絮凝方法

絮凝方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于从哺乳动物细胞培养流体中收获重组蛋白的方法。所述方法利用阳离子型聚合物、非离子型聚合物以及非离子型表面活性剂。
【专利说明】絮凝方法
[0001] 本申请要求2011年12月15日提交的美国临时申请号61/576, 303的权益，该美 国临时申请以引用的方式并入本文。 发明领域
[0002] 本发明涉及一种用于从哺乳动物细胞培养肉汤中收获重组蛋白的方法。所述方法 利用阳离子型聚合物、非离子型聚合物以及非离子型表面活性剂。
[0003] 发明背景
[0004] 临床制造治疗性蛋白质是一项成本高的大规模的尝试。对更大量的治疗性重组蛋 白的需求已驱使在产生显著提高的产物滴度的细胞培养物处理方面取得了长足的进展。高 滴度细胞培养过程典型地是通过在更长的培养持续时间内维持高的活细胞密度而产生的。 同样还会观测到生物质固体（活细胞和非活细胞）以及亚微米细胞碎片颗粒相应增多。固 体和亚微米细胞碎片颗粒的更高负荷可能对哺乳动物细胞培养物收获方法提出挑战，会使 得收获方法在不使产物产量大幅损失的情况下去除碎片方面的有效性较低。
[0005] 阳离子型聚合物絮凝剂被用于以下范围内的多种应用：饮用水纯化、废水处理、在 石油、采矿以及造纸行业中使用、化妆品和医疗用途，并且还已经被用于封装哺乳动物细胞 和酶以及用于使微生物细胞培养物絮凝。然而，对于在商业规模的哺乳动物细胞收获方法 中使用来说，漫长的絮凝沉降时间可能成问题，会使得收获方法耗时并且与标准收获操作 规程相比效率更低。
[0006] 持续需要对哺乳动物细胞培养物收获方法，特别是商业规模的方法进行改进。任 何使得回收时间更快和/或回收率更大的改进都可以使得与制造蛋白质治疗剂相关的成 本降低。本发明通过提供一种快速并且高效的细胞培养物收获方法来满足这一需要。
[0007] 发明概述
[0008] 本发明提供了一种哺乳动物细胞培养物收获方法，所述方法包括将表达重组蛋白 的哺乳动物细胞在细胞培养基中培养预定的时间或直到达到所需的细胞密度和/或细胞 压积为止，将阳离子型聚合物和非离子型聚合物添加至细胞培养基中以引发絮凝，在絮凝 期间混合细胞培养基，使得絮凝体沉降，以及回收澄清了的上清液。
[0009] 本发明还提供了一种哺乳动物细胞培养物收获方法，所述方法包括将表达重组蛋 白的哺乳动物细胞在细胞培养基中培养预定的时间或直到达到所需的细胞密度和/或细 胞压积为止，将聚二烯丙基二甲基氯化铵和PEG 3, 000添加至细胞培养基中以引发絮凝， 在絮凝期间混合细胞培养基，使得絮凝体沉降，以及回收澄清了的上清液。
[0010] 本发明还提供了一种哺乳动物细胞培养物收获方法，所述方法包括
[0011] 将表达重组蛋白的哺乳动物细胞在细胞培养基中培养预定的时间或直到达到所 需的细胞密度和/或细胞压积为止，将聚二烯丙基二甲基氯化铵、PEG 3, 000以及Triton X-100(曲通X-100)添加至细胞培养基中以引发絮凝，在絮凝期间混合细胞培养基，使得絮 凝体沉降，以及回收澄清了的上清液。
[0012] 本发明还提供了一种哺乳动物细胞培养物收获方法，所述方法包括
[0013] 将表达重组蛋白的哺乳动物细胞在细胞培养基中培养预定的时间或直到达到所 需的细胞密度和/或细胞压积为止，将阳离子型聚合物和非离子型聚合物添加至细胞培养 基中以引发絮凝，在絮凝期间混合细胞培养基，使得絮凝体沉降以进行初级沉降，回收初级 澄清了的上清液，对初级沉降的絮凝体进行洗涤，使得经过洗涤的絮凝体沉降以进行二次 沉降，以及回收二次澄清了的上清液。
[0014] 本发明还提供了一种哺乳动物细胞培养物收获方法，所述方法包括
[0015] 将表达重组蛋白的哺乳动物细胞在细胞培养基中培养预定的时间或直到达到所 需的细胞密度和/或细胞压积为止，将阳离子型聚合物和非离子型聚合物添加至细胞培养 基中以引发絮凝，在絮凝期间混合细胞培养基，使得絮凝体沉降以进行初级沉降，回收初级 澄清了的上清液，如果在初级澄清了的上清液中的产物回收率小于80%，则对初级沉降的 絮凝体进行洗涤，使得经过洗涤的絮凝体沉降以进行二次沉降，以及回收二次澄清了的上 清液。
[0016] 本发明还提供了一种哺乳动物细胞培养物收获方法，所述方法包括
[0017] 将表达重组蛋白的哺乳动物细胞在细胞培养基中培养预定的时间或直到达到所 需的细胞密度和/或细胞压积为止，将聚二烯丙基二甲基氯化铵和PEG 3, 000添加至细胞 培养基中以引发絮凝，在絮凝期间混合细胞培养基，使得絮凝体沉降以进行初级沉降，回收 初级澄清了的上清液，对初级沉降的絮凝体进行洗涤，使得经过洗涤的絮凝体沉降以进行 二次沉降，以及回收二次澄清了的上清液。
[0018] 本发明还提供了一种哺乳动物细胞培养物收获方法，所述方法包括
[0019] 将表达重组蛋白的哺乳动物细胞在细胞培养基中培养预定的时间或直到达到所 需的细胞密度和/或细胞压积为止，将聚二烯丙基二甲基氯化铵、PEG 3, 000以及Triton X-100添加至细胞培养基中以引发絮凝，在絮凝期间混合细胞培养基，使得絮凝体沉降以进 行初级沉降，回收初级澄清了的上清液，对初级沉降的絮凝体进行洗涤，使得经过洗涤的絮 凝体沉降以进行二次沉降，以及回收二次澄清了的上清液。
[0020] 在一个实施方案中，阳离子型聚合物是聚二烯丙基二甲基氯化铵。
[0021] 在另一个实施方案中，非离子型聚合物选自聚乙二醇和葡聚糖。
[0022] 在另一个实施方案中，非离子型聚合物选自PEG 3, 000和PEG 6, 000。
[0023] 在另一个实施方案中，上文提供的哺乳动物细胞培养物收获方法进一步包括将非 离子型表面活性剂添加至细胞培养基中。在一个相关的实施方案中，所述非离子型表面活 性剂是 Triton X-100。
[0024] 在另一个实施方案中，同时添加阳离子型聚合物和非离子型聚合物。
[0025] 在另一个实施方案中，同时添加阳离子型聚合物、非离子型聚合物以及非离子型 表面活性剂。
[0026] 在另一个实施方案中，首先添加阳离子型聚合物并且混合至少30秒，继而添加非 离子型聚合物。
[0027] 在另一个实施方案中，首先添加阳离子型聚合物并且混合至少30秒，继而添加非 离子型聚合物和非离子型表面活性剂。
[0028] 在另一个实施方案中，阳离子型聚合物是二烯丙基二甲基氯化铵的聚合物、聚二 烯丙基二甲基氯化铵、聚乙烯亚胺、聚丙烯酰胺或壳聚糖。
[0029] 在另一个实施方案中，非离子型表面活性剂是Sapoin或Triton X100。
[0030] 在另一个实施方案中，以等于或约20皮克/总细胞密度至等于或约90皮克/总 细胞密度的浓度添加聚二烯丙基二甲基氯化铵。
[0031] 在另一个实施方案中，以等于或约25皮克/总细胞密度的浓度添加聚二烯丙基二 甲基氯化铵，其中所述哺乳动物细胞来源于二倍体细胞系。
[0032] 在另一个实施方案中，添加介于43皮克/总细胞密度与57皮克/总细胞密度之 间的聚二烯丙基二甲基氯化铵，其中所述哺乳动物细胞来源于四倍体细胞系。
[0033] 在另一个实施方案中，PEG 3, 000的浓度是等于或约3%至等于或约4. 5%。
[0034] 在另一个实施方案中，PEG 6, 000的浓度是等于或约2. 5%至等于或约3. 5%。
[0035] 在另一个实施方案中，Triton X100的浓度是0· 05% (w/v)。
[0036] 在另一个实施方案中，哺乳动物细胞培养肉汤在36°C与20°C之间。
[0037] 在另一个实施方案中，哺乳动物细胞培养肉汤处于或高于20°C。
[0038] 在另一个实施方案中，在9%蔗糖溶液中对来自初级沉降的絮凝体进行洗涤。
[0039] 附图简述
[0040] 图1提供了 PDADMAC的结构。
[0041] 图2A示出了由具有不同分子量的PDADMAC所实现的沉降时间的差异。具有 每一种分子量的PDADMAC的浓度均是57皮克/总细胞密度。实心的菱形/虚线表示 100, 000-200, 000的PDADMAC分子量。实心的正方形和虚线表示200, 000-300, 000的 PDADMAC分子量。实心的三角形和实线表示400, 000-500, 000的PDADMAC分子量。
[0042] 图2B示出了当使用具有不同的分子量的PDADMAC使细胞培养肉汤絮凝时所 实现的上清液澄明度。从左至右，各柱形图表示以下的PDADMAC分子量：〈100, 000 ; 100, 000-200, 000 ;200, 000-350, 000 ;以及 400, 000-500, 000。
[0043] 图3A示出了高分子量PDADMAC的浓度对15-20 μ m细胞的絮凝的影响。实心的菱 形/虚线表示11皮克/总细胞密度的PDADMAC。实心的正方形和虚线表示18皮克/总细 胞密度的PDADMAC。实心的三角形和实线表示25皮克/总细胞密度的PDADMAC。实心的圆 形和虚线表示39皮克/总细胞密度的PDADMAC。
[0044] 图3B示出了高分子量PDADMAC的浓度对21-24 μ m细胞的絮凝的影响。实心的菱 形/虚线表示29皮克/总细胞密度的PDADMAC。实心的正方形和虚线表示43皮克/总细 胞密度的PDADMAC。实心的三角形和虚线表示57皮克/总细胞密度的PDADMAC。实心的圆 形和实线表示71皮克/总细胞密度的PDADMAC。实心的正方形和点线表示86皮克/总细 胞密度的H)ADMAC。
[0045] 图4A示出了高分子量PDADMAC絮凝作用对产生高乳酸盐水平的细胞培养物的影 响。实心菱形和实线表示未添加乳酸盐。实心的正方形和虚线表示換入有3g/L的乳酸盐。 实心的三角形和虚线表示換入有6g/L的乳酸盐。实心的圆形和虚线表示換入有9g/L的乳 酸盐。
[0046] 图4B示出了高分子量PDADMAC絮凝作用对具有如通过细胞压积（PCV)所测量的 高细胞密度的细胞培养物的影响。实心的菱形和虚线表示44%的PCV。实心的三角形和虚 线表示33%的PCV。实心的正方形和虚线表示22%的PCV。实心的圆形和实线表示11 %的 PCV。
[0047] 图5示出了各种稀释剂对于用于具有高乳酸盐水平的细胞培养过程的高分子量 PDADMAC絮凝作用的影响。实心的三角形和虚线表示蔗糖。实心的正方形和虚线表示不含 稀释剂的细胞培养基。实心的菱形和虚线表示甜菜碱。实心的圆形和虚线表示PEG 1，000。 实心的三角形和实线表示PEG 6, 000。实心的三角形和虚线表示葡聚糖70和甜菜碱。
[0048] 图6示出了 PDADMAC/PEG絮凝作用对具有43. 2%的PCV的细胞培养物的影响。实 心的菱形和虚线表示单独PDADMAC。实心的正方形和虚线表示蔗糖。实心的三角形和实线 表示 PDADMAC/PEG。
[0049] 图7示出了 PDADMAC和PEG的添加顺序的影响。一次性（bolus)添加 PDADMAC和 PEG (单步法）由实心三角形和虚线示出。先添加 PDADMAC，继而添加 PEG (两步法）由实心 正方形和虚线示出。单独PDADMAC由实心的菱形和实线示出。
[0050] 图8示出了添加 Triton X-100的影响。添加 PDADMAC/PEG由实心的正方形和实 线示出。添加 PDADMAC/PEG/Trition X-100由实心的三角形和虚线示出。
[0051] 发明详述
[0052] 本发明提供了一种简单的收获絮凝技术，所述技术旨在使得高细胞量的细胞培养 过程的回收操作达到最大限度。提供了一种哺乳动物细胞培养物收获方法，所述方法在使 细胞培养肉汤絮凝时将阳离子型聚合物与非离子型聚合物组合使用。还提供了将阳离子型 聚合物与非离子型聚合物和非离子型表面活性剂这两者组合使用。
[0053] 本发明是基于以下的发现：将非离子型聚合物或非离子型聚合物和非离子型表面 活性剂与阳离子型聚合物组合用于使哺乳动物细胞培养肉汤絮凝会使得絮凝体沉降时间 从24小时或更长时间缩短至不到1小时，在一些情况下，缩短至15分钟，而与细胞培养过 程的密度（高达44%的细胞压积）或乳酸盐水平（10g/L)无关。使用非离子型聚合物还能 够将与所需的重组产物共同纯化的高级聚集体和宿主细胞蛋白去除。这种简单的收获方法 使得细胞培养过程，特别是高细胞量的细胞培养商业水平过程的回收操作达到最大限度。
[0054] 絮凝是使悬浮液中的颗粒形成更大尺寸的聚集体或簇集体的过程。在絮凝中，通 过添加絮凝剂（flocculation agent/flocculent)使颗粒以絮状物形式从悬浮液中离开。 絮凝剂可以是阴离子型聚合物或阳离子型聚合物。存在天然絮凝剂，如藻酸盐或壳聚糖；矿 物絮凝剂，如胶态粘土和活性二氧化硅；以及合成絮凝剂，如聚丙烯酰胺和聚二烯丙基二甲 基氯化铵。合成絮凝剂可以被制造成具有特定的分子量（基于链长）和分子分布。
[0055] 阳离子型聚合物与诸如有机物质之类的带负电荷的颗粒相互作用。在细胞培养 肉汤中，阳离子型聚合物与诸如活细胞和非活细胞、细胞代谢物以及细胞碎片（如核酸、 蛋白以及脂质体）之类的带负电荷的颗粒相互作用。使用阳离子型聚合物使细胞培养肉 汤中存在的带负电荷的化合物絮凝是经由以下方式发生离子相互作用而进行的：带负电 荷的颗粒的架桥；阳离子型聚合物的补缀结合（patch binding)，从而引起絮凝；或对较 大的带负电荷的颗粒的电荷中和，从而使得所中和的颗粒从溶液中沉降出。通过阳离子 型聚合物对带负电荷的颗粒的架桥作用所形成的絮状物产生更大的絮状物并且具有增加 的剪切敏感性，从而引起絮状物破坏，进而产生更高水平的更缓慢沉降的更小颗粒。在补 缀或电荷中和的情况下，具有高电荷密度的阳离子型聚合物与悬浮液中的颗粒上的阴离 子补缀物相互作用，并且中和颗粒上的电荷或形成更大颗粒而从溶液中沉降出。以这种 方式形成的絮状物具有更小的絮状物颗粒体积并且更不易于由于剪切而被破坏。举例 来说，将聚二烯丙基二甲基氯化铵（PDADMAC)添加至细胞培养肉汤中会经由静电补缀机 制使带负电荷的细胞和细胞碎片絮凝成更大的颗粒（Ramsden等（1998)，Biotechnology Techniques, 12(8) :599-603) oPDADMAC还使带负电荷的亚微米颗粒絮凝以产生与典型的以 离心方式收获的进料流相比具有显著更高的收获过滤器组通量的进料流。经由离子相互作 用所实现的絮凝作用可以通过提高盐浓度或改变pH值而被破坏。
[0056] 将诸如聚二烯丙基二甲基氯化铵之类的阳离子型聚合物添加至含有或已经含有 表达重组蛋白的细胞的哺乳动物细胞培养基中会使得包括细胞（活细胞和非活细胞）、细 胞代谢物以及细胞碎片在内的带负电荷的颗粒絮凝。可以通过离心或通过重力沉降将这些 大的絮凝颗粒去除。絮凝的细胞和细胞碎片沉降出所需的沉降速率或时间取决于细胞、细 胞碎片以及细胞代谢物的密度。在对于分批式细胞培养过程典型的低细胞密度下，絮凝的 物质典型地在4小时至24小时，典型地约20-24小时内的某个时间点沉降出（无进一步 沉降）。沉降速率在产生高生物质细胞密度（>10%的细胞压积）、亚微米细胞碎片和/或 高乳酸盐水平（>2_3g/L)的细胞培养过程的情况下显著降低。产生高细胞密度或具有升高 的乳酸盐水平的细胞培养过程需要显著量的细胞肉汤稀释以使得絮状物在24小时内沉降 出。虽然使用诸如PDADMAC之类的阳离子型聚合物作为传统收获方法的替代方案是非常方 便的，但是长时间的沉降时间可能对于商业规模来说不太合乎需要。
[0057] 本发明提供了经过阳离子型聚合物絮凝的物质的絮凝颗粒尺寸以及颗粒尺寸 的增长率在非离子型聚合物和非离子型表面活性剂的存在下会得到极大地提高。在将 PDADMAC与非离子型聚合物（如聚乙二醇）和非离子型表面活性剂（如Triton X100)组合 使用时，通常观测到少于2小时的絮状物重力沉降时间，尽管高生物质/细胞密度会显著地 延长单独PDADMAC絮凝的沉降时间。在添加非离子型聚合物和非离子型表面活性剂的情况 下能够耐受可能破坏絮状物和/或降低絮凝速率的剪切力。在使得宿主DNA显著减少的情 况下始终如一地实现80% -90%或更大的收获物回收产率。添加非离子型聚合物还会减少 宿主细胞蛋白质和一些高分子量物质。
[0058] 如本文所用的"阳离子型聚合物"是与带负电荷的悬浮颗粒结合的带正电荷的聚 合物。阳离子型聚合物包括但不限于二烯丙基二甲基氯化铵（DADMAC)的聚合物。在一个 优选的实施方案中，使DADMAC聚合形成N-取代的吡咯烷结构，S卩PDADMAC(图1)。阳离子 型聚合物还包括聚乙烯亚胺（PEI)、聚丙烯酰胺（PAA)以及壳聚糖。
[0059] 等于或约20皮克至等于或约90皮克的PDADMAC/总细胞密度的浓度会产生低的 上清液浊度和良好的絮状物沉降作用。"总细胞密度"是如通过台盼蓝拒染（Trypan Blue exclusion)，使用Cedex细胞计数器和分析器所测量的活细胞加上非活细胞的总数。在用 于小细胞系（如二倍体细胞系）的一个实施方案中，添加等于或约25皮克/总细胞密度的 PDADMAC。在另一个实施方案中，对于更大的细胞系，如四倍体细胞系，添加等于或约43皮 克/总细胞密度至等于或约57皮克/总细胞密度的PDADMAC。
[0060] 与更低分子量形式相比，分子量为200, 000-500, 000的PDADMAC通过提高沉降速 率和上清液澄明度来影响絮凝性能。在一个实施方案中，PDADMAC的分子量在400, 000至 500, 000的范围内。在一个实施方案中，以22皮克/总细胞密度的最终浓度使用具有在 400, 000-500, 000范围内的分子量的PDADMAC。在另一个实施方案中，以25皮克/总细胞 密度的最终浓度使用具有在400, 000-500, 000范围内的分子量的PDADMAC。在另一个实施 方案中，以45皮克/总细胞密度的最终浓度使用具有在400, 000-500, 000范围内的分子量 的 roADMAC。
[0061] 如本文所用的"沉降速率"、"重力沉降速率"以及"絮凝并且压紧的沉降速率"可 互换使用。沉降速率可以通过本领域已知的以及本文所述的方法来测定。举例来说，在lg 下进行重力沉降。通过将絮状物体积除以在0. 5L或1L玻璃量筒中所测量的总体积来确定 沉降速率。总体积是包括所有絮凝剂/沉降剂在内的细胞肉汤体积。
[0062] "沉降时间"是絮状物沉降所要花费的时间。在絮状物的沉降速率小于或等于每小 时1 %时实现沉降时间。本文描述了在将PDADMAC絮凝与给予非离子型聚合物或非离子型 聚合物连同非离子型表面活性剂组合的情况下沉降时间短达15分钟。沉降时间快速，尽管 高生物质/细胞密度会显著地延长单独PDADMAC絮凝的沉降时间。在添加非离子型聚合物 或非离子型表面活性剂的情况下能够耐受会破坏絮状物和/或降低絮凝速率的剪切力。 [0063] 上清液澄明度与沉降速率无关，但是取决于阳离子型聚合物的给予水平。诸如温 度、细胞培养流体密度以及粘度之类的其它因素对沉降速率或上清液澄明度的影响非常 小。PDADMAC的给予量尤其是随细胞体积、总细胞（活细胞和非活细胞）密度以及亚微米细 胞碎片颗粒的浓度而变的。
[0064] 如本文所用的"非离子型聚合物"指的是增强分子之间的相互作用，从而增强沉淀 作用的亲水性聚合物。非离子型聚合物包括但不限于聚乙二醇（PEG)、麦芽糖糊精、淀粉、甲 基纤维素以及葡聚糖。
[0065] 在添加阳离子型聚合物絮凝剂同时或之后将PEG或葡聚糖添加至哺乳动物细胞 培养基中时会使得沉降速率有所提高。产物回收率取决于非离子型聚合物浓度、PEG分子 量、非离子型聚合物和PDADMAC的添加顺序（同时添加或首先添加 PDADMAC，继而添加非离 子型聚合物）以及细胞培养持续时间或细胞培养肉汤中的碎片水平。
[0066] 可使用在等于或约3 %至等于或约4. 5 % (w/v)范围内的PEG 3, 000。可使用在等 于或约2. 5%至等于或约3.5% (w/v)范围内的PEG 6, 000。在一个实施方案中，以3% (w/ v)的最终浓度使用PEG 3, 000。在另一个实施方案中，以15% (w/v)的最终浓度使用PEG 3, 000。在另一个实施方案中，以25% (w/v)的最终浓度使用PEG 3, 000。
[0067] 如本文所用的"非离子型表面活性剂"指的是具有两亲性的有机化合物，意指它们 含有疏水性基团和亲水性基团，并且包括但不限于Sapoin和Triton X100。在一个实施方 案中，以0· 05% (w/v)的最终浓度使用Triton X-100。
[0068] 可以单独添加或与非离子型表面活性剂组合添加非离子型聚合物。任一者均可以 与阳离子型聚合物同时或在添加阳离子型聚合物之后添加。非离子型聚合物和非离子型表 面活性剂两者均可以在1分钟或更短的添加时间内快速添加。
[0069] 在絮凝体沉降（初级沉降）后，可以收获澄清了的上清液。为了提高重组产物回 收率，可以将絮状物洗涤或重悬以便移去任何残留的重组产物。合适的洗涤稀释剂包括蔗 糖、PEG、细胞培养基以及缓冲盐水溶液。在一个实施方案中，洗涤稀释剂是9%的蔗糖。将 絮状物与洗涤稀释剂混合〈1分钟至60分钟并且允许沉降约1小时至24小时。在絮状物 沉降（二次沉降）后，可以收获二次澄清了的上清液。可以将来自初级沉降的上清液与来 自二次沉降的上清液合并或单独地纯化。
[0070] 可以通过抽吸或倾析取出上清液，继而经由容纳硅藻土的深度过滤器，继而0. 2 μ 截留膜式过滤器过滤，或仅经由0. 2 μ截留过滤器过滤来收获澄清了的上清液。
[0071] 阳离子型聚合物清除率可以通过本领域已知的方法，如用于监测哺乳动物细胞毒 性的测定法；用于测定对通过DNA聚合酶或逆转录进行的DNA或RNA转录的抑制作用的测 定法；以及测定mRNA的蛋白质翻译的测定法；以及本文所述的方法来监测。举例来说，重组 蛋白纯化过程中间体的PDADMAC清除率可以通过在使用定量聚合酶链式反应（QPCR)中对 DNA扩增的抑制作用来监测。
[0072] 可以直接使用来自生物反应器的细胞培养肉汤或可以在絮凝之前将它冷却。在一 个优选的实施方案中，细胞培养肉汤的温度范围是等于或约36°C至等于或约20°C。在另一 个实施方案中，将细胞培养肉汤冷却至20°C或冷却至约20°C。
[0073] 本发明提供了一种从哺乳动物细胞培养物中收获重组蛋白的方法。用于通过哺 乳动物细胞培养物产生重组蛋白的商业过程中所使用的典型方法包括分批式培养法、分批 补料培养法以及灌注培养法。分批式培养法是一种不连续的方法，其中将细胞在固定体积 的培养基中培养较短的一段时间，然后完全收获。典型地在达到最高细胞密度（典型地是 5-10X10 6个细胞/毫升）时进行收获。分批补料培养法提供了一次性或连续的培养基进 料以便补充已经被消耗的那些培养基组分。由于分批补料培养物在整个操作期间接受额外 的营养素，所以在与分批法相比时，它们有可能达到更高的细胞密度（>1〇至30X 106个细 胞/毫升）以及增加的产物滴度。在灌注法的情况下，典型的大规模商业细胞培养策略力 图达到高细胞密度，即60-90 (+) X 106个细胞/毫升，其中反应器容积的差不多五十到超过 一半是生物质。在灌注培养的情况下，已经达到了 >1X 1〇8个细胞/毫升的极限细胞密度 并且预期达到甚至更高的密度。
[0074] 如本文所用的"肽"、"多肽"以及"蛋白质"在全篇中可互换使用并且指的是包含 两个或更多个彼此通过肽键连接的氨基酸残基的分子。肽、多肽以及蛋白质还包括修饰在 内，所述修饰包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸化、谷氨酸残基的Y -羧化、羟基化以及 ADP-核糖基化。多肽可以具有科学或商业价值，包括基于蛋白质的药物在内。多肽尤其包 括抗体、融合蛋白以及细胞因子。肽、多肽以及蛋白质是使用细胞培养方法通过重组动物细 胞系产生的并且可以被称为"重组肽"、"重组多肽"以及"重组蛋白"。一种或多种所表达的 蛋白质可以在细胞内产生或被分泌到培养基中，可以从所述培养基中回收和/或收集所述 蛋白质。
[0075] 可以使用本发明的方法收获的多肽的实例包括包含与以下蛋白质中的一种的全 部或一部分相同或基本上相似的氨基酸序列的蛋白质：肿瘤坏死因子（TNF)、flt3配体（W0 94/28391)、促红细胞生成素、促血小板生成素、降|丐素、IL-2、血管生成素-2 (Maisonpierre 等（1997)，Science 277 (5322) : 55-60)、NF- κ B 的受体活化因子的配体（RANKL，TO 01/36637)、肿瘤坏死因子（TNF)相关细胞凋亡诱导配体（TRAIL，W0 97/01633)、胸腺基质 源性淋巴细胞生成素、粒细胞集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF，澳 大利亚专利No. 588819)、肥大细胞生长因子、干细胞生长因子（美国专利No. 6, 204, 363)、 表皮生长因子、角化细胞生长因子、巨核细胞生长和发育因子、RANTES、人纤维蛋白原样2 蛋白（FGL2 ;NCBI 登录号 NM_00682 :RUegg 和 Pvtela (1995), Gene 160:257-62)、生长激素、 胰岛素、胰岛素调理素（insulinotropin)、胰岛素样生长因子、甲状旁腺激素、包括α-干 扰素 、Υ -干扰素以及复合干扰素（美国专利No. 4, 695, 623和4, 897471)在内的干扰素、神 经生长因子、脑源性神经营养因子、突触结合蛋白样蛋白（SLP 1-5)、神经营养素-3、胰高 血糖素、白细胞介素、集落刺激因子、淋巴细胞毒素-β、白血病抑制因子以及制瘤素-M。对 于可以根据本发明的方法产生的蛋白质的描述可以见于例如Human Cytokines:Handbook for Basic and Clinical Research,所有卷（Aggarwal 和 Gutterman 编著，Blackwell Sciences, Cambridge, MA, 1998) ：Growth Factors:A Practical Approach(McKay 和 Leigh 编著，Oxford University Press Inc.，New York, 1993):以及 The Cytokine Handbook,第 1 和 2 卷（Thompson 和 Lotze 编著，Academic Press, San Diego, CA, 2003)中。
[0076] 另外，本发明的方法可用于收获包含任何上述蛋白质的受体、所述受体或任 何上述蛋白质的拮抗剂和/或与这些受体或拮抗剂基本上相似的蛋白质的氨基酸序 列的全部或一部分的蛋白质。这些受体和拮抗剂包括：两种形式的肿瘤坏死因子受体 (TNFR，被称为p55和p75,美国专利No. 5, 395, 760和美国专利No. 5, 610, 279)、白细胞介 素-1 (IL-1)受体（I型和II型；欧洲专利No. 0460846、美国专利No. 4, 968, 607、以及美国 专利No. 5, 767, 064)、IL-1受体拮抗剂（美国专利No. 6, 337, 072)、IL-1拮抗剂或抑制剂 (美国专利 No. 5, 981，713、6, 096, 728 以及 5, 075, 222)、IL-2 受体、IL-4 受体（欧洲专利 No. 0367566 以及美国专利 No. 5, 856, 296)、IL-15 受体、IL-17 受体、IL-18 受体、Fc 受体、 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体、粒细胞集落刺激因子受体、制瘤素-M受体和白血病 抑制因子受体、NF-κ B的受体活化因子（RANK，W0 01/36637和美国专利No. 6, 271，349)、骨 保护素（美国专利No. 6, 015, 938)、TRAIL受体（包括TRAIL受体1、2、3以及4)、以及包含 死亡结构域的受体，如Fas或细胞凋亡诱导受体（AIR)。
[0077] 可以使用本发明收获的其它蛋白质包括包含分化抗原（被称为CD蛋白）或它们 的配体或与这些物质中的任一种基本上相似的蛋白质的氨基酸序列的全部或一部分的蛋 白质° 这-些抗.原公开在 Leukocyte Typing VI (Proceedings of the Vlth International Workshop and Conference，Kishimoto，Kikutani 等编著，Kobe, Japan, 1996)中。类似的 ⑶蛋白在后续的研讨会中公开。这些抗原的实例包括⑶22、⑶27、⑶30、⑶39、⑶40以及其 配体（CD27配体、CD30配体等）。多种CD抗原是TNF受体家族的成员，所述TNF受体家族 还包括41BB和0X40。所述配体通常是TNF家族的成员，41BB配体和0X40配体同样如此。
[0078] 具有酶活性的蛋白质或它们的配体也可以使用本发明来收获。实例包括包含以下 蛋白质或它们的配体或与这些物质中的一种基本上相似的蛋白质中的一种的全部或一部 分的蛋白质：去整合素和金属蛋白酶结构域家族成员（包括TNF-α转化酶）、各种激酶、葡 糖脑苷脂酶、超氧化物歧化酶、组织纤溶酶原激活物、因子VIII、因子IX、载脂蛋白E、载脂 蛋白A-Ι、球蛋白、IL-2拮抗剂、α -1抗胰蛋白酶、任何上述酶的配体，以及许多其它酶和它 们的配体。
[0079] 除非另外说明，否则术语"抗体"包括提及任何同种型或子类的糖基化和非糖基化 免疫球蛋白或其与完整抗体竞争特异性结合的抗原结合区，包括人类抗体、人源化抗体、嵌 合抗体、多特异性抗体、单克隆抗体、多克隆抗体以及其低聚物或抗原结合片段。还包括具 有抗原结合片段或抗原结合区的蛋白质，如Fab、Fab'、F(ab'） 2、Fv、双功能抗体、Fd、dAb、巨 抗体（maxibody)、单链抗体分子、互补决定区（CDR)片段、scFv、双功能抗体、三功能抗体、 四功能抗体以及含有免疫球蛋白中足以赋予目标多肽以特异性抗原结合作用的至少一部 分的多肽。术语"抗体"包括但不限于通过重组手段制备、表达、产生或分离的那些抗体，如 从经过转染以表达抗体的宿主细胞中分离的抗体。
[0080] 抗体的实例包括但不限于识别包括但不限于上述蛋白质和/或以下抗原的蛋白 质中的任一种或组合的那些抗体：⑶2、⑶3、⑶4、⑶8、⑶11a、⑶14、⑶18、⑶20、⑶22、⑶23、 CD25、CD33、CD40、CD44、CD52、CD80(B7. 1)、CD86(B7. 2)、CD147、IL-1a、IL-1β、IL-2、IL-3、 IL-7、IL-4、IL-5、IL-8、IL-10、IL-2 受体、IL-4 受体、IL-6 受体、IL-13 受体、IL-18 受体亚 单位、FGL2、PDGF-0 及其类似物（参见美国专利 No. 5, 272, 064 和 5, 149, 792)、VEGF、TGF、 TGF-β 2、TGF-β 1、EGF受体（参见美国专利No. 6, 235, 883)、VEGF受体、肝细胞生长因子、 骨保护素配体、干扰素 Y、B淋巴细胞刺激因子（BlyS，也被称为BAFF、THANK、TALL-1以及 zTNF4 ;参见 Do 和 Chen-Kiang (2002)，Cytokine Growth Factor Rev. 13 (1) : 19-25)、C5 补 体、IgE、肿瘤抗原CA125、肿瘤抗原MUC1、PEM抗原、LCG (其是所表达的与肺癌有关的基因 产物）、HER-2、HER-3、肿瘤相关糖蛋白TAG-72、SK-1抗原、在患有结肠癌和/或胰腺癌的患 者血清中以升高的水平存在的肿瘤相关表位、乳腺癌、结肠癌、鳞状细胞癌、前列腺癌、胰腺 癌、肺癌和/或肾癌细胞上和/或黑色素瘤、神经胶质瘤或成神经细胞瘤细胞、肿瘤的坏死 核心上表达的癌症相关表位或蛋白质、整合素 α 4β 7、整合素 VLA-4、B2整合素、TRAIL受体 1、2、3以及4、RANK、RANK配体、TNF-α、粘附分子VAP-1、上皮细胞粘附分子（EpCAM)、细胞间 粘附分子-3(ICAM-3)、白细胞整合素、粘附素、血小板糖蛋白gp Ilb/IIIa、心脏肌球蛋白重 链、甲状旁腺激素、rNAPc2(其是因子Vila-组织因子的抑制剂）、MHC I、癌胚抗原（CEA)、甲 胎蛋白（AFP)、肿瘤坏死因子（TNF)、CTLA-4(其是细胞毒性T淋巴细胞相关抗原）、Fc-y-1 受体、HLA-DR 10β、HLA-DR抗原、硬化蛋白、L-选择素、呼吸道合胞病毒、人类免疫缺陷病 毒（HIV)、乙型肝炎病毒（HBV)、变形链球菌（Streptococcus mutans)以及金黄色葡萄球 菌（Staphlycoccus aureus)。可以使用本发明的方法产生的已知抗体的具体实例包括但 不限于阿达木单抗（adalimumab)、贝伐单抗（bevacizumab)、英夫利昔单抗（infliximab)、 阿昔单抗（abciximab)、阿仑单抗（alemtuzumab)、巴匹珠单抗（bapineuzumab)、巴利 昔单抗（basiliximab)、贝利单抗（belimumab)、布雷奴单抗（briakinumab)、卡那单 抗（canakinumab)、赛妥珠单抗（certolizumab pegol)、西妥昔单抗（cetuximab)、可 那木单抗（conatumumab)、地诺单抗（denosumab)、伊库珠单抗（eculizumab)、吉妥 珠单抗奥唑米星（gemtuzumab ozogamicin)、戈利木单抗（golimumab)、替伊莫单抗 (ibritumomab tiuxetan)、拉贝珠单抗（labetuzumab)、马帕木单抗（mapatumumab)、 马妥珠单抗（matuzumab)、美泊利单抗（mepolizumab)、莫维珠单抗（motavizumab)、莫 罗单抗（muromonab) -0)3、那他珠单抗（natalizumab)、尼妥珠单抗（nimotuzumab)、 奥法木单抗（ofatumumab)、奥马珠单抗（omalizumab)、奥戈伏单抗（oregovomab)、帕 利珠单抗（palivizumab)、帕尼单抗（panitumumab)、培图莫单抗（pemtumomab)、帕妥 珠单抗（pertuzumab)、雷珠单抗（ranibizumab)、利妥昔单抗（rituximab)、罗维珠单 抗（rovelizumab)、托珠单抗（tocilizumab)、托西莫单抗（tositumomab)、曲妥珠单抗 (trastuzumab)、优特克单抗（ustekinumab)、维多珠单抗（vedolizomab)、扎鲁木单抗 (zalutumumab)以及扎木单抗（zanolimumab) 〇
[0081] 本发明还可以用于收获包含例如任何上述蛋白质的重组融合蛋白。举例来说， 包含上述蛋白质中的一种加上多聚化结构域，如亮氨酸拉链、卷曲螺旋、免疫球蛋白的 Fc部分或基本上类似的蛋白质的重组融合蛋白可以使用本发明的方法产生。参见例如 W094/10308 ;Lovejoy 等(1993). Science 259:1288-1293 ;Harbury 等(1993). Science 262:1401-05 ;Harbury 等(1994), Nature 371:80-83 ; H&kanss〇n 等(1999), Structure 7:255-64。在这些重组融合蛋白中特别包括的是受体的一部分与抗体的Fc部分融合的蛋 白质，如依那西普（etanercept) (p75TNFR:Fc)和贝拉西普（belatacept) (CTLA4:Fc)。
[0082] 为了实现本发明的目的，细胞培养基是在体外细胞培养中适于动物细胞，如哺乳 动物细胞生长的培养基。细胞培养基制剂是本领域熟知的。典型地，细胞培养基包含缓冲 齐IJ、盐、碳水化合物、氨基酸、维生素以及痕量的必需元素。细胞培养基可以含有或可以不 含血清、蛋白胨和/或蛋白质。包括无血清培养基和成分明确培养基在内的各种组织培 养基是可商购获得的，例如尤其可以使用以下细胞培养基中的任一种或组合：RPMI-1640 培养基、RPMI-1641培养基、杜氏改良伊格氏培养基（Dulbecco' s Modified Eagle's Medium，DMEM)、伊格氏最低必需培养基（Minimum Essential Medium Eagle)、F_12K 培 养基、汉姆氏F12培养基（Ham's F12 Medium)、伊斯科夫改良杜氏培养基（Iscove's Modified Dulbecco' s Medium)、麦考伊氏 5A 培养基（McCoy，s 5A Medium)、莱氏 L-15 培养基（Leibovitz's L-15 Medium)，以及无血清培养基，如EX-CELL? 300系列（JRH Biosciences, Lenexa, Kansas)。细胞培养基可以补充有另外的组分或增加浓度的组分，如 氨基酸、盐、糖、维生素、激素、生长因子、缓冲剂、抗生素、脂质、痕量元素等，这取决于所要 培养的细胞的需要和/或所需的细胞培养参数。
[0083] 细胞培养基可以是无血清、无蛋白质和/或无蛋白胨的。"无血清"适用于不含动 物血清，如胎牛血清的细胞培养基。"无蛋白质"适用于不含外源添加的蛋白质，如转铁蛋 白、蛋白质生长因子IGF-1或胰岛素的细胞培养基。无蛋白质培养基可以含有或可以不含 蛋白胨。"无蛋白胨"适用于不含外源性蛋白质水解产物，如动物和/或植物蛋白水解产物 的细胞培养基。细胞培养肉汤或类似术语指的是尤其含有活哺乳动物细胞和非活哺乳动物 细胞、细胞代谢物以及细胞碎片（如核酸、蛋白质以及脂质体）的细胞培养基。
[0084] 细胞培养或"培养"的意思是使细胞在多细胞生物体或组织外部生长和繁殖。适用 于哺乳动物细胞的培养条件是本领域已知的。参见例如Animal cell culture:A Practical Approach, D.Rickwood 编著，Oxford University Press, New York (1992)。哺乳动物细胞 可以悬浮培养或在贴壁于固体基质上时进行培养。具有或不具有微载体并且以分批、分批 补料、连续、半连续或灌注模式操作的流化床生物反应器、中空纤维生物反应器、滚瓶、摇瓶 或搅拌釜式生物反应器可供哺乳动物细胞培养使用。
[0085] 可以在小规模培养，例如像100ml至大规模细胞培养，如具有成千和上万毫升的 培养尺寸的系统中培养哺乳动物细胞（如CH0细胞），以便在临床和商业上制造蛋白质治疗 剂。
[0086] 对细胞系（也被称为"宿主细胞"）进行遗传工程化以使其表达具有商业或科学 价值的多肽。细胞系典型地源自于由原代培养物所产生的谱系，所述原代培养物可以在培 养中维持无限的时间。对细胞系进行遗传工程化包括使用重组多核苷酸分子对细胞进行转 染、转化或转导，和/或以另外的方式发生改变（例如通过使重组细胞与非重组细胞进行同 源重组和基因活化或融合）以便产生表达所需重组多肽的宿主细胞。用于对细胞和/或 细胞系进行遗传工程化以使其表达所关注的多肽的方法和载体是为本领域技术人员所熟 失口白勺:例如，各种技术说明于Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel等编著 (町167&3〇118，他￥￥〇^，1988 以及每季更新的内容）；3&1]1131'〇〇1^等，]\1〇16(3111&1'〇1〇11；[1^:八 Laboratory Manual(Cold Spring Laboratory Press, 1989) ；Kaufman, R. J. , Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990，第 15-69 页。
[0087] 适于在培养中生长的多种多样的哺乳动物细胞系可获自美国典型培养物保藏中 心（American Type Culture Collection) (Manassas，Va.)和商业供应商。常用于工业 中的哺乳动物细胞系的实例包括VERO、BHK、HeLa、CV1 (包括Cos)、1?0(、293、3了3、骨髓瘤 细胞系（例如呢0、呢1)、？(：12、1138细胞以及中国仓鼠卵巢（010)细胞。010细胞被广 泛用于产生复杂的重组蛋白，例如细胞因子、凝血因子以及抗体（Brasel等(1996), Blood 88:2004-2012 ;Kaufman 等(1988). T. Biol Chem 263:6352-6362 ;McKinnon 等（1991)，J Mol Endocrinol 6:231-239 ;Wood 等(1990). T. Immunol. 145:3011-3016)。二氢叶酸还原 酶（DHFR)缺陷型突变细胞系（Urlaub 等(1980). Proc Natl Acad Sci USA 77:4216-4220)、 DXB11以及DG-44是合乎需要的CH0宿主细胞系，这是因为高效的DHFR选择和可扩增基 因表达系统允许在这些细胞中进行高水平的重组蛋白表达（Kaufman R.J. (1990). Meth Enzymol 185:537-566)。另外，这些细胞作为贴壁或悬浮培养物是易于操作的并且展现出 相对良好的遗传稳定性。CH0细胞和在它们当中重组表达的蛋白质已被广泛地表征并且已 由监管机构批准用于临床商业制造。
[0088] 虽然本申请中所用的术语在本领域内是标准的，但是本文提供了某些术语的定义 以确保权利要求书的含义的清晰性和明确性。单位、前缀以及符号可以它们为SI所接受的 形式表示。本文所陈述的数值范围包括限定该范围的数字，并且包括并支持所限定的范围 内的每一个整数。除非另外指出，否则术语"一个（种）（a) "或"一个（种）（an) "应被视为意 指"至少一个（种）"。本文所用的章节标题仅用于组织目的而不应被视为限制所述的主题。 除非另外指明，否则本文所述的方法和技术一般根据常规方法进行，所述常规方法是本领 域熟知的并且如在整个本说明书中所引用和论述的各种一般和更具体的参考文献中所述。 参见例如 Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 3 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001);以及 Ausubel 等，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992);以及 Harlow 和Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)。本申请中所引用的所有文献或文献的部分（包括但不限于专 利、专利申请、文章、书籍以及论文）特此以引用的方式明确并入。
[0089] 本发明的范围不受本文所述的具体实施方案的限制，所述具体实施方案仅旨在对 本发明的单个方面进行说明，并且功能上等同的方法和组分处于本发明的范围内。实际上， 根据上述描述和附图，除了本文所示和所描述的那些改动之外，对本发明的各种改动对于 本领域技术人员来说也将变得显而易见。这些改动旨在属于所附权利要求书的范围内。 实施例
[0090] 实施例1
[0091] 该实验对二烯丙基二甲基氯化铵（PDADMAC)的不同分子量制备物进行比较，使用 这些制备物使哺乳动物细胞培养肉汤絮凝并且比较它们的沉降时间。
[0092] 以分批补料培养法将表达重组单克隆抗体的CH0细胞在2, 000L的生物反应器中 培养15天。在测试之前将细胞培养肉汤冷却至10°C。设置一系列旋转烧瓶，其中每一个烧 瓶中存在1L的细胞培养肉汤。PDADMAC以20% (w/v)液体的形式提供（Sigma Aldrich，St. Louis，MO)，并且通过用纯水稀释至10% (w/v)来制备所有这些实验中所用的操作储备溶 液。将分子量为 1〇〇, 000-200, 〇〇〇、200, 000-350, 000 以及 400, 000-500, 000 的 PDADMAC 添 加至每一个烧瓶中达到介于29皮克至86皮克的PDADMAC/总细胞密度之间的最终浓度。将 PDADMAC溶液连续添加约1分钟并且在以70rpm-80rpm搅拌下在10°C下孵育15分钟。使 絮状物在环境温度下沉降。将这一物质用于沉降时间测定。
[0093] 在1，000L -次性反应器中培养第二批分批补料培养物，持续15天。将细胞培养肉 汤维持在约36°C下。设置一系列旋转烧瓶，其中每一个烧瓶中存在1L的细胞培养肉汤。将 分子量为〈100, 〇〇〇、100, 000-200, 000、200, 000-350, 000 以及 400, 000-500, 000 的 PDADMAC 添加至每一个烧瓶中达到介于25皮克至76皮克的PDADMAC/总细胞密度之间的最终浓度。 将PDADMAC溶液连续添加约1分钟并且在以70rpm-80rpm搅拌下在约36°C下孵育15分钟。 使絮状物在环境温度下沉降。将这一物质用于浊度测定。
[0094] 通过将如使用Cedex细胞计数器和分析器（Roche Innovatis AG，Indianapolis，IN)由台盼蓝拒染所测量的活细胞总数与非活细胞总数相加来确定总细 胞密度。然后将絮凝了的溶液转移到1L玻璃量筒中以测定絮凝并且压紧的沉降速率。以 15分钟的时间间隔获得读数，持续90分钟并且将相对絮凝体积计算为沉降了的絮状物体 积/总体积。
[0095] 通过倾析，继而通过0.2 μ过滤器将上清液从沉降并且絮凝了的细胞物质中取 出。使用2100Ρ浊度计（Hach，Loveland，C0)测量浊度。
[0096] 图2A和2B示出了与平均分子量小于200, 000的PDADMAC相比，使用具有大于 200, 000但是小于500, 000的平均分子量的PDADMAC进行絮凝会产生最佳的沉降时间和澄 明度。
[0097] 实施例2
[0098] 该实验比较使由小细胞系（如二倍体细胞系）与大细胞系（如四倍体细胞系）表 达重组抗体的哺乳动物细胞培养肉汤絮凝所需的PDADMAC的量。
[0099] 如上文所述培养二倍体细胞系和四倍体细胞系。设置一系列旋转烧瓶，其中每一 个烧瓶中存在1L来自二倍体培养物和四倍体培养物中的每一种的细胞培养肉汤。在该实 验和以下所有实验中，除非另外指出，否则使用具有400, 000至500, 000的平均分子量的 PDADMAC。将PDADMAC添加至每一个烧瓶中达到如表2中所示的最终浓度。如上文所述测 定总细胞密度。表2 :用于二倍体培养物和四倍体培养物的PDADMAC的最终浓度 [0100]
【权利要求】
1. 一种哺乳动物细胞培养物收获方法，所述方法包括 将表达重组蛋白的哺乳动物细胞在细胞培养基中培养预定的时间或直到达到所需的 细胞密度和/或细胞压积为止， 将阳离子型聚合物和非离子型聚合物添加至所述细胞培养基中，从而引发絮凝， 在絮凝期间混合所述细胞培养基， 使絮凝体沉降，以及 回收澄清了的上清液。
2. 根据权利要求1所述的哺乳动物细胞培养物收获方法，其中所述阳离子型聚合物是 聚二烯丙基二甲基氯化铵。
3. 根据权利要求1所述的哺乳动物细胞培养物收获方法，其中所述非离子型聚合物选 自聚乙二醇和葡聚糖。
4. 根据权利要求1所述的哺乳动物细胞培养物收获方法，其中所述非离子型聚合物选 自 PEG 3, 000 和 PEG 6, 000。
5. 根据权利要求1所述的哺乳动物细胞培养物收获方法，所述方法进一步包括将非离 子型表面活性剂添加至所述细胞培养基中。
6. 根据权利要求5所述的哺乳动物细胞培养物收获方法，其中所述非离子型表面活性 剂是 Triton X-100。
7. -种哺乳动物细胞培养物收获方法，所述方法包括 将表达重组蛋白的哺乳动物细胞在细胞培养基中培养预定的时间或直到达到所需的 细胞密度和/或细胞压积为止， 将聚二烯丙基二甲基氯化铵和PEG 3, 000添加至所述细胞培养基中，从而引发絮凝， 在絮凝期间混合所述细胞培养基， 使絮凝体沉降，以及 回收澄清了的上清液。
8. -种哺乳动物细胞培养物收获方法，所述方法包括 将表达重组蛋白的哺乳动物细胞在细胞培养基中培养预定的时间或直到达到所需的 细胞密度和/或细胞压积为止， 将聚二烯丙基二甲基氯化铵、PEG 3, 000以及Triton X-100添加至所述细胞培养基 中，从而引发絮凝， 在絮凝期间混合所述细胞培养基， 使絮凝体沉降，以及 回收澄清了的上清液。
9. 一种哺乳动物细胞培养物收获方法，所述方法包括 将表达重组蛋白的哺乳动物细胞在细胞培养基中培养预定的时间或直到达到所需的 细胞密度和/或细胞压积为止， 将阳离子型聚合物和非离子型聚合物添加至所述细胞培养基中，从而引发絮凝， 在絮凝期间混合所述细胞培养基， 使絮凝体沉降以进行初级沉降， 回收初级澄清了的上清液， 对所述初级沉降的絮凝体进行洗涤， 使所述经过洗涤的絮凝体沉降以进行二次沉降，以及 回收所述二次澄清了的上清液。
10. -种哺乳动物细胞培养物收获方法，所述方法包括 将表达重组蛋白的哺乳动物细胞在细胞培养基中培养预定的时间或直到达到所需的 细胞密度和/或细胞压积为止， 将阳离子型聚合物和非离子型聚合物添加至所述细胞培养基中，从而引发絮凝， 在絮凝期间混合所述细胞培养基， 使絮凝体沉降以进行初级沉降， 回收初级澄清了的上清液， 如果所述初级澄清了的上清液中的产物回收率小于80%，则对所述初级沉降的絮凝体 进行洗涤， 使所述经过洗涤的絮凝体沉降以进行二次沉降，以及 回收所述二次澄清了的上清液。
11. 根据权利要求9或10所述的哺乳动物细胞培养物收获方法，其中所述阳离子型聚 合物是聚二烯丙基二甲基氯化铵。
12. 根据权利要求9或10所述的哺乳动物细胞培养物收获方法，其中所述非离子型聚 合物选自聚乙二醇和葡聚糖。
13. 根据权利要求9或10所述的哺乳动物细胞培养物收获方法，其中所述非离子型聚 合物选自 PEG 3, 000 和 PEG 6, 000。
14. 根据权利要求9或10所述的哺乳动物细胞培养物收获方法，所述方法进一步包括 将非离子型表面活性剂添加至所述细胞培养基中。
15. 根据权利要求14所述的哺乳动物细胞培养物收获方法，其中所述非离子型表面活 性剂是 Triton X-100。
16. -种哺乳动物细胞培养物收获方法，所述方法包括 将表达重组蛋白的哺乳动物细胞在细胞培养基中培养预定的时间或直到达到所需的 细胞密度和/或细胞压积为止， 将聚二烯丙基二甲基氯化铵和PEG 3, 000添加至所述细胞培养基中，从而引发絮凝， 在絮凝期间混合所述细胞培养基， 使絮凝体沉降以进行初级沉降， 回收初级澄清了的上清液， 对所述初级沉降的絮凝体进行洗涤， 使所述经过洗涤的絮凝体沉降以进行二次沉降，以及 回收所述二次澄清了的上清液。
17. -种哺乳动物细胞培养物收获方法，所述方法包括 将表达重组蛋白的哺乳动物细胞在细胞培养基中培养预定的时间或直到达到所需的 细胞密度和/或细胞压积为止， 将聚二烯丙基二甲基氯化铵、PEG 3, 000以及Triton X-100添加至所述细胞培养基 中，从而引发絮凝， 在絮凝期间混合所述细胞培养基， 使絮凝体沉降以进行初级沉降， 回收初级澄清了的上清液， 对所述初级沉降的絮凝体进行洗涤， 使所述经过洗涤的絮凝体沉降以进行二次沉降，以及 回收所述二次澄清了的上清液。
18. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中同时添加所述阳离子型聚合物和所 述非离子型聚合物。
19. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中首先添加所述阳离子型聚合物并且 混合至少30秒，继而添加所述非离子型聚合物。
20. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中同时添加所述阳离子型聚合物、所述 非离子型聚合物以及非离子型表面活性剂。
21. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中首先添加所述阳离子型聚合物并且 混合至少30秒，继而添加所述非离子型聚合物和非离子型表面活性剂。
22. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述阳离子型聚合物是二烯丙基二 甲基氯化铵的聚合物、聚二烯丙基二甲基氯化铵、聚乙烯亚胺、聚丙烯酰胺或壳聚糖。
23. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述非离子型聚合物是聚乙二醇或 葡聚糖。
24. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述非离子型表面活性剂是Sapoin 或 Triton X100。
25. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中以等于或约20皮克/总细胞密度至 等于或约90皮克/总细胞密度的浓度添加所述聚二烯丙基二甲基氯化铵。
26. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中以等于或约25皮克/总细胞密度的 浓度添加所述聚二烯丙基二甲基氯化铵，其中所述哺乳动物细胞来源于二倍体细胞系。
27. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中添加介于43皮克/总细胞密度与57 皮克/总细胞密度之间的所述聚二烯丙基二甲基氯化铵，其中所述哺乳动物细胞来源于四 倍体细胞系。
28. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中TOG 3, 000的浓度是等于或约3%至 等于或约4. 5%。
29. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中PEG 6, 000的浓度是等于或约2. 5% 至等于或约3. 5 %。
30. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中Triton X100的浓度是0.05% (w/ v)。
31. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞培养肉汤在36°C 与20°C之间。
32. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞培养肉汤处于 20°C或高于20°C。
33. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在9%蔗糖溶液中对来自所述初级 沉降的所述絮凝体进行洗涤。
【文档编号】C07K1/30GK104245922SQ201280069842
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2012年12月14日 优先权日:2011年12月15日
【发明者】M. 麦克纳尼 T., 佩蒂 K., C. 托马斯 A., 赵晓阳 申请人:安姆根有限公司