专利名称：：肽及n－氨基甲酰基－保护的肽的制备方法
技术领域：
：本发明涉及用酶催化制备有保护的二或寡肽以及通过裂解除去所用的保护基团的方法。合成的短链肽正在越来越多地用于药理学及肠胃外给养中。Kyotorphin(L-酪氨酸-L-精氨酸)能够促进脑菲肽(即大脑中具有止痛和安神作用的内生物质，Hughes，1975)的释放，因此可作为一种药理学活性二肽的例子。酶催化法制备二或寡肽是已知的，并且通常都采用保护基团技术。US-A-571,037描述了甲酰保护基团的使用，JP62074296描述了乙酰保护基团的使用，US-A-4,935,355描述了苄基保护基团的使用，Tetrahedron1992，48，1115中描述了N-苯乙酰基保护基团的使用。上述这些方法的缺点是，有些保护基团比较昂贵(例如苄基、N-苯乙酰基)，有些保护基团的裂解除去很困难(例如乙酰基、甲酰基)，或者只有在相当特殊的条件(氢解)下才能够被除去(例如苄基)。因此，本发明的目的是开发一种特别简单和经济的合成肽的方法，能够通过裂解方法简单温和地除去保护基团，并能够简便地组建和离析酶。本发明的目的是制备具有通式I的肽其中，R1和R2彼此独立，表示氢，(C1-C6)的烷基，这些烷基可以任意地被诸如N、O或S等杂原子中断或取代一次或多次，这些杂原子也可被氢、(C1-C4)的烷基或苄基取代，或通过双键与烷基键合；苯基或苄基，这二者都可以任意地被卤素或羟基取代一次或多次；杂芳烷基，例如3-吲哚甲基，2-，3-或4-吡啶甲基；R3表示(C1-C4)的烷氧基、NH2、羟基、NR1R2、可任意地被卤素、硝基、NH2、(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基取代一次或多次的苄氧基；或下式II表示的一个或多个单元本发明的目的的实现是通过将下式III表示的化合物或其盐其中R1、R2和R3的定义同上，并且R4表示氢，(C1-C4)的烷基，可任意地被卤素、(C1-C4)的烷基、(C1-C4)的烷氧基、硝基、CN、CF3、(C1-C4)的烷氧基羰基、COOH或-NR1R2取代一次或多次的苯基，芳烷基，例如可被卤素、(C1-C4)的烷基或(C1-C4)的烷氧基取代的苄基，萘基，杂芳烷基，例如2-，3-或4-噻吩基、2-、3-，或4-吡啶基或2-喹啉基，与一种氨基甲酰酶在有或没有溶剂的情况下反应，或者在有或没有溶剂或一种酸的情况下，将氨基甲酰基保护基团化学裂解除去。此外还发现，具有通式III的氨基甲酰基-保护的肽其中，R11和R2彼此虫立，表示氢，(C1-C4)的烷基，这些烷基可以任意地被诸如N、O或S等杂原子中断或取代一次或多次，这些杂原子也可被氢、(C1-C4)的烷基或苄基取代，或通过双键与烷基键合；苯基或苄基，这二者都可以任意地被卤素或羟基取代一次或多次；杂芳烷基，例如3-吲哚甲基，2-，3-或4-吡啶甲基；R3表示(C1-C4)的烷氧基、NH2、羟基、NR1R2、可任意地被卤素、硝基、NH2、(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基取代一次或多次的苄氧基；R4表示氢，(C1-C4)的烷基，可任意地被卤素、(C1-C4)的烷基、(C1-C4)的烷氧基、硝基、CN、CF3、(C1-C4)的烷氧基羰基、COOH或-NR1R2取代一次或多次的苯基，芳烷基，例如可被卤素、(C1-C4)的烷基或(C1-C4)的烷氧基取代的苄基，萘基，杂芳烷基，例如2-，3-或4-噻吩基、2-、3-，或4-吡啶基或2-喹啉基，可以通过下面方法获得使式IV的化合物或其盐其中R1和R4的定义同上，与式V的一种化合物或其酸加成的盐反应其中R2和R3的定义同上，反应中可以有或没有溶剂，可选择地使用一种碱。术语“烷基”应理解为“直链”和“支链”烷基。术语“直链烷基”应理解为，例如下列基团甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基，术语“支链烷基”应理解为例如下列基团异丙基或叔丁基。卤素代表氟、氯、溴或碘。术语“烷氧基”代表例如下列基团甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、异丙氧基、异丁氧基或戊氧基。二肽，例如天冬酶，优选是采用这种方法制备。本发明方法的另一优点是可以在高稠度的悬浮液中进行肽的偶联，这可以使基质和产物以部分固体的形式存在。以所述的氨基甲酰基保护的肽作为中间产物而合成肽的新方法包括三个反应步骤。A)制备N-氨基甲酰基-氨基酸或N-氨基甲酰基-氨基酸的衍生物；B)连接氨基甲酰基-保护的亲电试剂和亲核试剂之间的肽键；C)通过裂解除去氨基甲酰基保护基团。N-氨基甲酰基-氨基酸或N-氨基甲酰基-氨基酸的衍生物可以通过文献中已知的方法来制备。优选地，使氨基酸或氨基酸衍生物与通式VI表示的异氰酸酯进行反应R1-NCO(VI)其中R1的定义同上，反应在H2O/有机溶剂两相体系中进行，有机溶剂可以是，例如甲苯，氯苯或叔丁基甲醚。反应温度为0℃至120℃，优选为20℃至70℃。如果适合，可以向反应混合物中加入一种无机碱，例如NaOH、KOH、K2CO3、Na2CO3、KHCO3或NaHCO3，或一种有机碱，例如三乙基胺或三丁基胺。所用的结构式III的异氰酸苯酯略微过量是有利的。特别优选的是，采用结构式VII的氰酸盐制备N-氨基甲酰基-保护的氨基酸或氨基酸衍生物M+-OCNVII，其中M+代表Na+、K+、Ag+、Pb+(OCN)或铵离子，例如，四乙基铵，四丁基铵或苯基三乙基铵。反应可以在水溶液中按已知的方式进行，反应温度为0℃-120℃，优选为60℃-100℃，如果适合，可以加入一种无机碱，例如NaOH、KOH、K2CO3或Na2CO3。经验证，上述反应在氰酸盐略微过量1.01-2当量，优选1.1-1.2当量的情况下进行是有利的。肽键的连接是以已知的方式在水解酶的帮助下进行的(Jakubke，Kuhl和Konnecke；AngewChem，1985，第97卷，79-87页)。在此，肽连接过程是动力学控制还是热力学控制与反应条件无关。本发明的上述方法可适用于所有这两种情形。术语“式IV化合物的盐”通常是指离子结构。因此，可能的阳离子，例如Na+、K+、Ag+、Pb+或铵离子，例如四乙基铵、四丁基铵或苯基三乙基铵，可以中和式IV化合物上的负电荷。这里的负电荷可以分布在整个分子上(式IV化合物)或位于氮原子上或羧酸盐形式中的羧基上。出人意料的是，这种使用氨基甲酰基作为保护基团(这是这一反应过程的新颖之处)的反应具有好的时空产率，并且能够容易地分离产物。反应的宽的适用性也是令人吃惊的。“式V的酸加成的盐”应该理解为，例如HCl盐，HBr盐或H2SO4盐。氨基甲酰基保护基团可以在，例如温和的反应条件下，在氨基甲酰酶的帮助下被裂解除去。这种通过裂解从肽上除去氨基甲酰基的方式是新颖的。它的特别的优点是，除了酶，只需要水作为基质进行解离，并且作为解离产物，除了肽，只形成了二氧化碳和氨，肽可以从中很容易地分离。用于这一反应的氨基甲酰酶可选择性地是部分纯化的、纯化的、离析出来的或固定化状态的。反应是不可逆的，并且观察到高达100％的转化率。反应在水溶液中进行，反应温度为10-50℃，优选为20-35℃，特别优选为25-30℃，pH值为5-11，优选为6.5-8.5，特别优选为7-8。在用氨基甲酰酶水解的过程中产生了二氧化碳和氨，它们可选择地以气体形式从反应混合物中逸出。至此，不带保护的肽可以从经氨基甲酰酶处理过的肽溶液中沉淀出来，并且通过蒸发、冷却或适当加入有机溶剂而被结晶分离。经验证，以下列序号保藏于德国微生物收集中心(DeutscheSammlungfurMikroorgansmen)的氨基甲酰酶是适用的DSM7329，DSMT7330，DSM9771。然而，本发明的新方法并不排除上述之外的其它微生物。通过裂解除去氨基甲酰基保护基团的过程也可以在一种附加酶(除上述的氨基甲酰酶之外)的存在下以与上述类似的方式进行，这种附加酶例如嗜热菌蛋白酶。氨基甲酰基保护基团也可以用化学方法裂解除去。这种通过裂解从肽上除去氨基甲酰基团的方式同样也是新颖的。这种裂解除去保护基团，在理论上可以用任何NO+给体来进行。NaNO2或NO+BF4-是特别适用的。反应可选择性地在含水介质和/或惰性有机溶剂，例如芳烃，例如甲苯或氯苯中进行；或在脂肪烃，卤化烃，例如二氯甲烷或醚，例如甲基叔丁基醚或四氢呋喃中进行。取决于所用的NO+给体，反应在一种酸的存在下进行，例如HCl或H2SO4。特别适合的反应温度在+120℃至-30℃之间，特别优选的是+60℃至-20℃，最优选的是+25℃至0℃。如果加入酸，pH值应在-0.5至5之间，优选为0至2。这一反应的优点是，除了氮气、CO2和适当的一种盐之外，不产生任何其它的副产品，并且反应的转化率高，可得到不含解离产物的所需形式的产品。这一反应的另一个优点就是组建容易。下面的实施例用于更详细地解释本发明的新方法，但是本发明并不受此限制。实施例1N-氨基甲酰基-氨基酸及其衍生物，例如N-氨基甲酰基-L-天冬氨酸的制备将12克(0.3摩尔)NaOH锭剂加入大约200毫升H2O中并溶解。向其中加入33.3克(0.25摩尔)天冬氨酸于50毫升水中的溶液，将反应混合物加热至80℃。pH值为8.7。在5分钟内加入16.6克(0.255摩尔)氰酸钠(pH升至9.3，温度升至86℃)。反应一小时后，检测不到天冬酸。肽的合成本文中氨基酸和肽将按着国际通用原则缩写(IUPAC-JUB生物化学命名联合委员会(JCBN)；氨基酸和肽的命名和符号，欧州生物化学通讯，158，9-37(1984))。AC-氨基碳酰-(氨基甲酰基-，NH2CO-)实施例2AC-Asp-Phe-OMe的合成在一个可封闭的聚丙烯容器中，向50毫克(0.2毫摩尔)AC-Asp(OK)-OK和83毫克(0.4毫摩尔)H-Phe-OMe.HCl中加入80微升缓冲剂(0.5M的Hepes/Na+，pH7，HepesN-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙基磺酸)，立即用刮勺将这些组分彻底混合。将反应混合物在水浴中恒温于40℃，然后通过加入含有4毫克嗜热菌蛋白酶制剂(希格玛公司，P1512)的20微升缓冲剂而开始反应。在反应开始1小时、2.5小时、16小时、22小时、29小时和39小时后分别取样，将样品加入到0.75毫升4％的醋酸水溶液中而使其停止反应。在此进行分析评价，连同以下实施例，分析手段是HPLC(高压液相色谱)，并与一可信样品进行对比。实施例3a-e与实施例2类似，分别用120微升(a)、160微升(b)、200微升(c)、240微升(d)和280微升(e)缓冲剂代替实施例2中的80微升缓冲剂，用于悬浮反应剂。在29小时、39小时后取样。实施例4在一个可封闭的聚丙烯容器中向44毫克(0.175毫摩尔)AC-Asp(OK)-OK和41.5毫克(0.2毫摩尔)H-Phe-OMe.HCl中加入80微升缓冲剂(0.5MHepes/Na+；pH7)，立即用刮勺将这些组分彻底悬浮。将反应容器移至恒温于40℃的水浴中，通过加入含有1.5毫克嗜热菌蛋白酶制剂(希格玛公司，P1512)的15微升缓冲剂而开始反应。在反应开始1小时、2.5小时、5小时、6.5小时和22小时后取样，将样品加入到0.75毫升4％的醋酸水溶液中而使其停止反应，并用HPLC法分析产物。实施例5与实施例4类似，分别用10(a)、30(b)、50(c)、130(d)和180(e)微升缓冲剂代替实施例4中的80微升缓冲剂，加入反应剂中。在22小时后取样。实施例6AC-Asp-Phe-NH2的合成在一个可封闭的聚丙烯容器中向250毫克(1.0毫摩尔)AC-Asp(OK)-OK和400毫克(2.0毫摩尔)H-Phe-NH2.HCl中加入400微升缓冲剂(0.5MHepes/Na+；pH7)，立即用刮勺将组分彻底悬浮。在将反应容器移至恒温于40℃的水浴中后，通过加入含有10毫克嗜热菌蛋白酶制剂(希格玛公司，P1512)的50微升缓冲剂而开始反应。在反应开始后44小时取样，并用0.75毫升4％的醋酸水溶液使样品停止反应，用HPLC方法分析产物。通过加入1毫升1N的HCl水溶液并于4℃放置过夜而结束反应。通过抽吸滤出沉淀，并用冰水洗涤。产率理论值的62％熔点范围221-223℃1H-NMR(D6-DMSO，300MHz)δ＝2,38-2,6(m，2H，-βCH2-)，δ＝2,8-2,88(m，1H，-βCH2-)，δ＝5,72(s，2H，-NH2)，δ＝6,30(d，1H，-αNH-，J＝7,69)，δ＝7,13(s，1H，Phe-NH2)，δ＝7,26-7,28(m，5H，Phe-C6H5)，δ＝7,33(s，1H，Phe-NH2)，δ＝7,83(d，1H，-αNH-，J＝8,4)实施例7AC-Asp-Phe-Leu-NH2的合成在一个聚丙烯反应容器中，将67.4毫克(0.2毫摩尔)AC-Asp-Phe-OMe和26毫克(0.2毫摩尔)H-Leu-NH2(BachemBiochemicaGmbH)溶解于180微升缓冲剂(0.5MHepes/Na+；pH7.9)中。在加入10微升10M的NaOH水溶液后，通过加入10微升α-胰凝乳蛋白酶溶液(10毫克/毫升缓冲剂；Serva，3x结晶)而使反应开始。在反应开始2、5、10、20、30和60分钟后取样，将样品溶于1毫升4％的醋酸水溶液中，并用HPLC法分析。余下的反应混合物用1毫升的甲醇处理，过滤，并向滤液中加入1毫升1N的HCl水溶液和4毫升水。在48小时之内，AC-Asp-Phe-Leu-NH2结晶析出。将结晶分离出来，用冰水洗涤2次(大约每次1.5毫升)，然后在真空下用P4O10干燥。</tables>1H-NMR；COSY(DMSO，300MHz)δ＝0,82(d，3H，Leu-δCH3)，δ＝0,87(d，3H，Leu-δCH3)，δ＝1,41-1,6(m，3H，Leu-γCH-，Leu-βCH2-)，δ＝2,35-2,58(m，2H，Asp-βCH2-)，δ＝2,81-3,06(m，2H，Phe-βCH2-)，δ＝4,18(dt，1H，Leu-αCH-)，δ＝4,33(dt，1H，Asp-αCH-)，δ＝4,44(dt，1H，Phe-αCH-)，δ＝5,70(s，2H,AC-NH2)，δ＝6,30(d，1H，Asp-αNH-)，δ＝6,96(s，1H，Leu-NH2)，δ＝7,05(s，1H，Leu-NH2)，δ＝7,14-7,27(m，5H，Phe-C6H5)，δ＝7,85-7,96(m，2H，Leu-αNH，Phe-αNH)实施例8AC-Asp-Phe-Ile-Gly-OMe的合成与实施例7类似，以0.2毫摩尔(47.8毫克)H-Ile-Gly-OMe.HCl代替实施例7中的H-Leu-NH2。为调节pH，用10M的NaOH水溶液代替35微升缓冲剂。70分钟后的产率如下</tables>1H-NMR；COSY(DMSO，300MHz)δ＝0,77-0,88(m，6H，Ile-δCH3)，δ＝1,00-1,15(m，1H，Ile-γCH2-)，δ＝1,38-1,52(m，1H，Ile-γCH2-)，δ＝1,65-1,78(m，1H，Ile-βCH-)，δ＝2,34-2,58(m，2H，Asp-βCH2-)，δ＝2,78-2,88(m，1H，Phe-βCH2-)，δ＝2,94-3,2(m，1H，Phe-βCH2-)，δ＝3,62(s，3H，OCH3)，δ＝3,75-3,95(m，2H，Gly-αCH2-)，δ＝4,17(t，1H，Ile-αCH-)，δ＝4,30-4,40(m，1H，Asp-αCH-)，δ＝4,48-4,58(m，1H，Phe-αCH-)，δ＝5,7(s-breit，AC-NH2)，δ＝6,30(d，1H，Asp-αNH-)，δ＝7,12-7,26(m，5H，Phe-C6H5-)，δ＝7,80(d，1H，Phe-αNH-)，δ＝7,92(d，1H，Leu-αNH-)，δ＝8,32(t，1H，Gly-αNH-)。实施例9AC-Tyr-Ile-Ala-NH2的合成a)在一个可封闭的聚丙烯容器中向44.8毫克(0.2毫摩尔)AC-Tyr-OH和47.4毫克(0.2毫摩尔)H-Ile-Ala-NH2.HCl中加入45微升缓冲剂(0.5MHepes/Na+，pH7)，立即用刮勺将上述组分彻底悬浮。加入25微升10M的NaOH水溶液调节pH值。在将反应容器移至恒温于40℃的水浴中后，通过加入含有1毫克嗜热菌蛋白酶制剂(希格玛公司，P1512)的10微升缓冲剂而使反应开始。反应开始3小时后取样，将样品加入到1毫升4％的醋酸水溶液和200微升乙腈中使反应停止，并用HPLC方法分析产物。余下的反应混合物的处理同实施例7，不同之处在于用4％的醋酸水溶液代替1N的HCl。3小时后AC-Tyr-Ile-Ala-NH2的产率为理论值的76％。1H-NMR；COSY(DMSO，300MHz)δ＝0,76-0,84(m，6H，Ile-δCH3，Ile-γCH3)，δ＝1,00-1,12(m，1H，Ile-γCH2-)，δ＝1,22(d，3H，Ala-βCH3)，δ＝1,36-1,42(m，1H，Ile-γCH2-)，δ＝1,68-1,78(m，1H，Ile-βCH-)，δ＝2,56-2,68(m，1H，Tyr-βCH2-)，δ＝2,80-2,90(m，1H，Tyr-βCH2-)，δ＝4,12-4,24(m，2H，Ala-αCH-，Ile-αCH-)，δ＝4,28-4,38(m，1H，Tyr-αCH-)，δ＝5,58(s，2H，AC-NH2)，δ＝6,03(d，1H，Tyr-αNH-)，δ＝6,61(d，2H，Tyr-ArH)，δ＝6,92-6,98(m，3H，2Tyr-ArH，1Ala-NH2)，δ＝7,20(s，1H，Ala-NH2)，δ＝7,84(d，1H，Ala-αNH-)，δ＝7,92(d，1H，Ile-αNH-)，δ＝9,12(s，1H，Tyr-OH)b)与实施例9a类似，使用224毫克(1.0毫摩尔)AC-Tyr-OH，237.7毫克(1.0毫摩尔)H-Ile-Ala-NH2.HCl，225微升缓冲剂，125微升10M的NaOH和含有5毫克嗜热菌蛋白酶(希格玛P1512)的50微升的嗜热菌蛋白酶悬浮液。16小时后AC-Tyr-Ile-Ala-NH2的产率228毫克(＝理论值的56％)。实施例10AC-Tyr-Val-NH2的合成与实施例9a类似，用31.2毫克(0.2毫摩尔)H-Val-NH2.HCl代替H-Ile-Ala-NH2.HCl。18小时后AC-Tyr-Val-NH2的产率理论值的65％。1H-NMR(D6-DMSO，300MHz)δ＝0,78-0,88(m，6H，Val-γCH3)，α＝1,92-2,00(m，1H，Val-βCH-)，δ＝2,58-2,68(m，1H，Tyr-βCH2-)，δ＝2,80-2,90(m，1H，Tyr-βCH2-)，α＝4,11(dd，1H，Val-αCH-)，δ＝4,28-4,38(m，1H，Tyr-αCH-)，δ＝δ,57(s，2H，AC-NH2)，δ＝6,08(d，1H，Tyr-αNH-)，δ＝6,62(d，2H，Tyr-ArH)，δ＝6,97(d，2H，Tyr-ArH)，δ＝7,03(s，1H，Val-NH2)，δ＝7,31(s，1H，Val-NH2)，δ＝7,67(d，1H，Val-αNH-)，δ＝9,12(s，1H，Tyr-OH)实施例11AC-Tyr-Met-NH2的合成与实施例9a类似，用37毫克(0.2毫摩尔)H-Met-NH2.HCl代替H-Ile-Ala-NH2.HCl。14小时后AC-Tyr-Met-NH2的产率理论值的75％。1H-NMR(D6-DMSO，300MHz)δ＝1,75-1,85(m，1H，Met-βCH2-)，δ＝1,88-2,00(m，1H，Met-βCH2-)，δ＝2,02(s，3H，Met-S-CH3)，δ＝2,30-2,45(m，2H，Met-βCH2-)，δ＝2,60-2,85(m，2H，Tyr-βCH2-)，δ＝4,15-4,28(m，2H，Tyr-αCH-，Met-αCH-)，δ＝5,65(s，2H，AC-NH2)，δ＝6,28(d，1H，Tyr-αNH-)，δ＝6,63(d，2H，Tyr-ArH)，δ＝6,97(d，2H，Tyr-ArH)，δ＝7,04(s，1H，Met-NH2)，δ＝7,25(s，1H，Met-NH2)，δ＝8,08(d，1H，Met-αNH-)，δ＝8,54(s，1H，Tyr-OH)实施例12AC-Tyr-Nvl-NH2的合成与实施例9a类似，用31.2毫克(0.2毫摩尔)H-Hvl-NH2.HCl代替H-Ile-Ala-NH2.HCl。14小时后AC-Tyr-Nvl-NH2的产率理论值的88％。1H-NMR(D6-DMSO，300MHz)δ＝0,85(t，3H，Nvl-δCH3)，δ＝1,18-1,32(m，2H，Nvl-γCH2-)，δ＝1,45-1,68(m，2H，nvl-βCH2-)，δ＝2,55-2,68(m，1H，Tyr-βCH2-)，δ＝2,78-2,88(m，1H，Tyr-βCH2-)，δ＝4,12-4,30(m，2H，Tyr-αCH-，Nvl-αCH-)，δ＝5,59(s，2H，AC-NH2)，δ＝6,02(d，1H，Tyr-αNH-)，δ＝6,62(d，2H，Tyr-ArH)，δ＝6,94-6,99(m，3H，2Tyr-ArH，1nvl-NH2)，δ＝7,21(s，1H，Nvl-NH2)，δ＝7,79(d，1H，Met-αNH-)，δ＝9,12(s，1H，Tyr-OH)实施例13AC-Tyr-Phe-NH2的合成与实施例9a类似，用40毫克(0.2毫摩尔)H-Phe-NH2.HCl代替H-Ile-Ala-NH2.HCl。1小时后AC-Tyr-Phe-NH2的产率理论值的86％。1H-NMR(D6-DMSO，300MHz)δ＝2,72-2,88(m，3H，-βCH2-)，δ＝1,98-3,06(m，1H，-βCH2-)，δ＝4,12-4,20(m，1H，-αCH-)，δ＝4,38-4,46(m，1H，-αCH-)，δ＝5,59(s，2H，AC-NH2)，δ＝5,97(d，1H，Tyr-αNH-)，δ＝6,61(d，2H，Tyr-ArH)，δ＝6,92(d，2H，Tyr-ArH)，δ＝7,08(s，1H，Phe-NH2)，δ＝7,15-7,28(m，5H，Phe-C6H5)，δ＝7,32(s，1H，Phe-NH2)，δ＝7,92(d，1H，Phe-αNH-)，δ＝9,12(s，1H，Tyr-OH)实施例14AC-Tyr-Phe-OMe的合成类似于实施例9a，用43毫克(0.2毫摩尔)H-Phe-OMe.HCl代替H-Ile-Ala-NH2.HCl。嗜热菌蛋白酶的用量为2毫克。14小时后AC-Tyr-Phe-OMe的产率理论值的81％。1H-NMR(D6-DMSO，300MHz)δ＝2,50-2,62(m，1H，-βCH2-)，δ＝2,72-2,85(m，1H，-βCH2-)，δ＝2,90-3,08(m，2H，-βCH2-)，δ＝3,58(s，3H，-O-CH3)，δ＝4,25-4,35(m，1H，-αCH-)，δ＝4,44-4,52(m，1H，-αCH-)，δ＝5,52(s，2H，AC-NH2)，δ＝5,99(d，1H，Tyr-αNH-)，δ＝6,62(d，2H，Tyr-ArH)，δ＝6,94(d，2H，Tyr-ArH)，δ＝7,15-7,30(m，5H，Phe-C6H5)，δ＝8,36(d，1H，Phe-αNH-)，δ＝9,14(s，1H，Tyr-OH)实施例15AC-Tyr-Ile-NH2的合成与实施例9a类似，用33.2毫克(0.2毫摩尔)H-Ile-NH2.HCl代替H-Ile-Ala-NH2.HCl。18小时后AC-Tyr-Ile-NH2的产率理论值的68.9％。1H-NMR(D6-DMSO，300MHz)δ＝0,76-0,86(m，6H，Ile-βCH3，Ile-γCH3)，δ＝0,99-1,12(m，1H，Ile-rCH2-)，δ＝1,35-1,46(m，1H，Ile-γCH2-)，δ＝1,62-1,76(m，1H，Ile-βCH-)，δ＝2,58-2,68(m，1H，Tyr-βCH2-)，δ＝2,79-2,88(m，1H，Tyr-βCH2-)，δ＝4,12(dd，1H，Ile-αCH-)，δ＝4,26-4,37(m，1H，Tyr-αCH-)，δ＝5,58(s，2H，AC-NH2)，δ＝6,06(d，1H，Tyr-αNH-)，δ＝6,62(d，2H，Tyr-ArH)，δ＝6,96(d，2H，Tyr-ArH)，δ＝7,02(s，1H，Ile-NH2)，δ＝7,31(s，1H，Ile-NH2)，δ＝7,68(d，1H，Ile-αNH-)，δ＝9,12(s，1H，Tyr-OH)实施例16AC-Tyr-Leu-NH2的合成与实施例9a类似，使用224毫克(1.0毫摩尔)AC-Tyr-OH，130毫克(1.0毫摩尔)H-Leu-NH2(BachemFeinchemikalien公司)，225微升缓冲剂，不使用NaOH，使用含有5毫克嗜热菌蛋白酶(希格玛，P1512)的50微升嗜热菌蛋白酶悬浮液。16小时后AC-Tyr-Leu-NH2的产率127.8毫克(＝理论值的38％)。1H-NMR(D6-DMSO，300MHz)δ＝0,80-0,92(m，6H，Leu-δCH3)，δ＝1,42-1,62(m，3H，Leu-γCH-，Leu-βCH2-)，δ＝2,58-2,70(m，1H，Tyr-βCH2-)，δ＝2,79-2,88(m，1H，Tyr-βCH2-)，δ＝4,16-4,30(m，2H，Leu-αCH-，Tyr-αCH-)，δ＝5,60(s，2H，AC-NH2)，δ＝6,02(d，1H，Tyr-αNH-)，δ＝6,63(d，2H，Tyr-ArH)，δ＝6,93-7,00(m，2H，Tyr-ArH，1H，Leu-NH2)，δ＝7,19(s，1H，Leu-NH2)，δ＝7,83(d，1H，Leu-αNH-)，δ＝9,15(s，1H，Tyr-OH)实施例17AC-Tyr-Ile-Gly-OMe的合成与实施例9a类似，用47.8毫克(0.2毫摩尔)H-Ile-Gly-OMe.HCl代替H-Ile-Ala-NH2.HCl。3小时后AC-Tyr-Ile-Gly-OMe的产率理论值的89％。1H-NMR；COSY(D6-DMSO，300MHz)δ＝0,76-0,88(m，6H，Ile-δCH3，Ile-γCH3)，δ＝1,00-1,14(m，1H，Ile-γCH2-)，δ＝1,36-1,52(m，1H，Ile-γCH2-)，δ＝l,65-1,78(m，1H，Ile-βCH-)，δ＝2,55-2,68(m，1H，Tyr-βCH2-)，δ＝2,75-2,86(m，1H，Tyr-βCH2-)，δ＝3,62(s，3H，-O-CH3)，δ＝3,84(t，2H，Gly-αCH2-)，δ＝4,27-4,35(m，1H，Ile-αCH-)，δ＝4,38-4,48(m，1H，Tyr-αCH-)，δ＝5,57(s，2H，AC-NH2)，δ＝6,05(a，1H，Tyr-αNH-)，δ＝6,61(d，2H，Tyr-ArH)，δ＝6,95(d，2H，Tyr-ArH)，δ＝7,79(d，1H，Ile-αNH)，δ＝8,32(t，1H，Gly-αNH-)，δ＝9,11(s，1H，Tyr-OH)实施例18AC-Tyr-Val-OBzl的合成与实施例16类似，用379.4毫克(1.0毫摩尔)H-Val-OBzl.pTos(BachemFeinchemikalien公司)代替H-Leu-NH2，并使用175微升缓冲剂，125微升10M的NaOH水溶液以及含有10毫克嗜热菌蛋白酶(希格玛P1512)的100微升嗜热菌蛋白酶悬浮液。88小时后AC-Tyr-Val-OBzl的产率230毫克(＝理论值的55％。)1H-NMR(D6-DMSO，300MHz)δ＝0,81-0,92(m，6H，Val-γCH3)，δ＝2,01-2,14(m，1H，Val-βCH-)，δ＝2,50-2,64(m，1H，Tyr-βCH2-)，δ＝2,75-2,85(m，1H，Tyr-βCH2-)，δ＝4,23(dd，1H，Val-αCH-)，δ＝4,36-4,45(m，1H，Tyr-αCH-)，δ＝5,13(s，2H，-O-CH2-)，δ＝5,52(s，2H，AC-NH2)，δ＝6,04(d，1H，Tyr-αNH-)，δ＝6,62(d，2H，Tyr-ArH)，δ＝6,96(d，2H，Tyr-ArH)，δ＝7,30-7，40(m，5H，-C6H5)，δ＝8,20(d，1H，Val-αNH-)，δ＝9,13(s，1H，Tyr-OH)实施例19AC-Tyr-Phe-Ala-OBzl的合成与实施例9a类似，用88毫克(0.2毫摩尔)H-Phe-Ala-OBzl.TFA代替H-Ile-Ala-NH2.HCl。3小时后AC-Tyr-Phe-Ala-OBzl的产率理论值的72％。1H-NMR；COSY(D6-DMSO，300MHz)δ＝1,33(d，3H，Ala-βCH3)，δ＝2,48-2,58(m，1H，Tyr-βCH2-)，δ＝2,70-2,85(m，2H，Tyr-βCH2-)，δ＝2,95-3,05(m，1H，Phe-βCH2-)，δ＝4,14-4,24(m，1H，Tyr-αCH-)，δ＝4,32-4,41(m，1H，Ala-αCH-)，δ＝4,51-4,62(m，1H，Phe-αCH-)，δ＝5,13(s，2H，O-CH2-)，δ＝5,56(s，2H，AC-NH2)，δ＝5,94(d，1H，Tyr-αNH-)，δ＝6,60(d，2H，Tyr-ArH)，δ＝6,90(d,2H，Tyr-ArH)，δ＝7,14-7,28(m，5H，OBzl-C6H5)，δ＝7,30-7,40(m，5H，Phe-C6H5)，δ＝8,01(d，1H，Phe-αNH)，δ＝8,46(d，1H，Ala-αNH-)，δ＝9,12(s，1H，Tyr-OH)实施例20AC-Met-Phe-NH2的合成与实施例9a类似，用76.8毫克(0.2毫摩尔)AC-Met-OH代替AC-Tyr-OH，并使用80毫克(0.4毫摩尔)H-Phe-NH2.HCl(德古萨公司)，90微升缓冲剂，50微或10M的NaOH水溶液以及含有2毫克嗜热菌蛋白酶(希格玛，P1512)的20微升嗜热菌蛋白酶的悬浮液。3小时后AC-Met-Phe-NH2的产率理论值的96％。1H-NMR(D6-DMSO，300MHz)δ＝1,58-1,80(m，2H，Met-βCH2-)，δ＝1,99(s，3H，Met-S-CH3)，δ＝2,25-2,36(m，2H，Met-γCH2-)，δ＝2,76-2,88(m，1H，Phe-βCH2-)，δ＝2,98-2,08(m，1H，Phe-βCH2-)，δ＝3,98-4,08(m，1H，-αCH-)，δ＝4,36-4,47(m，1H，-αCH-)，δ＝5,63(s，2H，AC-NH2)，δ＝6,23(d，1H，Met-αNH-)，δ＝7,09(s，1H，Phe-NH2)，δ＝7,12-7,28(m，5H，Phe-C6H5)，δ＝7,42(s，1H，Phe-NH2)，δ＝7,96(d，1H，Phe-αNH-)实施例21AC-Leu-Phe-NH2的合成与实施例20类似，用69.6毫克(0.4毫摩尔)AC-Leu-OH代替AC-Met-OH。70小时后AC-Leu-Phe-NH2的产率理论值的97％。1H-NMR(D6-DMSO，300MHz)δ＝0,78-0,88(m，6H，Leu-δCH2-)，δ＝1,16-1,35(m，2H，Leu-βCH2-，Leu-γCH-)，δ＝1,45-1,56(m，1H，Leu-βCH2-)，δ＝2,78-2,90(m，1H，Phe-βCH2-)，δ＝2,99-3,08(m，1H，Phe-βCH2-)，δ＝3,90-4,00(m，1H，-αCH-)，δ＝4,36-4,45(m，1H，-αCH-)，δ＝5,58(s，2H，AC-NH2)，δ＝6,08(d，1H，Leu-αNH-)，δ＝7,06(s，1H，Phe-NH2)，δ＝7,12-7,28(m，5H，Phe-C6H5)，δ＝7,34(s，1H，Phe-NH2)，δ＝7,82(d，1H，Phe-αNH-)实施例22以氨基甲酰基-天冬酰氨为例用酶技术通过裂解方法除去氨基甲酰基保护基团先将16毫升(65.5U)氨基甲酰酶和50.6毫克嗜热菌蛋白酶一起加入水中并搅拌过夜(大约18小时)。向其中加入470毫克氨基甲酰基-天冬酰氨(1.25毫摩尔)。总体积大约为16毫升。pH在6.5-7.0之间。24小时后，检测不到氨基甲酰基-天冬酰氨。通过HPLC校准，天冬酰氨的转化率达98.3％。实施例23以氨基甲酰基-L-天冬酰氨为例用亚硝酸钠通过裂解方法除去氨基甲酰基保护基团首先将4.72克(12.6毫摩尔)氨基甲酰基-L-天冬酰氨钠盐加入到60毫升H2O/40毫升HCl(浓盐酸，工业级)中，将混合物冷至5℃(pH＝0.80)，慢慢计量加入(1毫升/10分钟)15.1毫升(15.1毫摩尔)的NaNO2溶液。将混合物反应约1小时，然后用50％(重量)的氢氧化钠溶液对反应混合物进行中和。在室温使反应混合物过夜，将分离出的沉淀除去。将母液浓缩，直至天冬酰氨沉淀析去。在真空下于60℃干燥所得的天冬酰氨至恒重。该反应定量进行。权利要求1.制备通式I所示的肽的方法，其中R1和R2彼此独立，表示氢，(C1-C6)的烷基，这些烷基可任意地被杂原子，例如N、O或S中断或取代一次或多次，这些杂原子也可以被氢、(C1-C4)的烷基或苄基取代或通过双键与烷基键合；苯基或苄基，这二者都可任意地被卤素或羟基取代一次或多次；杂芳烷基，例如3-吲哚甲基，2-，3-或4-吡啶甲基；R3表示(C1-C4)的烷基，NH2，羟基，NR1R2，可任意地被卤素，硝基、NH2、(C1-C4)的烷氧基取代一次或多次的苄氧基，或下式II表示的一种或多种单元其特征在于将式III表示的化合物或其盐其中，R1，R2和R3的定义同上，R4表示氢，(C1-C4)的烷基，可任意被卤素、(C1-C4)的烷基、(C1-C4)的烷氧基、硝基、CN、CF3、(C1-C0)的烷氧基羰基、COOH或-N1R2取代一次或多次的苯基，芳烷基，例如可被卤素、(C1-C4)的烷基或(C1-C4)的烷氧基取代的苄基，萘基，杂芳烷基，例如2-，3-或4-噻吩基、2-，3-或4-吡啶基或2-喹啉基，与一种氨基甲酰酶在有或没有溶剂的情况下反应，或者在有或没有溶剂或一种酸的情况下，将氨基甲酰基保护基团化学裂解除去。2.制备通式III所示肽的方法，其中，R1和R2彼此独立，表示氢，(C1-C6)的烷基，这些烷基可任意地被杂原子，例如N、O或S中断或取代一次或多次，这些杂原子也可以被氢、(C1-C4)的烷基或苄基取代或通过双键与烷基键合；苯基或苄基，这二者都可任意地被卤素或羟基取代一次或多次；杂芳烷基，例如3-吲哚甲基，2-，3-或4-吡啶甲基；R3表示(C1-C4)的烷基，NH2，羟基，NR1R2，可任意地被卤素，硝基、NH2、(C1-C4)的烷氧基取代一次或多次的苄氧基；R4表示氢，(C1-C4)的烷基，可任意被卤素，(C1-C4)的烷基、(C1-C4)的烷氧基、硝基、CN、CF3、(C1-C9)的烷氧基羰基、COOH或-NR1R2取代一次或多次的苯基，芳烷基，例如可被卤素，(C1-C4)的烷基或(C1-C4)的烷氧基取代的苄基，萘基，杂芳烷基，例如2-，3-或4-噻吩基，2-，3-或4-吡啶基或2-喹啉基，其特征在于将式IV表示的化合物或其盐，其中R1和R4的定义同上，与式V表示的化合物或其酸加成的盐反应，其中R2和R3的定义同上，反应中可以有或没有溶剂，可选择地使用一种碱。3.权利要求1的方法，其特征在于所述的与氨基甲酰酶的反应在10℃-50℃温度范围内进行，优选为20℃-35℃，特别优选为25℃-30℃。4.权利要求1的方法，其特征在于所述的与氨基甲酰酶的反应在pH为5-11的范围内进行，pH优选为6.5-8。5.根据前述权利要求之一的方法，其特征在于，所述的氨基甲酰酶来自微生物DSM7329，DSM7330或DSM9771。6.根据前述权利要求之一的方法，其特征在于，所用的氨基甲酰酶可选择性地是部分纯化的或纯化的。离析出来的或固定化状态的。7.权利要求1的方法，其特征在于，用一种NO+给体，优选用NaNO2或NO+BF4-裂解除去氨基甲酰基保护基团。8.权利要求7的方法，其特征在于，所述的裂解除去保护基团的反应在+120°至-30℃温度范围内进行，优选为+60°至-20℃，特别优选为25℃至0℃。9.权利要求7的方法，其特征在于，所述的反应是在加入一种酸且pH范围为-0.5至5，优选为0至2的情况下进行的。10.权利要求3或7的方法，其特征在于，所述的反应发生于含水介质中。11.根据前述权利要求之一的方法，其特征在于，被解离的肽衍生物是天冬甜精。12.权利要求2的方法，其特征在于，肽的偶联是在一种高稠度的悬浮液中进行的。13.权利要求12的方法，其特征在于，基质和产物部分以固体的形式存在。14.天冬甜精作为一种增甜剂的应用。全文摘要本发明涉及用酶催化制备有保护的二和寡肽以及除去所用的保护基团的方法。本发明的方法可以简单、经济地合成肽,并能小心地除去保护基团。本发明的方法包括三个反应步骤:1、制备N－氨基甲酰基－氨基酸或N－氨基甲酰基氨基酸的衍生物;2、在氨基甲酰基保护的亲电试剂和亲核试剂之间形成肽键;和3、除去氨基甲酰基保护基团。文档编号C07K1/00GK1190406SQ96195353公开日1998年8月12日申请日期1996年6月26日优先权日1995年7月11日发明者安德烈亚斯·博马留斯,卡尔海因茨·德劳兹,乌韦·艾克霍恩,汉斯－迪特尔·雅各布克,马蒂亚斯·科滕哈恩申请人:德古萨股份公司