一种二/三甲基化肽段富集和质谱分析的方法
【技术领域】
[0001]本发明属蛋白质分析技术领域，具体涉及一种二/三甲基化修饰肽段富集和质谱分析的方法。
[0002]尤其是利用EZ-NHS-b1tin与未修饰(KmeO)或者单甲基化修饰(Kmel)的赖氨酸发生特异性反应而不会与二、三甲基化(Kme2/3)修饰的赖氨酸反应的特点使KmeO/Ι修饰肽段带上生物素基团，通过亲和素偶联的琼脂糖微球去除KmeO/Ι修饰的赖氨酸肽段，对Kme2/3修饰的赖氨酸肽段的富集并质谱分析的新方法。本发明方法首次实现对Kme2/3修饰肽段的化学富集，能显著地提高Kme2/3修饰肽段的分析质谱选择性，并且具有特异性强、重现性好、步骤简单、操作方便等特点。
【背景技术】
[0003]现有研究公开了蛋白质甲基化是生物体内组普遍存在的一种翻译后修饰，执行着重要的生物学功能。甲基化修饰在各种生命现象中都起着重要的调控作用，精氨酸甲基化主要参与调控RNA合成，DNA损伤修复，蛋白转运以及信号传递等过程，而对赖氨酸甲基化的功能研究相对较少，近期的研究发现非组蛋白赖氨酸甲基化参与转录调控以及信号转导。高灵敏地鉴定生物体内的甲基化后修饰位点是实现其进一步研究的首要前提，然而，它们的研究都面临着类似的困难，首先，甲基化修饰基团非常小，不会像乙酰化或者磷酸化修饰一样改变所修饰氨基酸位点的电子云分布，因此甲基化修饰肽段和非甲基化修饰肽段之间的理化性质差异很小，很难区分。第二，甲基化修饰的蛋白质在体内含量通常较低，蛋白酶解后产生的甲基化肽段占全部肽段的比例更低，甚至不到1%。第三，甲基化存在多种不同状态，如赖氨酸上可以发生一甲基化(Kmel)、二甲基化(Kme2)、三甲基化(Kme3)修饰，精氨酸上包括一甲基化(Rmel)、对称二甲基化(Rme2s)以及非对称二甲基化(Rme2a)，导致甲基化修饰肽段的信号分散和减弱，更难以被质谱检测。第四，带有甲基化修饰的肽段在质谱中的离子化效率和质谱响应往往比非修饰肽段低，对质谱的灵敏度要求更高。目前已有的甲基化蛋白研究策略包括肽段或者蛋白芯片，甲基化抗体和化学亲和方法与质谱联合分析，但是这些方法所得到的赖氨酸甲基化蛋白数目和可靠程度都亟待提高，而且对起始样本需求量大，通量也并不是很高。因此，本申请的发明人拟提供一种反应更加特异和更加高效的二三甲基化肽段反向富集方法，该方法将有利于实现高选择性和高灵敏度质谱鉴定，从而进一步促进甲基化蛋白质的研究。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于补充现有甲基化修饰肽段富集方法的不足，为二/三甲基化修饰肽段富集和质谱分析提供一种步骤简单、操作方便、高特异性、高重现性的新方法，实现甲基化肽选择性富集和高灵敏度质谱鉴定。
[0005]本发明提供的二/三甲基化修饰肽段富集和质谱分析的方法，利用生物素化试剂(EZ-NHS-b1tin)基团能够与未修饰(KmeO)或者单甲基化(Kmel)(记为KmeO/Ι)修饰的赖氨酸发生特异性反应而不会与二、三甲基化(Kme2/3)修饰的赖氨酸反应的特点，通过亲和素偶联的琼脂糖微球去除KmeO/Ι修饰的赖氨酸肽段，对Kme2/3修饰的赖氨酸肽段进行富集；具体步骤为:
(1)蛋白生物素化修饰:基于N-羟基琥珀酰亚胺与赖氨酸侧链氨基的高效反应，采用生物素化试剂(EZ-NHS-b1tin)，通过化学反应将生物素基团引入赖氨酸KmeO/Ι上，实现蛋白样品中赖氨酸KmeO/Ι的高效生物素化修饰；
(2)蛋白沉淀:向经步骤(I)生物素化修饰的蛋白样品加入丙酮，过夜，沉淀蛋白，同时去除过量的生物素化试剂；
(3)蛋白酶解:向经步骤(2)处理的蛋白中加入胰蛋白酶，胰蛋白酶和蛋白的质量比1:40-60，充分混合，35-39摄氏度酶切14-16小时，使蛋白完全酶解成氨基酸长度在10-20之间的的肽段；
(4)亲和素去除生物素修饰肽段:用缓冲液(例如:20mMNaH2PO4，0.15M NaCl (PH7.4))稀释肽段至1-1.5ml，用亲和素偶联的琼脂糖微球为吸附剂，利用亲和素和生物素之间的高亲和能力，将生物素化的KmeO/Ι吸附到亲和素偶联的琼脂糖微球上，亲和吸附过程在2-6摄氏度条件下进行，时间2-4小时，充分去除发生生物素修饰的KmeO/Ι修饰肽段；
(5)质谱分析:600-1200g(离心机的转速，说明:离心机转数与离心力的换算，r为离心机转轴中心与离心套管底部内壁的距离;:rpm(revolut1n per minute)为离心机每分钟的转数;RCF(relative eentrifugal force)为相对离心力，以地心引力，即重力加速度的倍数来表示，一般用g表示)离心后取上清，通过除盐柱富集上清中的肽段，冻干，然后进行质谱检测。
[0006]步骤(I)中，所述蛋白样品可用缓冲液1(如:l-5%SDS，10-30Mm Hepes，PH=7_8)提取细胞全蛋白得到，蛋白样品浓度为lugAiL~ 5ugAiL;所述采用生物素化试剂(EZ-NHS-b1tin)，通过化学反应将生物素基团引入赖氨酸KmeO/Ι上，是在蛋白样品中，加入5_30mM的碳酸氢氨，同时加入等体积5-30mM的EZ-NHS-b1tin，在35-39摄氏度下避光混合，使样品中的KmeO/1修饰的赖氨酸被充分被生物素化。
[0007]步骤(2)中，蛋白沉淀的操作过程为:在向所述蛋白样品中加入5-10倍体积的预冷丙酮，-10-30摄氏度过夜；11000-15000g离心20-40分钟后得到蛋白沉淀，用预冷丙酮洗2-4次，完全去除生物素化试剂。
[0008]步骤(3)中，可先用6-10M尿素重溶步骤(2)中得到的蛋白沉淀，用缓冲液2(如15-40 mM NH4HCO3)稀释至0.5-2M尿素;然后加入胰蛋白酶，进行酶解。
[0009]步骤(4)中，稀释肽段的缓冲液可为15-40mM NH4HCO3ji琼脂糖微球材料与所富集肽段的体积质量比为50-200ul/lmg。
[0010]步骤(4)中，先对亲和素偶联的琼脂糖微球用缓冲液进行清洗，重复2-3次，缓冲液可为:15-40 mM NaH2P04，0.1-0.2 M NaCl(PH7.4)。
[0011]步骤(5)中，操作过程为:合并步骤(4)中所得到的上清和清洗液;然后除盐、冻干；再重溶于0.05-0.2 (优选0.1%)FA中；最后进行LC-MS/MS分析。
[0012]本发明的一个实施例中，所述步骤(I)中的蛋白样品浓度为IugAiL~ 5ug/yL，溶于2%SDS, 20mM Hepes(PH=7.4)的缓冲液I中；蛋白样品被5mM的EZ-NHS_B1tin，5mM的碳酸氢钱中避光反应30min，加入终浓度碳酸氢钱至终浓度为20 mM混合2分钟以终止反应。
[0013]本发明的一个实施例中，所述的步骤(3)中用SM尿素重溶蛋白至完全溶解，可适当超声，用25mM NH4HCO3作为缓冲液2对蛋白样品进行稀释，至尿素终浓度为IM以下，按Img蛋白中加入20ug胰蛋白酶的比例进行酶解，并保持37摄氏度酶解14-16小时。
[0014]本发明的一个实施例中，所述步骤(4)中的亲和素偶联的琼脂糖微球购于天地人和生物科技有限公司；其中加入的琼脂糖微球材料与所富集肽段的体积质量比为10ul/Img;生物素和亲和素的结合温度是4摄氏度，结合时间是2-4小时。
[0015]本发明的一个实施例中，所述的步骤(4)中，用20mM NaH2PO4^0.15M NaCl(PH7.4)作为缓冲液3，每次用400ul缓冲液3对亲和素偶联的琼脂糖微球进行清洗，重复2次;每次清洗后100g离心将固相微球和溶液分开，收集琼脂糖微球；
本发明采用亲和素偶联的琼脂糖微球为吸附剂，利用亲和素和生物素化修饰后的肽段上的生物素之间的亲和作用，经离心将生物素化修饰的肽段去除，最终实现二、三甲基化修饰肽段富集和质谱分析。本发明首次实现对Kme2/3修饰肽段的化学富集，能显著地提高Kme2/3修饰肽段的分析质谱选择性，并且具有特异性强、重现性好、步骤简单、操作方便等特点。
【附图说明】
[0016]图1为本富集并质谱鉴定方法的流程图。
[0017]图2为0.05 mM标准肽段FQLTDIPAAPR，ALSNSTPQNSFSEK的MALD1-T0F-MS谱图，MALD1-T0F-MS谱图纵坐标为质谱峰的相对强度(％ Intensity )，横坐标为质荷比(m/z);(a/d)未反应肽段，(b/e) 1mM EZ-B1tin,PBSCPH 7.4)，室温 30min 反应后的肽段，(c/f)1mM EZ-B1tin，1mM NH4CO3,2% SDS，20mM HepesCPH 7.4)37°C 30min反应后的肽段。*为肽段底物的单电荷峰，#为生物素修饰后的肽段;对比图(a/d)、图(b/e)和图(c/f)可以看出，图(c/f)中的生物素化效率达到95%以上，能够实现肽段的高效生物素