temp stir airpH PO2OD60000:0030-32℃2500.47.3100 接种01:0030-32℃2500.47.396.30.3202:0030-32℃2501.07.382.00.5403:0030-32℃2501.07.360.50.9604:0030-32℃3001.47.355.21.5405:0030-32℃3502.07.365.42.5206:0030-32℃3502.47.350.85.3507:0030-32℃4002.47.345.08.2008:0030-32℃4002.47.328.310.5309:0040-42℃4503.06.752.112.1610:0040-42℃4503.06.736.718.5611:0040-42℃4503.06.730.221.1212:0040-42℃4503.06.742.524.32注用HCl、NaOH调节pH，接种时加入磷酸盐缓冲液，01:00用泵加入补料I；04:00用泵加入补料II；07:00用泵加入补料III。
5.离心收菌得湿菌体230g。
6.菌体破碎及凝胶电泳(SDS-PAGE电泳结果见图4)。
二、蛋白质分离、纯化1.包涵体的洗涤(1)用20mM Tris.cl pH8.0，1mMEDTA洗涤，9000rpm×30min，弃上清。
(2)用0.2％Triton X-100，20mM Tris.cl pH8.0，1mM EDTA洗涤，9000rpm×30min，弃上清。
经(1)、(2)洗涤，包涵体纯度达到了60％左右。
2.变性、复性、超滤(1)将洗涤好的包涵体以湿重计按1∶20(v/w)溶解于7M盐酸胍，50mMTris.cl pH8.0，10mM β-巯基乙醇，10mM EDTA缓冲液中，室温下搅拌4h，离心9000rpm×30min得透明上清液，即变性液。
(2)将变性液采用稀释复性的方法进行复性，复性缓冲液为2.5MVrea，50mMtris.cl，1mMETDA。复性时缓慢滴加变性液，使复性液蛋白终浓度为0.1-0.2mg/ml，复性时间36h。
(3)将蛋白复性液先过滤，再超滤(millipore)，得到超滤浓缩液。
3.柱层析纯化(1)采用Q-sepharose FF阴离子交换柱先用20mM Tris.cl pH8.0平衡Q柱，再上样，上样完后首先用20mMTris.cl pH8.0洗脱，再用100mM NaCl阶段洗脱，最后用400mMNaCl阶段洗脱，280nm检测洗脱蛋白峰，经SDS-PAGE电泳检测，纯度为85％左右。
(2)采用干扰素单抗层析柱先用PBS平衡抗干扰素单抗层析柱，再上样，最后经PBS洗脱，收集到蛋白峰，经SDS-PAGE电泳检测目的蛋白纯度大于99％(纯化的目的蛋白SDS-PAGE电泳见图5)。
序列表序列1、2 rhIFNα8cDNA基因序列、rhIFNα8cDNA基因氨基酸序列ATG TGT GAT CTT CCT CAG ACT CAT TCT CTT GGT AAT CGT CGT GCT 45Met Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg AlaCTT ATT CTT CTT GCT CAG ATG CGT CGT ATT TCT CCT TTT TCT TGT 90Leu Ile Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser CysCTT AAG GAT CGT CAT GAT TTT GAG TTT CCT CAG GAG GAG TTT GAT 135Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Glu Phe Pro Gln Glu Glu Phe AspGAT AAG CAG TTT CAG AAG GCT GAG GCT ATT TCT GTT CTT CAT GAG 180Asp Lys Gln Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His GluATG ATT GAG CAG ACT TTT AAT CTT TTT TCT ACT AAG GAT TCT TCT 225Met Ile Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser SerGCT GCT CTT GAT GAG ACT CTT CTT GAT GAG TTT TAT ATT GAG CTT 270Ala Ala Leu Asp Glu Thr Leu Leu Asp Glu Phe Tyr Ile Glu LeuGAT CAG CAG CTT AAT GAT CTT GAG TCT TGT GTT ATG CAG GAG GTT 315Asp Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ser Cys Val Met Gln Glu ValGGT GTT ATT GAG TCT CCT CTT ATG TAT GAG GAT TCT ATT CTT GCT 360Gly Val Ile Glu Ser Pro Leu Met Tyr Glu Asp Ser Ile Leu AlaGTT CGT AAG TAT TTT CAG CGT ATT ACT CTT TAT CTT ACT GAG AAG 405Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Thr Glu LysAAG TAT TCT TCT TGT GCT TGG GAG GTT GTT CGT GCT GAG ATT ATG 450Lys Tyr Ser Ser Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile MetCGT TCT TTT TCT CTT TCT ATT AAT CTT CAG AAG CGT CTT AAG TCT 495Arg Ser Phe Ser Leu Ser Ile Asn Leu Gln Lys Arg Leu Lys SerAAG GAG TGA 504Lys Glu Trm序列3重组表达载体pBV220/IFNα8核糖体结合位点序列图GAA TTC aac agg aga ctt tct g atg
权利要求
1.重组人干扰素α-8，其特征在于具有下述基因序列ATG TGT GAT CTT CCT CAG ACT CAT TCT CTT GGT AAT CGT CGT GCT45Met Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg AlaCTT ATT CTT CTT GCT CAG ATG CGT CGT ATT TCT CCT TTT TCT TGT90Leu Ile Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser CysCTT AAG GAT CGT CAT GAT TTT GAG TTT CCT CAG GAG GAG TTT GAT 135Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Glu Phe Pro Gln Glu Glu Phe AspGAT AAG CAG TTT CAG AAG GCT CAG GCT ATT TCT GTT CTT CAT GAG 180Asp Lys Gln Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His GluATG ATT CAG CAG ACT TTT AAT CTT TTT TCT ACT AAG GAT TCT TCT 225Met Ile Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser SerGCT GCT CTT GAT GAG ACT CTT CTT GAT GAG TTT TAT ATT GAG CTT 270Ala Ala Leu Asp Glu Thr Leu Leu Asp Glu Phe Tyr Ile Glu LeuGAT CAG CAG CTT AAT GAT CTT GAG TCT TGT GTT ATG CAG GAG GTT 315Asp Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ser Cys Val Met Gln Glu ValGGT GTT ATT GAG TCT CCT CTT ATG TAT GAG GAT TCT ATT CTT GCT 360Gly Val Ile Glu Ser Pro Leu Met Tyr Glu Asp Ser Ile Leu AlaGTT CGT AAG TAT TTT CAG CGT ATT ACT CTT TAT CTT ACT GAG AAG 405Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Thr Glu LysAAG TAT TCT TCT TGT GCT TGG GAG GTT GTT CGT GCT GAG ATT ATG 450Lys Tyr Ser Ser Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile MetCGT TCT TTT TCT CTT TCT ATT AAT CTT CAG AAG CGT CTT AAG TCT 495Arg Ser Phe Ser Leu Ser Ile Asn Leu Gln Lys Arg Leu Lys SerAAG GAG TGA 504Lys Glu Trm
2.根据权利要求1所述的重组人干扰素α-8，其特征在于所述的rhIFNα8多肽分子量大小为22kda，pI值为4.9。
3.根据权利要求1所述的重组人干扰素α-8在大肠杆菌中的表达方法，其特征在于在IFNα8 cDNA编码区起始密码子atg前增加一段核糖体结合位点序列，在IFNα8 cDNA序列的5’端引入EcoRI酶切位点，3’端终止密码子TAA后增加SalI酶切位点，构建大肠杆菌表达载体pBV220/IFNα8，然后经工程菌筛选，蛋白分离、纯化、冻干后获得目的蛋白。
4.根据权利要求3所述的重组人干扰素α-8在大肠杆菌中的表达方法，其特征在于其中所述的在IFNα8 cDNA编码区起始密码子atg前增加一段核糖体结合位点，其序列为GAA TTC aac agg aga ctt tct g atg
5.根据权利要求3所述的重组人干扰素α-8在大肠杆菌中的表达方法，其特征在于所述的大肠杆菌表达载体为pBV220。
6.根据权利要求3所述的重组人干扰素α-8在大肠杆菌中的表达方法，其特征在于其中所述的大肠杆菌重组表达载体pBV220/IFNα8的构建包括1)IFNα8基因的亚克隆及与载体的连接将IFNα8 cDNA序列及核糖体结合位点序列亚克隆在pUC18载体上，成pUC18/IFNα8；用EcoRI/SalI双酶切消化pUC18/IFNα8及大肠杆菌表达载体pBV220，回收IFNα8及载体片段，经纯化后，采用DNA连接试剂盒进行连接，然后转化感受态大肠杆菌DH5α，LB平板过夜培养；2)工程菌筛选挑取LB平板上的阳性菌落进行酶切及测序鉴定；鉴定证实后的阳性克隆接种于5ml液体LB培养液中，30℃，250rpm/min培养12-18小时；将培养液转入50ml液体LB培养液中，继续培养至OD值为0.4-0.6，突然提高温度至42℃诱导4-5小时；离心收集菌体，进行SDS-PAGE电泳分析，即得。
7.根据权利要求3所述的重组人干扰素α-8在大肠杆菌中的表达方法，其特征在于其中所述的重组蛋白IFNα8的分离、纯化包括1)包涵体的洗涤(1)用20mM Tris.cl pH8.0，1mMEDTA洗涤破碎菌体，9000rpm×30min，弃上清；(2)用0.2％Triton X-100，20mM Tris.cl pH8.0，1mM EDTA洗涤，9000rpm×30min，弃上清；2)变性、复性、超滤(1)将洗涤好的包涵体以湿重计按1∶20(v/w)溶解于7M盐酸胍，50mMTris.cl pH8.0，10mM β-巯基乙醇，10mM EDTA缓冲液中，室温下搅拌4h，离心9000rpm×30min得透明上清液，即变性液；(2)将变性液采用稀释复性的方法进行复性，复性缓冲液为2.5MVrea，50mMtris.cl，1mMETDA。复性时缓慢滴加变性液，使复性液蛋白终浓度为0.1-0.2mg/ml，复性时间36h；(3)将蛋白复性液先过滤，再超滤(millipore)，得到超滤浓缩液；3)柱层析纯化(1)采用Q-sepharose FF阴离子交换柱先用20mM Tris.cl pH8.0平衡Q柱，再上样，上样完后首先用20mMTris.cl pH8.0洗脱，再用100mM NaCl阶段洗脱，最后用400mMNaCl阶段洗脱，280nm检测洗脱蛋白峰；(2)采用干扰素单抗层析柱先用PBS平衡抗干扰素单抗层析柱，再上样，最后经PBS洗脱，收集到蛋白峰。
8.根据权利要求3所述的重组人干扰素α-8在大肠杆菌中的表达方法，其特征在于用该方法获得的重组人干扰素α-8，经SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度大于99％。
9.根据权利要求1所述的重组人干扰素α-8在制备治疗人或动物肿瘤及病毒感染性疾病药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的重组人干扰素α-8的应用，其特征在于rhIFNα8可作为上述药物的活性成份，制备各种生理上可以接受的各种液体制剂或冻干制剂。
11.根据权利要求9所述的重组人干扰素α-8的应用，其特征在于所述的肿瘤，包括各种恶性肿瘤，如实体癌和浆液性肿瘤等。
12.根据权利要求9所述的重组人干扰素α-8的应用，其特征在于所述的病毒感染性疾病包括HBV、HCV、HIV、HSV、HPV或流感病毒等感染引起的疾病。
全文摘要
本发明涉及一种重组人干扰素α8多肽及其在大肠杆菌中的表达和应用。本发明重组人干扰素α8是根据大肠杆菌密码子的偏爱性，经编码cDNA序列突变获得的。为提高目的蛋白表达水平、纯化效率，又对cDNA序列进行优化，进而构建大肠杆菌表达载体pBV220/IFN α8，经工程菌筛选，蛋白分离、纯化、冻干后获得。本发明重组人干扰素α8多肽可用于肿瘤或HBV、HCV、HIV等病毒感染性疾病的治疗。
文档编号C07H21/04GK1534044SQ0311605
公开日2004年10月6日 申请日期2003年3月28日 优先权日2003年3月28日
发明者苟兴华, 陈守春, 李伯刚, 刘忠荣, 韩雷, 李德华, 梁波, 刘玉应 申请人:成都地奥制药集团有限公司