专利名称：利用特征肽和质谱对混合物中的单个重组蛋白进行多重定量的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于给复杂样品中选定的多重重组蛋白，比如血清中的重组多克隆抗体或者培养物上清中表达的重组多克隆抗体定量的分析方法。所述方法涉及通过质谱对肽进行高灵敏度定量。
背景技术：
需要对各种复杂蛋白样品，例如人血清或血浆中重组蛋白的定量方法。传统上，这类检测方法采取免疫分析法的形式，比如象ELISA，利用的是抗目标蛋白的特异抗体作为特异和检测试剂。新方法，尤其是涉及标记了同位素的肽或蛋白内部标准的那些方法，使得质谱可以提供这类定量的肽和蛋白检测法。现有技术对利用内部參照肽通过质谱进行的定量已有很好的描述。但是，在应用到非常复杂的混合物上吋，比如完整血浆蛋白消化为肽而产生的那些混合物上时，还存在MS检测法的动态范围和灵敏度的问题。关于动态范围和灵敏度的问题以前是通过将免疫亲和与MS联用于内源生物标记物的定量分析而解决的[1-5]。本发明将重组多克隆蛋白(比如重组多克隆抗体)从复杂样品(比如血清或血浆)或培养物上清中的亲和纯化和利用内部參照肽经质谱进行的定量结合在一起。本发明通过采用亲和纯化步骤使得灵敏度得以提高。本发明探讨的另ー个问题是分析物的完整性。传统上，基于肽对蛋白进行的定量可能在完整蛋白之外将部分降解的蛋白也计量在内。这在对生物药物进行定量以便制作例如药代动力学谱时尤其是个问题。本发明的优选实施方案中，抗体混合物的量化采用了一个初始的蛋白A纯化步骤。因为蛋白A结合免疫球蛋白的Fe部分并且随后的定量基于来自CDR区的特异标记肽，因此可能的确是完整抗体被定量。根据本发明的方法使得能够对血清中的抗体进行检测和量化，而不需要象例如ELISA中的特异性抗个体基因型的抗体。而且本发明公开的方法是通用的。只需要鉴定并确认合适的特征肽用于MS定量。要达到更高的灵敏度，有可能采用以抗特征肽的抗体进行的免疫亲和步骤。因为本发明的方法涉及通过质谱检测独特肽，对抗特征肽的抗体没有高特异性，只有高亲和性的要求。与ELISA相比，根据本发明的方法的另ー个优势是质谱分析产生更大的动态范围。发明概述本发明涉及药代动力学研究中进行多克隆性表征和高通量分析的方法。发明涉及样品中一或多个重组蛋白的定量方法，该方法包括的步骤有i)通过亲和纯化将所述ー或多个重组蛋白浓缩以得到第一级分 )消化所述第一级分从而将所述重组蛋白中每ー个的一或多个特异特征肽释放到第二级分中
iii)给所述第一级分和/或所述第二级分加入所述重组蛋白中每ー个的一或多个内部參照肽iv)任选地，利用偶联了抗特征肽抗体的树脂将所述特征肽和所述内部參照肽浓缩，然后将所述特征肽和所述内部參照肽释放从而得到第三级分；和/或任选地，利用树脂以能够分开样品的化学物将所述特征肽和所述内部參照肽浓缩，从而使目标肽得以浓缩V)通过质谱分析对所述特征肽进行量化。所述方法可以用于样品中一或多个蛋白的定量。在优选实施方案中，方法被用于样品中两个或更多个蛋白，比如重组多克隆抗体的定量。所述样品可以是血清或血浆样品、细胞培养物或生物反应器上清或者是处理中的重组多克隆抗体样品。方法可以用于药代动力学研究中确定单个抗体的体内清除率。在另ー个实施方案中，方法被用于重组多克隆抗体样品中药物的多克隆性表征。再一个实施方案中，本发明涉及方法在与制备重组多克隆抗体相关联的定量一或多个重组蛋白中的用途。定量可以在药品和/或药物的上游和/或下游加工过程中进行。发明的ー个关键特点是它g在建立针对事先选定的特异重组蛋白，而不是将ー或多个样品的所有未知成分互相进行比较的定量方法。根据本发明的方法可以用于分析血清样品中的一或多个同源重组蛋白，其中所述血清样品还包含了其他同源蛋白。本发明的方法能促进对血清中的多克隆抗体组合物中单个抗体进行的分析，以便无需抗独特型抗体就能进行例如药代动力学研究，而不是象在例如基于ELISA的技术中那样需要抗独特型抗体。相应地，在比如药代动力学研究中，可以在给药后确定和/或监测有需要的个体中的重组多克隆抗体浓度。在一个实施方案中，纯化是通过蛋白A或类似的Fe结合分子进行的，随后通过测量优选位于抗体可变结构域之一的肽来进行定量。这样确保了被测量的分析物不是降解产物，因为它依赖于Fe和Fab的同时存在。定义和缩写名词“特征肽(signature peptide (s)) ”是指ー或多个不同的肽被选中作为样品中给定蛋白的指示片段/肽(monitor fragment/peptide)。名词“内部參照肽”是指与特征肽氨基酸序列相同的同位素标记的肽。“内部參照肽”可以是相应特征肽的任何改造形式，其I)被适宜的结合剂识别为与特征肽等同或者生物物理特性表明是化学等同物，和2)它们的差异可以通过质谱来区别，通过直接測量分子量或者通过对片段进行质量測量(例如，通过MS/MS分析)，或者通过另ー种同等的方式。名词“抗体”是指任何物种的任何种类的免疫球蛋白分子，或者由其衍生的任何分子，或者任何其他特异性结合剤，所述结合剂是通过对保守分子支架进行改造从而能够特异结合分析物或监测片段，比如重组蛋白和/或特征肽。名词“抗肽抗体”被作为“抗特征肽抗体”的同义词使用，它可以是任何类型的抗体(以上广泛意义上)，所述抗体能够与肽结合，比如特征肽和内部參照肽从而从样品或经过处理的样品中富集。总的来说，本文中任何使用抗体之处应理解为可以通过另ー种结合齐U，比如亲和体或抗体模拟物来实现的目的。在一个实施方案中，抗肽抗体与肽的结合不需要特异性很高-即在ー个实施方案中，高亲和カ(affinity)和/或亲合力(avidity)更重要。
名词“结合剂(binding agent) ”可以是多种不同的分子、生物细胞或聚集物中的任何ー种。在本文语境中，在检测前用结合剂结合待检测的分析物以便使之富集，其特异结合方式使得一或多种分析物被结合并富集。蛋白、多肽、肽、核酸(寡核苷酸和多聚核苷酸)、抗体、配体、多糖、微生物、受体、抗生素、测试化合物(特别是通过组合化学产生的那些)均可以各自作为结合剤。名词“结合”包括任何物理附着或密切关联，可以是永久性或暂时的。一般来说，可逆结合包括促进目的分子和被测量的分析物之间的物理附着的电荷相互作用、氢键、疏水作用、范德华力等方面。名词“蛋白”是指任何不论长度或翻译后修饰的氨基酸链。蛋白可以以单体或多聚体存在，包含两个或以上的组装的多肽链、蛋白片段、多肽、寡肽或肽。·名词“重组多克隆抗体”是指利用重组技术制备的重组抗体分子的精选组合物。本发明特别涉及对重组多克隆抗体组合物的标准，其中所述抗体是利用通常用于商业生产重组抗体的细胞系表达的，例如以上提及的人或其它哺乳动物细胞系之一。在本发明的语境中，抗体被认为是重组的，如果其编码序列已知，并且是由杂交瘤或永生化B细胞表达的。在本发明的语境中，名词“重组蛋白”包括“重组多克隆抗体”。重组多克隆抗体描述了由不同抗体分子组成的组合物，其能够与相同或不同抗原上的多个不同特异性抗原决定簇结合或反应。多克隆抗体还可以被看作是“单克隆抗体鸡尾酒”。多克隆抗体的变化性位于构成多克隆抗体的各个抗体中所谓的可变区，特别是互补决定区CDR1、CDR2和CDR3区中。可以通过本发明的方法进行表征的多克隆抗体可以是任何来源，例如嵌合的、人源化的或者完全来自人。根据本发明的重组多克隆抗体优选包含至少两个不同抗体群。名词“多克隆性(polyclonality)”是指这样的事实，即重组多克隆蛋白包含限定数量的蛋白，因此与传统重组蛋白或单克隆抗体相比是多克隆的。这个名词可以用于在基因和蛋白水平描述多克隆性。重组多克隆蛋白的变化性特征在于重组多克隆蛋白中各个成员的氨基酸序列的不同。名词“组成变化(compositional variability) ”是指最终批次之间单个重组蛋白或抗体的实际量的测量变化。名词“免疫球蛋白”常用作血液或血清中存在的抗体混合物的总称。因此血清来源的多克隆抗体经常被称为免疫球蛋白或Y球蛋白。但是，“免疫球蛋白”还可以用于命名来自其他来源的抗体的混合物，例如重组免疫球蛋白。所有免疫球蛋白不论其特异性，具有共同的四个多肽链结构两个相同的重链，每个取决于表达状态，可能携帯共价附着的寡糖基团；和两个相同的通常未被糖基化的轻链。重链和轻链通过ニ硫键被连在一起。重链还通过ニ硫键相互连接。所有四个多肽链均含有分别位于羧基端和氨基端的恒定和可变区。免疫球蛋白根据其重链成分被分为5个主要的类型IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。轻链有两个类型K (kappa)和λ (lambda)。每种分子可能含有κ或Y，但不会两者都含有。IgG和IgA还可以进ー步划分为由每个类型中氨基酸序列的细微差别造成的亚型。在人体中发现了四个IgG亚型:1861、1862、1863和化64。在小鼠中也发现了四个IgG亚型IgGl、IgG2a、IgG2b和IgG3。在人中，有三个IgA亚型=IgAl, IgA2和IgA3。亲和体:亲和体分子是小的强亲和力蛋白分子，可以经改造与大量靶蛋白特异结合。
MS是质谱。MS/MS是串联质谱。MRM是多反应监测或等同的技术，比如例如SRM(单个/选定反应监测)。B细胞受体是位于B细胞外表面的跨膜受体蛋白。受体的结合部分由膜结合抗体构成，这些抗体与所有抗体一祥，含有独特的随机決定的抗原结合位点。T细胞受体或TCR是在T淋巴细胞(或T细胞)表面发现的分子，它们通常负责识别与主要组织相容性复合体(MHC)分子结合的抗原。在95%的T细胞中，是由α和β链构成的异ニ聚体，而5%Τ细胞中含有由Y和δ链构成的TCRs。
附图
描述图I:显示A992特征肽的峰面积与AQUA肽的比率关系的标准曲线，其中在一系列空白食蟹猴(Cynomolgus monkey)血衆中加入不同浓度的A992。姆个样品加入I pmol的A992 AQUA肽。一式三份确定每个浓度处的比率。以线性回归对数据进行拟合，虚线显示最佳拟合线性回归的95%置信帯。图2:显示A1024特征肽的峰面积与AQUA肽的比率关系的标准曲线，其中在空白食蟹猴血浆集合中加入不同浓度的A1024。每个样品加入I pmol的A1024 AQUA肽。一式三份确定每个浓度处的比率。以线性回归对数据进行拟合，虚线显示最佳拟合线性回归的
95%置信带。图3:被给予8mg/kg药物前导物的食蟹猴中的A992和A1024的血浆浓度ー时间曲线。在给予药物前导物后的O. 5到48小时确定A992和A1024的浓度。图4:0. 2yg/mト100yg/ml范围内的标准曲线，一式三份(ー个异常值)。线性曲线显示了加标(spiked)血清样品中抗体浓度与相对反应特征肽/參照肽的关系。同时测量两种抗体。上图代表A992的标准曲线，下图代表A1024的标准曲线。发明详述本发明涉及用于给复杂样品中选定的多重重组蛋白，比如血清中的重组多克隆抗体或者细胞或组织培养物上清中表达的重组多克隆抗体定量的分析方法。所述方法涉及通过质谱对肽进行高灵敏度定量。发明涉及样品中一或多个重组蛋白的定量方法，包括的步骤有i)通过亲和纯化将所述ー或多个重组蛋白浓缩以得到第一级分ii)消化所述第一级分从而将所述重组蛋白中每ー个的一或多个特异特征肽释放到第二级分中。在消化前，任选对所述第一级分进行还原和/或烷基化。iii)给所述第一级分和/或所述第二级分加入所述重组蛋白中每ー个的一或多个内部參照肽iv)任选地，利用偶联了抗特征肽的抗体的树脂将所述特征肽和所述内部參照肽浓缩，然后将所述特征肽和所述内部參照肽释放从而得到第三级分；和/或任选地，利用树脂和能够分开样品的化学物将所述特征肽和所述内部參照肽浓缩，从而使目的肽得以浓缩V)通过质谱分析对所述特征肽进行量化vi)任选地，用样品中加有浓度已知的相应蛋白的制品重复步骤i)到V)以便获得蛋白标准曲线vi)将步骤V)中获得的所述特征肽的定量与步骤vi)中获得的蛋白标准曲线进行比较，得到所述样品中所述ー或多个重组蛋白的量。在一个实施方案中，该方法得到了所述样品中所述ー或多个重组蛋白的绝对定量。在优选实施方案中，本发明涉及样品中两种或多种重组蛋白的定量方法，包括如上限定的步骤i)一vi)。如果对特定应用有利，步骤ii)和iii)可以互換。步骤i)涉及重组蛋白的浓缩(up-concentration)以上步骤i)可以包括现有技术中 描述的浓缩/富集一或多个重组蛋白的任何方法-富集到的级分被称为第一级分。在一个实施方案中，浓縮/富集捕获到完整蛋白，t匕如诸如完整重组多克隆抗体的完整重组蛋白。通过亲和层析进行的分离是基于对特定结合分子的亲和カ的不同。将结合分子或者复数种结合分子(这些不同选项在下文中统称为结合分子)固定在层析介质上，含有重组蛋白的样品被上样到亲和柱上，上样条件有利于重组蛋白中各个成员与固定的结合分子之间的相互作用。对固定的结合分子没有亲和カ的蛋白收集到柱子流过液中，随后在能够抵消结合的条件(例如，低pH、高盐浓度或者高配体浓度)下，将对固定化结合分子有亲和力的蛋白从柱子上洗脱。浓縮/富集可以利用蛋白A进行。可以将蛋白A固定到支持物上，用于从原始蛋白混合物(比如血清)中纯化总IgG。蛋白A以高亲和力结合人IgGl和IgG2，以及小鼠IgG2a和IgG2b。蛋白A与人IgM、IgA和IgE以及小鼠IgG3和IgGl以中等亲和カ结合。蛋白A还可以用于纯化来自其他动物，包括猴的抗体。蛋白A的一个重组形式被称为MabSelectSnRe。在一个实施方案中，步骤i)中使用的亲和层析的基质由固定在琼脂糖珠子上的葡萄球菌蛋白A构成。替代品包括蛋白A-SEPHAR0SE ;固定在琼脂糖上的蛋白；与活化的精氨酸-琼脂糖偶联的蛋白A ;以及偶联了磁珠、橡胶珠和琼脂糖珠、聚合物珠、聚苯こ烯珠和PEG珠的蛋白A。除了蛋白A，以上步骤i)中可以使用其他能够结合免疫球蛋白的蛋白，比如能够结合免疫球蛋白的细菌蛋白，象例如蛋白G、蛋白A/G和蛋白し就被识别的抗体部分和能够结合的抗体物种和类型而言，这些免疫球蛋白结合蛋白的抗体结合特性各不相同。发明还涉及使用其他免疫球蛋白结合蛋白，比如象链球菌蛋白G、兔抗小鼠IgG免疫球蛋白、在其他物种中产生的抗人IgG免疫球蛋白和抗猴IgG免疫球蛋白。本发明还涉及在步骤i)中使用其他基于亲和力的纯化方法。这些包括抗体的任何目标分子、Fe受体、Con A(例如来自洋刀豆(Canavalia ensiformis) (Jack bean)的刀豆凝集素A;其识别糖蛋白)、其他类型的凝集素亲和层析、抗抗体可变部分的抗体或者抗抗体恒定部分的抗体(比如抗Fe部分的抗体)。磁珠上的抗体也可以用于步骤i)。另ー个实施方案中，步骤i)中使用了循环免疫亲和。另ー个实施方案中，步骤i)包括利用树脂和/或柱子纯化ー或多种抗体，所述树脂和/或柱子偶联了被一或多种重组蛋白，比如一或多种重组多克隆抗体识别的一或多种肽或靶抗原。在一个实施方案中，所述ー或多种蛋白的纯化可以借助与结合的靶抗原的相互作用来进行。初始的浓缩步骤，比如步骤i)中通过蛋白A进行的富集，可以批量进行，比如以96孔格式进行或者作为多维LC-MS系统的一部分。替代地，可以离线分批进行。
步骤ii)涉及还原、烷基化和消化在步骤i)的初始浓缩之后，用选定的蛋白酶消化第一级分以便从每种待量化的蛋白中将一或多种特异性特征肽释放到第二级分中。在一个实施方案中，第一级分在消化前被还原和烷基化。第二级分包含被蛋白酶释放的特征肽和其他肽。所述第一和/或第二级分的还原、烷基化和消化可以通过本领域已知的任何方法进行。例如肽可以利用ニ硫苏糖醇(DTT)还原，然后用例如4-こ烯基吡啶、碘こ酰胺或碘こ酸进行烷基化。第一级分(其中有希望测量的一或多种选定的重组蛋白)优选用合适的蛋白酶，比如胰蛋白酶基本完全d消化，或者如果能够以可重复的方式进行部分消化，从而产生肽(包括选定的特征肽)。对于其序列在重组蛋白序列中出现一次的特征肽，理想情况下，这一消化应当产生与第一级分中重组蛋白分子数量相同的特征肽分子。消化可以首先(用例如脲或盐酸胍)将蛋白样品变性，(用例如ニ硫苏糖醇或巯基こ醇)还原蛋白中的ニ硫键，(通过加入碘こ酰胺)将半胱氨酸烷基化，并最终(在除去或者稀释变性剂后)加入选定的蛋白水解酶，比如胰蛋白酶，然后温育以便消化进行。在一个优选实施方案中，变性不会造成蛋白被化学修饰。变性可以利用与MS相容的ー或多种去污剂进行。在一个实施方案中，RapiGestTM SF Surfactant (Waters)被用于加强蛋白的酶解消化，并代替脲或盐酸胍作为还原和烷基化过程中的变性剂。温育后，通过加入化学抑制剂(例如DFP或PMSF)或者通过(经加热或加入变性齐U，或者两者)变性、或者通过酸化、或者除去(如果诸如胰蛋白酶的蛋白酶位于固相支持物上)蛋白酶(比如胰蛋白酶)来終止蛋白酶(例如胰蛋白酶)的作用。为了避免之后样品中残余的蛋白水解活性对抗体的破坏，破除蛋白酶活性很重要。消化可以由任何蛋白酶进行，包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、Asp-N、Glu-C, Lys-C,Iys-N和Arg-C(蛋白酶的特异性參见下文中的表格)。可以使用ー种以上的蛋白酶，比如2、3、4、5、6、7、8、9、10或10种以上的蛋白酶。 在一个实施方案中，消化可以通过化学降解来进行。
权利要求
1.样品中一或多种重组蛋白的定量方法，所述方法包括以下步骤 i)通过亲和纯化将所述一或多种重组蛋白浓缩以得到第一级分 ii)消化所述第一级分从而将所述重组蛋白中每一种的一或多个特异性特征肽释放到第二级分中 iii)给所述第一级分和/或所述第二级分加入所述每一特征肽的一或多个内部参照肽 iv)通过质谱分析对所述特征肽进行定量。
2.权利要求I所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤 i)用加标了浓度已知的相应蛋白制品的样品重复权利要求I中的步骤i)_iv)，以得到蛋白标准曲线，和 ii)将权利要求I的步骤iv)中得到的所述特征肽的定量与步骤i)中获得的蛋白标准曲线进行比较，并得到所述样品中所述一或多种重组蛋白的定量。
3.权利要求I所述的方法，其中所述方法还包括在权利要求I中步骤ii)的消化之前进行的还原和/或烷基化步骤。
4.权利要求I所述的方法，其中所述方法还包括利用树脂以化学物质将所述特征肽和所述内部参照肽进行浓缩的步骤，所述化学物质能够将样品分级分离从而使目标肽得以浓缩。
5.权利要求I所述的方法，其中所述方法还包括利用偶联了抗特征肽抗体的树脂将所述特征肽和所述内部参照肽浓缩，然后将所述特征肽和所述内部参照肽释放从而得到第三级分的步骤。
6.权利要求I所述的方法，其中权利要求I中步骤i)中的亲和纯化包括与一或多种免疫球蛋白结合蛋白结合。
7.权利要求I所述的方法，其中权利要求I中步骤i)中的亲和纯化包括与一或多种细菌性免疫球蛋白结合蛋白结合。
8.权利要求6所述的方法，其中所述免疫球蛋白是人免疫球蛋白。
9.权利要求8所述的方法，其中所述人免疫球蛋白是人IgGl、人IgG2、人IgM、人IgA或人IgE。
10.权利要求6所述的方法，其中所述免疫球蛋白是小鼠、兔、山羊、猪、奶牛、骆驼、犬、猫、鸡、鱼或猴免疫球蛋白。
11.权利要求10所述的方法，其中所述小鼠免疫球蛋白是小鼠IgG2a、小鼠IgG2b、小鼠IgG3或小鼠IgGl。
12.权利要求I所述的方法，其中步骤i)中的亲和纯化包括与蛋白A结合。
13.权利要求I所述的方法，其中步骤i)中的亲和纯化包括与蛋白G结合。
14.权利要求I所述的方法，其中步骤i)中的亲和纯化包括与蛋白A/G结合。
15.权利要求I所述的方法，其中步骤i)中的亲和纯化包括与蛋白L结合。
16.权利要求I所述的方法，其中步骤i)中的亲和纯化包括与抗多克隆抗体恒定区的抗体结合。
17.权利要求I所述的方法，其中步骤i)中的亲和纯化包括与Fe受体结合。
18.权利要求I所述的方法，其中步骤i)中的亲和纯化包括与ConA结合。
19.权利要求I所述的方法，其中步骤i)中的亲和纯化包括与抗体的靶结合。
20.权利要求I所述的方法，其中步骤ii)中的消化是用胰蛋白酶进行的。
21.权利要求I所述的方法，其中步骤ii)中的消化是用胰凝乳蛋白酶进行的。
22.权利要求I所述的方法，其中步骤ii)中的消化是用Asp-N进行的。
23.权利要求I所述的方法，其中步骤ii)中的消化是用Glu-C进行的。
24.权利要求I所述的方法，其中步骤ii)中的消化是用Lys-C进行的。
25.权利要求I所述的方法，其中步骤ii)中的消化是用Iys-N进行的。
26.权利要求I所述的方法，其中步骤ii)中的消化是用Arg-C进行的。
27.权利要求I所述的方法，其中消化基本上进行完全。
28.权利要求3所述的方法，其中还原是用二硫苏糖醇(DTT)进行的。
29.权利要求3所述的方法，其中还原是用巯基乙醇进行的。
30.权利要求3所述的方法，其中烷基化是用4-乙烯吡啶进行的。
31.权利要求3所述的方法，其中烷基化是用碘乙酰胺进行的。
32.权利要求3所述的方法，其中烷基化是用碘乙酰胺和/或碘乙酸进行的。
33.权利要求I所述的方法，其中步骤iii)中的一或多种内部参照肽标记了13C。
34.权利要求I所述的方法，其中步骤iii)中的一或多种内部参照肽标记了15N。
35.权利要求I所述的方法，其中步骤iii)中的一或多种内部参照肽标记了180。
36.权利要求I所述的方法，其中步骤iii)中的一或多种内部参照肽是通过合成后标记方法制备的。
37.权利要求I所述的方法，其中步骤iii)中的一或多种内部参照肽是通过化学合成制备的。
38.权利要求I所述的方法，其中步骤iii)中的一或多种内部参照肽是在活细胞内通过代谢引入而制备的。
39.权利要求38所述的方法，其中所述细胞是微生物的组成部分。
40.权利要求38所述的方法，其中所述细胞是培养中的哺乳动物细胞。
41.权利要求I所述的方法，其中步骤iii)中的一或多种内部参照肽是在体外制备的。
42.权利要求I所述的方法，其中步骤iii)中的一或多种内部参照肽的制备方法包括用氘代乙酸根标记伯胺基团。
43.权利要求I所述的方法，其中步骤iii)中的一或多种内部参照肽的制备方法包括n-末端特异试剂。
44.权利要求I所述的方法，其中步骤iii)中的一或多种内部参照肽的制备方法包括肽羧基基团的全甲基酯化。
45.权利要求I所述的方法，其中步骤iii)中的一或多种内部参照肽的制备方法包括在切割过程中给胰蛋白酶解肽C端添加双18O标记。
46.权利要求I所述的方法，其中步骤iii)中的一或多种内部参照肽的制备方法包括N端肽标记法。
47.权利要求I所述的方法，其中步骤iii)中的一或多种内部参照肽的制备方法包括NIT (N-末端同位素编码的标记法)。
48.权利要求I所述的方法，其中步骤iii)中的一或多种内部参照肽的制备方法包括C-末端妝标记法。
49.权利要求I所述的方法，其中步骤iii)中的一或多种内部参照肽的制备方法包括与N末端和C末端肽标记法不同的标记法。
50.权利要求I所述的方法，其中步骤iii)中的一或多种内部参照肽的制备方法包括基于氨基酸的标记法。
51.权利要求I所述的方法，其中步骤iii)中的一或多种内部参照肽的制备方法包括给每个肽中的一个氨基酸进行基于氨基酸的标记。
52.权利要求4所述的方法，其中所述抗特征肽抗体是来源于多克隆血清的抗体。
53.权利要求4所述的方法，其中所述抗特征肽抗体是单克隆抗体。
54.权利要求I所述的方法，其中所述内部参照肽具有与重组多克隆抗体和/或TcR内的序列相同的序列。
55.权利要求54所述的方法，其中所述重组多克隆抗体内的序列位于所述重组多克隆抗体的恒定区内。
56.权利要求54所述的方法，其中所述重组多克隆抗体内的序列位于所述重组多克隆抗体的可变区内。
57.权利要求54所述的方法，其中所述重组多克隆抗体内的序列位于所述重组多克隆抗体的轻链内。
58.权利要求54所述的方法，其中所述重组多克隆抗体内的序列位于所述重组多克隆抗体的重链内。
59.权利要求54所述的方法，其中所述重组多克隆抗体内的序列位于所述重组多克隆抗体的框架区内。
60.权利要求54所述的方法，其中所述重组多克隆抗体内的序列位于所述重组多克隆抗体的高变结构域内。
61.权利要求54所述的方法，其中所述重组多克隆抗体内的序列位于所述重组多克隆抗体的互补决定区(⑶幻内。
62.权利要求54所述的方法，其中所述重组多克隆抗体内的序列位于所述重组多克隆抗体的⑶Rl内。
63.权利要求54所述的方法，其中所述重组多克隆抗体内的序列位于所述重组多克隆抗体的⑶R2内。
64.权利要求54所述的方法，其中所述重组多克隆抗体内的序列位于所述重组多克隆抗体的⑶R3内。
65.权利要求4所述的方法，其中所述特征肽利用基于离子交换的分离方法进行浓缩。
66.权利要求4所述的方法，其中所述特征肽利用基于反相的分离方法进行浓缩。
67.权利要求4所述的方法，其中所述特征肽利用基于亲水相互作用的分离方法进行浓缩。
68.权利要求4所述的方法，其中所述特征肽利用基于疏水相互作用的分离方法进行浓缩。
69.权利要求4所述的方法，其中所述特征肽利用基于大小排阻的分离方法进行浓缩。
70.权利要求5所述的方法，其中所述抗特征肽抗体是在兔中产生的。
71.权利要求5所述的方法，其中所述抗特征肽抗体是在鸡中产生的。
72.权利要求5所述的方法，其中所述抗特征肽抗体是在山羊中产生的。
73.权利要求5所述的方法，其中所述抗特征肽抗体是在绵羊中产生的。
74.权利要求5所述的方法，其中所述方法按批次进行。
75.权利要求5所述的方法，其中所述方法是以96孔形式进行。
76.权利要求5所述的方法，其中所述方法是作为多维LC-MS系统的一部分进行的。
77.权利要求5所述的方法，其中所述方法是离线进行的。
78.权利要求5所述的方法，其中所述方法包括，所述特征肽和参照肽被直接洗脱到所述离子源中。
79.权利要求5所述的方法，其中所述方法包括，所述特征肽和参照肽被直接洗脱到ESI源中。
80.权利要求I所述的方法，其中所述质谱包括通过ESI进行电离。
81.权利要求I所述的方法，其中所述质谱包括通过MALDI进行电离。
82.权利要求I所述的方法，其中所述质谱包括LC-MS分析，后者包括二维或多维色谱的分级分离。
83.权利要求I所述的方法，其中所述质谱包括LC-MS分析，后者包括多维色谱。
84.权利要求I所述的方法，其中所述质谱包括LC-MS分析，后者包括一维LC分离。
85.权利要求I所述的方法，其中所述质谱包括LC-MS分析，后者包括二维或多维LC分离。
86.权利要求I所述的方法，其中所述质谱包括基于傅里叶变换离子回旋共振(FTICR)、Q-TOF或三重四极杆的方法。
87.权利要求I所述的方法，其中所述质谱包括LC-MS/MS。
88.权利要求I所述的方法，其中所述质谱包括LC-ESI-MS/MS。
89.权利要求I所述的方法，其中所述质谱包括LC-MALDI-MS/MS。
90.权利要求I所述的方法，其中所述质谱包括基于多重反应监测(MRM)的方法。
91.权利要求I所述的方法，其中所述质谱包括提取的离子色谱图。
92.权利要求I所述的方法，其中所述质谱包括基于离子阱的方法。
93.权利要求I所述的方法，其中所述质谱包括基于ESI-三重四极杆的方法。
94.权利要求I所述的方法，其中所述质谱包括基于Orbitrap的方法。
95.权利要求I所述的方法，其中所述质谱包括基于ESI-TOF的方法。
96.权利要求I所述的方法，其中所述质谱包括基于ESI-Q-TOF的方法。
97.权利要求I所述的方法，其中所述一或多种重组蛋白包含两种或以上的重组多克隆抗体。
98.权利要求I所述的方法，其中所述一或多种重组蛋白包含两种或以上的嵌合多克隆抗体。
99.权利要求98所述的方法，其中所述两种或以上的亲和多克隆抗体包含人部分和小鼠部分。
100.权利要求99所述的方法，其中所述人部分是多克隆抗体的恒定区。
101.权利要求99所述的方法，其中所述人部分是多克隆抗体的可变区。
102.权利要求99所述的方法，其中所述小鼠部分是多克隆抗体的恒定区。
103.权利要求99所述的方法，其中所述小鼠部分是多克隆抗体的可变区。
104.权利要求I所述的方法，其中所述一或多种重组蛋白包含一或多种同源物。
105.权利要求I所述的方法，其中所述样品是血清样品。
106.权利要求I所述的方法，其中所述样品是血浆样品。
107.权利要求I所述的方法，其中所述样品是细胞培养物上清。
108.权利要求I所述的方法，其中所述样品是生物反应器上清。
109.权利要求I所述的方法，其中所述一或多种重组蛋白包含用于治疗和/或预防两种或以上传染性疾病的重组多克隆抗体。
110.权利要求I所述的方法，其中所述一或多种重组蛋白包含用于治疗和/或预防两种或以上细菌感染的重组多克隆抗体。
111.权利要求I所述的方法，其中所述一或多种重组蛋白包含用于治疗和/或预防两种或以上病毒感染的重组多克隆抗体。
112.权利要求I所述的方法，其中所述一或多种重组蛋白包含用于治疗和/或预防两种或以上癌症形式的重组多克隆抗体。
113.权利要求I所述的方法，其中所述一或多种重组蛋白包含由不同重组多克隆抗体组成的重组多克隆抗体。
114.权利要求I所述的方法，其中所述一或多种重组蛋白包含重组多克隆抗体，所述重组多克隆抗体由不同重组多克隆抗食蟹猴D(RhD)抗体组成，比如SymOOl。
115.权利要求I所述的方法，其中所述一或多种重组蛋白包含重组多克隆抗牛痘病毒抗体来代替现有的抗牛痘高免疫免疫球蛋白(VIG)，比如Sym002。
116.权利要求I所述的方法，其中所述一或多种重组蛋白包含针对抗呼吸道合胞病毒的重组多克隆抗体，比如Sym003。
117.权利要求I所述的方法，其中所述一或多种重组蛋白包含针对人类癌抗原的重组多克隆抗体。
118.权利要求I所述的方法，其中所述一或多种重组蛋白包含针对人EGFR的重组多克隆抗体。
119.权利要求I所述的方法，其中所述一或多种重组蛋白包含针对细菌性病原体的重组多克隆抗体。
120.权利要求I所述的方法，其中所述一或多种重组蛋白包含针对病毒性病原体的重组多克隆抗体。
121.权利要求I所述的方法，其中所述一或多种重组蛋白包含针对传染性疾病目标的重组多克隆抗体。
122.权利要求I所述的方法，其中所述一或多种重组蛋白包含一或多种重组B细胞受体。
123.权利要求I所述的方法，其中所述一或多种重组蛋白包含一或多种重组T细胞受体。
124.权利要求1-123中任一项所述方法在给样品中一或多种重组蛋白定量的用途。
125.权利要求124所述的用途，其中所述方法被用于确定血清中构成重组多克隆抗体组合物的各个抗体从个体内的清除。
126.权利要求124所述的方法，其中所述方法被用于个体的药物代谢动力学研究。
127.权利要求125或126所述的用途，其中所述个体是人。
128.权利要求125或126所述的用途，其中所述个体是啮齿动物。
129.权利要求125或126所述的用途，其中所述个体是猴。
130.权利要求124所述的用途,其中所述方法被用于表征原料药(drugsubstance)的多克隆性。
131.权利要求124所述的用途,其中所述方法被用于表征药物制剂(drugproduct)的多克隆性。
132.权利要求124所述的用途，其中所述方法被用于给过程中样品的一或多种重组抗体定量。
133.权利要求I所述的方法与重组多克隆抗体的制备有关的用途。
134.权利要求I所述的方法与在原料药生产的上游或下游制备重组多克隆抗体有关的用途。
135.权利要求I所述的方法与在药物制剂生产的上游或下游制备重组多克隆抗体有关的用途。
136.权利要求I所述的方法在挑选用于多克隆细胞库的克隆中的用途。
137.权利要求I所述的方法，其中待定量的重组蛋白的数量是两种或以上。
全文摘要
本发明涉及给复杂基质中选定的多种重组蛋白(比如血清中的重组多克隆抗体或者表达在培养物上清中的重组多克隆抗体)定量的分析方法。
文档编号G01N33/68GK102687020SQ201080056227
公开日2012年9月19日 申请日期2010年10月7日 优先权日2009年10月9日
发明者H.内斯泰德, J.W.森, P.F.詹森, T.弗兰德森 申请人:西福根有限公司