制备肽缀合物和连接基的改进方法
【专利摘要】本发明提供制备式5b的化合物及其中间体的方法，以及可用于制备这些和类似化合物的方法的新型化合物。
【专利说明】制备肽缀合物和连接基的改进方法
[0001] 本发明涉及可用于制备特定抗体-连接基-肽缀合物的新方法、化合物和中间体。
[0002] 背景
[0003] 可利用生物化学分子的共价缀合使两个或者更多个分子联合以形成表现各单独 组分的组合性质的生物缀合物。已将该技术用于增加治疗剂（诸如肽）的血浆半衰期并降 低其免疫原性。通常，将治疗剂直接或者通过连接基缀合到大分子载体上。常见的大分子 载体包括抗体、白蛋白和合成聚合物。
[0004] US7521425和US8288349记载了制备可用作连接基的化合物的方法。
[0005] 不将且不应将本说明书中对任何技术的提及视为任何形式地承认或暗示所提及 的技术形成公知常识的一部分。
[0006] 缀合方法的背景
[0007] 已在US8288349(其内容在此全部援引加入）中记载抗体-药物缀合物5,它的制 备包括数个阶段。首先，单独制备肽2和连接基1。然后将肽2缀合至连接基1以形成连接 基-肽复合物（3)。纯化，然后将缀合的连接基-肽复合物3和抗体（4)结合以使3的氮杂 环丁酮基团与抗体4形成共价键，从而得到组装的肽-连接基-抗体复合物（抗体-药物 缀合物5)(路线I)。通过冗长的多步方法（需要生成连接基1、8并将其缀合至肽2)来制 备连接基肽复合物（路线II)。
【权利要求】
1.制备式5a的化合物的方法
其包括 ⑴将9a和11 一起在1-丙基磷酸酐（T3P)的存在下反应，以生成化合物13a
(ii)在至少约50% THF的THF:H20溶液中将化合物13a用Pd/C催化氢化，以制备式 14a的化合物
(v)将20a与溶解于非质子极性第15溶剂中的包含ε -氨基的肽2合并，以制备化合 物3a
(Vi)将化合物3a在DMSO中溶解； (vii) 将pH为约5. 5至约7. 5的组氨酸缓冲液加入至步骤（vi)的DMS0和3a的溶液 中； (viii) 将包含含有SEQ ID N0:5的轻链可变区和含有SEQ ID N0:6的重链可变区的抗 体加入至步骤（vii)的溶液中，以使肽：抗体的摩尔比率为约1. 8:1至约3:1 ; (ix) 在约pH 5. 5至约pH 7. 5以及约5°C至35°C的温度下，以中等速度搅拌步骤 (viii)中所形成的混合物，以避免反应混合物起泡，持续至少约1小时； (X)过滤（ix)中的溶液，以提取所得的肽-连接基抗体缀合物5a， 其中 q = 1、2、3、4 或 5，X = F 或 C1，并且 m = 3、4 或 5。
2.制备式3a的化合物的方法
其包括 ⑴将9a和11 一起在1-丙基磷酸酐（T3P)的存在下反应，以生成化合物13a
(ii) 在至少约50% THF的THF:H20溶液中将化合物13a用Pd/C催化氢化，以制备式 14a的化合物
(iii) 在基本上无碱的反应中，将14a在THF中的溶液与式15的化合物合并，以制备化 合物6a
(iv) 在DCC的存在下，将式6a的化合物与式19a的化合物在THF中反应，以制备化合 物20a
(v) 将20a与溶解于非质子极性第15溶剂中的包含ε-氨基的肽2合并，以制备生物 缀合物3b
其中 q = 1、2、3、4 或 5，X = F 或 C1，并且 m = 3、4 或 5。
3. 制备式13a的化合物的方法
其中q为1、2、3、4或5,其特征在于将
一起在1-丙基磷酸酐（T3P)的存在下反应。
4. 权利要求1-3中任一项的方法，其中9a和11之间的反应在选自下列的第1溶剂的 存在下进行：四氢呋喃（THF)、2-甲基四氢呋喃、1-甲基-2-吡咯烷酮（NMP)、N，N-二甲基 甲酰胺（DMF)、N，N-二甲基乙酰胺（DMAc)、l-甲基-2-吡咯烷酮、乙酸乙酯（EtOAc)和乙腈 (MeCN)，并且优选MeCN。
5. 权利要求4的方法，其中所述反应在选自下列的第1碱的存在下进行：三甲胺、三乙 胺、三丁胺、DIPEA、吡啶、DBU、DABC0、2, 3-二甲基吡啶、2, 4-二甲基吡啶、2, 5-二甲基吡啶、 2, 6-二甲基吡啶、3, 4-二甲基吡啶、3, 5-二甲基吡啶，并且优选DIPEA。
6. 制备式14a的化合物的方法，
其中q为1、2、3、4或5,其包括将化合物13a用Pd/C催化氢化，
并且其特征在于所述反应在至少约50% THF的THF:H20溶液中进行。
7. 权利要求1、2或6中任一项的方法，其中所述THF:H20溶液包含选自下列量的THF : 至少约60%、至少约70%、至少约80%和至少约90%。
8. 权利要求1、2、6或7中任一项的方法，其中在于THF/H20中氢化之前，将化合物13a 用活性炭处理。
9. 权利要求8的方法，其中所述活性炭选自SX-Plus、Darc〇㊣S-51HF、E Supra USP、 SX-Ultra、CASP、Darco? G-60 和 CGSP。
10. 制备式6a的化合物的方法
其中q = 1、2、3、4或5 ;其包括将化合物14a
在包含THF的第6溶剂中的溶液 与化合物15
反应 并且其特征在于所述反应在基本上无碱下进行。
11. 权利要求1、2或10中任一项的方法，其中将化合物14a与约1当量至约10当量的 化合物15反应。
12. 权利要求1、2、10或11中任一项的方法，其中将化合物6a的溶液在真空下蒸馏， 然后加入含有(^-(；烷基乙酸酯的第7溶剂，以获得约25% THF/75% (^-(；烷基乙酸酯至约 100% Ci-C；烷基乙酸酯的溶剂组合物。
13. 权利要求12的方法，其中所述第7溶剂选自乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、乙酸 正丙酯、乙酸正丁酯，并且优选乙酸异丙酯。
14. 权利要求12或13的方法，其中第6溶剂和第7溶剂之间的比率为25:75至0:100。
15. 式6a的化合物结晶的方法，其包括： (i) 将酸6a在包含THF的第8溶剂中溶解； (ii) 任选地用活性炭处理，然后将所述活性炭滤出； (iii) 将酸6a在THF中的溶液浓缩到约2体积至约20体积； (iv) 加入约1体积至约50体积的由2-丙醇组成的第9溶剂； (v) 将酸6a在THF和2-丙醇中的溶液浓缩到约2体积至约50体积； (vi) 将酸6的浓缩溶液冷却到约-25°C至约10°C。
16. 制备式20b的化合物的方法，其包括在DCC的存在下，将式6b的化合物与式19a的 化合物在第10溶剂中反应
其中 q = 1、2、3、4 或 5, η = 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30, X = F 或 C1，并且 m = 3、4 或 5。
17. 将包含ε -氨基的肽2缀合至式6b的连接基的方法，其包括： (i) 将肽2在非质子极性第15溶剂中溶解， (ii) 将6b与约1当量至约10当量的19a在THF中反应，以制备化合物20b ; (iii) 将20b与肽2合并，以制备生物缀合物3b
其中 η = 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、 25、26、27、28、29 或 30, q = 1、2、3、4 或 5，X = F 或 C1，并且 m = 3、4 或 5。
18. 权利要求1、2、16或17中任一项的方法，其中将至少约1当量的化合物19a加入至 化合物6a或6b。
19. 权利要求1、2、16、17或18中任一项的方法，其中将所述DCC在-10°C至+10°C，并 且优选在约+3°C至+5°C的温度下加入至反应物中。
20. 权利要求1、2、16、17、18或19中任一项的方法，其中化合物19a与6a或6b的反 应在选自下列的第10溶剂中进行：THF、二氯甲烷、2-甲基四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺和 N，N-二甲基乙酰胺，并且优选THF。
21. 权利要求1、2和16-20中任一项的方法，其中X为F，并且m为5。
22. 将式3b的肽缀合至抗体的方法，其包括以下步骤： (i) 将化合物3b在DMSO中溶解：
(ii) 将pH为约5. 5至约7. 5的组氨酸缓冲液加入至步骤（i)的DMSO和3b的溶液中； (iii) 将包含含有SEQ ID NO:5的轻链可变区与含有SEQ ID NO:6的重链可变区的抗 体加入至步骤（ii)的溶液中，其中所述抗体在包含约2% (w/w)鹿糖的约10mM组氨酸和约 10mM甘氨酸的缓冲溶液中，以使肽：抗体的摩尔比率为约1. 8:1至约3:1 ; (iv) 在约pH 5. 5至约pH 7. 5以及约5°C至35°C的温度下，以中等速度搅拌步骤（vi) 中所形成的混合物，以避免反应混合物起泡，持续至少约1小时； (v) 过滤（iv)中的溶液，以提取所得的肽-连接基抗体缀合物5b，
其中 η = 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、 25、26、27、28、29 或 30, q = 1、2、3、4 或 5。
23. 权利要求1或22中任一项的方法，其中将化合物3a或化合物3b以约5mg/ml至约 100mg/ml，并且优选约10mg/ml至约15mg/ml在DMSO中溶解。
24. 权利要求1、22或23中任一项的方法，其中将所述组氨酸缓冲液以等体积±10% 加入至化合物3a或3b的DMS0溶液中。
25. 权利要求1、22-24中任一项的方法，其中加入所述组氨酸缓冲液后的化合物3a或 化合物3b的浓度为约2mg/ml至约10mg/ml，并且优选约6mg/ml。
26. 权利要求1或22-25中任一项的方法，其中所述抗体包含含有选自SEQ ID N0:9、 10、11和12的序列或者其含有1至5个氨基酸置换、缺失或插入的变体的轻链恒定区，和含 有选自SEQ ID NO: 13和14的序列或者其含有1至5个氨基酸置换、缺失或插入的变体的 重链恒定区。
27. 权利要求26的方法，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:3或者其含有1至5个氨 基酸置换、缺失或插入的变体的轻链，和含有SEQ ID N0:4或者其含有1至5个氨基酸置换、 缺失或插入的变体的重链。
28. 之前权利要求中任一项的方法，其中q = 2,当η存在时其=1，当m存在时其=5， 并且当X存在时其=F。
29. 化合物，其根据权利要求1-28中任一项的方法制备。
30. 权利要求1-28中任一项的方法在制备选自下列的化合物中的用途：化合物13、化 合物13a、化合物14、化合物14a、化合物6、化合物6a、化合物6b、化合物20、化合物20a、化 合物20b、化合物20c、化合物20d、化合物20e、化合物3、化合物3a、化合物3b、化合物5、化 合物5a和化合物5b。
31. 化合物，其包括选自下列的结构：
其中 q 为 1、2、3、4 或 5, η = 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30,并且 X 为任意的卤素，并且 m = 3、4 或 5。
【文档编号】C07D205/08GK104125838SQ201280070075
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2012年12月10日 优先权日:2011年12月20日
【发明者】J·马加诺, M·T·玛洛尼, O·J·马克, D·V·纳德卡尔尼, M·J·波佐, J·J·小泰克赛拉 申请人:辉瑞公司