专利名称：一种用于富集磷酸化肽段的聚合物材料的制备方法
技术领域：
本发明涉及磷酸化肽段的分离纯化，具体的说是一种用于富集磷酸化 肽段的聚合物材料的制备方法。
背景技术：
蛋白翻译后修饰位点的鉴定是目前蛋白组学研究中重要挑战之一，磷 酸化修饰是蛋白翻译后最重要的修饰之一。因为可逆的蛋白磷酸化修饰反 应在细胞的信号传导，新陈代谢等方面调节着蛋白的活性功能。最近，质 谱技术在蛋白磷酸化的定性中，已经发展成为重要的工具之一。在磷酸化 蛋白酶解产物的磷酸化肽段质谱分析中，由于酶解产物中存在大量的非磷 酸化肽段，这些肽段在离子化过程中产生的离子信号会淹没磷酸化肽段的 离子信号，另一方面因为磷酸化肽段在质谱检测中相对较低的离子化效率， 这些因素导致了磷酸化肽段在质谱中很难被检测。从磷酸化蛋白的酶解混 合物中分离和富集磷酸化肽段是目前进行磷酸化研究的比较理想的方法， 也是成功实现质谱分析最关键的一步。为了提高对磷酸化肽段的检测，亲 和技术被应用到从复杂的混合样品中纯化和富集磷酸化肽段。最常用的亲
和技术是固定化金属离子螯合亲和色谱(IMAC)，磷酸肽在IMAC上的保留 是基于其与固定相的螯合离子之间的螯合作用。常用的金属离子是铁(Fe,
和镓(Ga3、 一般利用亚氨基二乙酸(IDA)为螯合基团将金属离子固载在 色谱介质上。虽然基于铁和镓的IMAC很常用，但是其特异性不强， 一些 酸性肽也会保留从而干扰磷酸肽的检测。
基于利用锆离子和磷酸基团之间的强烈相互作用，最近我们发展 出了基于磷酸酯锆的新IMAC方法(Zr"-IMAC)。与常规IMAC相比， 该方法对磷酸化肽有更好的特异性。不同于 一 般的IMAC,在Zr4+-IMAC 中所用的螯合基团也是磷酸基团。在使用中首先将锆离子固载于磷酸基 团修饰的介质表面上形成磷酸酯锆表面，磷酸化肽由于其磷酸基团与 锆离子之间的强相互作用而获得特异性保留。为了制备这种带有磷酸基 团的色谱吸附材料，需要对材料表面进行改性，这需要多步化学反应，因 此比较费时费力。本发明提供了一种更为简单的制备这种材料的方法。
发明内容
本发明目的在于提供一种用于富集磷酸化肽段的吸附材料的制备方 法。该方法利用带磷酸基团的单体进行聚合反应形成带磷酸基团的聚合物， 该聚合物敖合Zr"后，可用于磷酸化肽的高特异性富集。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为
一种用于富集磷酸化肽段的聚合物材料的制备方法，采用带有烯键和磷酸基团的化合物单体，进行聚合反应，形成磷酸基团聚合物，该材料经 与锆离子作用后生成磷酸酯锆基团，可用于富集磷酸化肽段等带有磷酸基
团白勺化合物。
所述带有烯键和磷酸基团的化合物具有如式(I)结构，
<formula>formula see original document page 4</formula>
(i)
R为CH2、 CH2CH2、 CH2CH2CH2之一，磷酸基团以磷酸酯键存在于 单体中，为磷酸一酯。 具体过程为，
1) 以采用带有烯键和磷酸基团的化合物为功能单体、亚甲基双丙烯酰 胺作为交联剂，加入有机致孔剂，形成反应物料，进行热引发聚合反应， 形成磷酸基团聚合物；
功能单体与交联剂的质量比为75-85: 55-65，致孔剂的加入量为反应 物料体积的75~85%;反应温度为50 80 °C;
2) 将磷酸基团聚合物与10-lOOmM锆离子溶液接触，生成磷酸酯锆基 团，其可用于富集磷酸化肽段或带有磷酸基团的化合物。
本发明具有如下优点
本发明利用带磷酸酯基团的单体进行聚合反应直接形成带磷酸基团的 聚合物，其聚合物材料可以制备成整体柱模式，也可以制备成颗粒状态。
该方法通过聚合反应的方法直接制备出带有磷酸基团的吸附材料，不 用对材料进行额外的化学反应，因而具有简单、方便的特点。
图1为单体2—(甲基丙烯酰氧)乙基磷酸酯与交联剂亚甲基双丙烯酰 胺聚合反应的化学表达式。
图2为聚合物吸附材料富集和检测磷酸肽的过程。
图3为聚合物整体材料对磷酸化蛋白-酪蛋白酶解液中的磷酸化肽 段的的富集和纯化的MALDI质谱图。
图4为聚合物整体材料对磷酸化蛋白-酪蛋白酶解液中的磷酸化肽 段的富集和纯化的MALDI质谱图。
图5为聚合物颗粒材料对磷酸化蛋白-酪蛋白酶解液中的磷酸化肽 段的的富集和纯化的MALDI质谱图。
图6为聚合物颗粒材料对磷酸化蛋白-酪蛋白酶解液中的磷酸化肽 段的富集和纯化的MALDI质谱图。
具体实施例方式
本发明通过利用带磷酸酯基团的单体与交联剂聚合反应生成带有磷酸基团的聚合物，该聚合物敖合21"4+后可用于磷酸化肽的富集。为了制备聚合 物材料，首先需要配制聚合物反应液。单体和交联剂是反应液的主要成份， 它们发生聚合反应后形成聚合物骨架。为了调节聚合物的物理化学性质， 可以使用多种单体，但其中必须包括一种带有磷酸基团的单体。多孔材料 有更大的表面积，因此有更高的吸附容量。为了制备多孔的聚合物，需要 在反应液中加入一定比例的致孔剂。致孔剂是一些有机溶剂，它们不参与 聚合反应，在聚合反应发生后它们所占据的空间将形成孔。通过调节致孔 剂在反应液中的比例可以很方便的调节聚合物中孔的大小和机械强度。此 外， 一般还需要加入少量的引发剂来引发聚合反应。获得带有磷酸基团的
聚合物后，将聚合物浸泡在Zr"的溶液(如ZrOCl2溶液)中，Zr"离子由于与 聚合物上的磷酸基团有强相互作用而固载在聚合物材料上，形成磷酸酯锆 修饰的表面。磷酸酯锆修饰的聚合物材料可以用于选择性提取蛋白质酶解 液中的磷酸肽。
单体2—(甲基丙烯酰氧)乙基磷酸酯与交联剂亚甲基双丙烯酰胺聚合 反应生成的聚合物具有很好的亲水性，因此非特异性很小，是亲和色谱良 好的载体。以下两实施例均采用上述体系，但本发明并不局限于上述体系。
实施例l聚合物整体柱的制备
整体柱是一种特殊的液相色谱柱，它是将聚合物反应液灌入柱管中通 过原位聚合的方法形成多孔的、连续的聚合物。聚合物整体柱由于有很多 通孔而柱压很低，由于对流传质而传质阻力很小，非常适合用于样品预处 理。本实施例制备了带磷酸基团的聚合物整体毛细管柱并将其用于磷酸肽 的富集。
1) 毛细管预处理
首先用0.1M NaOH溶液冲洗毛细管空柱1 h,再用去离子水冲洗毛细 管至流出液体pH值为7.0,然后用甲醇溶液冲洗毛细管柱10min,用氮气吹 干。往毛细管中注入甲醇与甲基丙烯酰氧丙基一三甲氧基硅烷的混合物。 在20度至70度温度下反应5—24小时。然后用甲醇及水冲洗。最后用氮 气欢干待用。
2) 聚合物整体柱的制备
以2— (甲基丙烯酰氧)乙基磷酸酯为功能单体，亚甲基双丙烯酰胺 为交联剂，十二醇，二甲基亚砜和N,N-二甲基甲酰胺为致孔剂，单体、交 联剂、致孔剂按质量百分比分别为13%、 10%和77%均匀混合，所加引发 剂的用量为聚合物单体用量的1%，将混合液用超声振荡15min后，将反应 液吸入已经预处理过的空毛细管中，将毛细管的两端用橡胶小塞封口并浸 于6(TC水浴中反应8-24h。反应完成后，以甲醇为流动相，用液相色谱泵 冲洗毛细管柱约2h，去除床层内的致孔剂、残留反应试剂以及反应产生的 一些低聚合度物质；
如图1所示，单体、引发剂及致孔剂在反应开始前构成稳定的均相反应体系，当温度升高到一定值时，引发剂分解产生自由基引发聚合反应。 当反应进行到一定的程度时，聚合物链从溶液中沉降出来形成稳定的分散
体系，经进一步聚合、交联硬化形成直径约为1 pm左右的小颗粒。这些颗
粒以化学键互相连接形成较大的"簇"，这些"簇"最终堆积形成一个完整的聚 合物体系。由于所采用的单体，2— (甲基丙烯酰氧)乙基磷酸酯，有一个 磷酸基团，该基团在聚合反应过程中不发生反应，从而使产生的聚合物材 料表面带有磷酸基团。该材料敖合锆离子后，形成对磷酸肽有特异性吸附 作用的磷酸酯锆吸附材料。
3) 锆离子的固载
用20mM二氯氧锆溶液冲洗毛细管，使聚合物柱床上的磷酸基团与锆 形成稳定的配合物，然后用pH为2的甲酸溶液冲洗，备用。
4) 磷酸肽的选择性富集
样品溶液的制备1 mg的a-酪蛋白和|3-酪蛋白的分别溶解在lmL, 50 mM的碳酸氢胺溶液中(pH8.2)，按照与胰蛋白酶的质量比40:1的比例加 入胰蛋白酶进行酶解反应，反应时间为16h,酶解温度控制在37t:。获得 的蛋白酶解溶液置于-3(TC冰箱中保存备用。
磷酸化肽段的富集用甲酸调节-酪蛋白酶解液的pH为2，取2pmol含 50%乙腈的酶解液通过15cm的整体柱，依次用含200 mM氯化钠pH 2的 甲酸溶液，pH2的甲酸溶液，冲洗毛细管，最后用pH 10的氨水溶液冲洗 毛细管，使富集的磷酸化肽段洗脱到离心管中，冷冻干燥后，经基质辅助 激光解吸离子化飞行时间质谱(MALDI)检测，获得的谱图见图3，图中 序号1的[M+H;T为2061.83，其所对应的肽段上带有1个磷酸化位点；
序号2的[M+H]+为2352.85，其所对应的肽段上带有4个磷酸
化位点；
序号3的[M+H广为2966.16，其所对应的肽段上带有4个磷酸
化位点；
在图3中的强峰均为磷酸肽的峰，这说明磷酸肽在磷酸酯锆修饰的整 体柱中获得了特异性富集。用整体柱富集ot-酪蛋白酶解液样品同-酪 蛋白，所获得的谱图见附图4，
图中序号1的[M+Hr为1237.5，其所对应的肽段上带有1个磷酸化位点； 序号2的,+司+为1331.53，其所对应的肽段上带有1个磷酸化位点； 序号3的[M+H]"为1411.5，其所对应的肽段上带有2个磷酸化位点； 序号4的[M+H]"为1466.61，其所对应的肽段上带有1磷酸化位点； 序号5的[M+Hf为1539，其所对应的肽段上带有2个磷酸化位点； 序号6的[M+Hf为1594.7，其所对应的肽段上带有1磷酸化位点； 序号7的[M+Hf为1660.79，其所对应的肽段上带有1磷酸化位点； 序号8的[M+H犷为1832.83，其所对应的肽段上带有1磷酸化位点; 序号9的[M+H广为1847.69，其所对应的肽段上带有1磷酸化位点；序号10的[]^+司+为1927.69，其所对应的肽段上带有2酸化位点； 序号11的[M+Hf为1944，其所对应的肽段上带有2个磷酸化位点； 序号12的[]\4+司+为1951.95，其所对应的肽段上带有1磷酸化位点; 序号13的[]\4+司+为2079.04，其所对应的肽段上带有1磷酸化位点; 序号14的[M+Hf为2619.04，其所对应的肽段上带有4磷酸化位点; 序号15的[14+司+为2720.91，其所对应的肽段上带有5磷酸化位点; 序号16的[M+H]+为3008.01，其所对应的肽段上带有4磷酸化位点； 序号17的[M+Hf为3087.99，其所对应的肽段上带有5磷酸化位点； 很明显用该整体柱处理后磷酸化肽获得很好的富集。 本发明制备的材料主要用于高特异性的富集磷酸肽，由于磷酸酯锆与 磷酸基团有强相互作用，其也可以用于富集其它含磷酸基团的化合物；如 图2所示，其给出了利用本吸附材料富集和检测磷酸肽的过程。从单个蛋 白质的酶解液中纯化出来的磷酸肽可以直接使用MALDI质谱仪来分析，而 对于复杂样品如蛋白质组样品中提纯出来的磷酸化肽需要利用液质联用和 数据库检索来鉴定其中的磷酸化肽。
实施例2 聚合物颗粒的制备
绝大多数液相色谱柱、固相萃取柱都使用颗粒状填料如琼脂糖颗粒、 有机聚合物颗粒、无机物颗粒作为固定相，本实施例制备了带磷酸基团的 聚合物颗粒并将其用于磷酸肽的富集。
1)聚合物颗粒的制备 把聚合反应液(配比同实施例1)装于离心管中，封口并浸于60°C水 浴中反应8-24h。反应完成后，研磨成颗粒用甲醇浸泡除去致孔剂、残留反 应试剂以及反应产生的一些低聚合度物质。
2) 锆离子的固载
制备的颗粒浸泡在20mM二氯氧锆溶液，振荡15分钟，离心，收集沉 积物，得到磷酸酯锆聚合物颗粒
3) 磷酸化肽段的富集
取2 pmol -酪蛋白酶解液放入含有0.4 mg颗粒的100mM氯化钠，50 X乙腈pH2的甲酸溶液中，振荡，离心后，弃去上清液，用200mM氯化 钠pH 2的甲酸溶液洗涤沉积物，离心后，弃去上清液，用pH2的甲酸溶 液洗涤沉积物，离心后，弃去上清液，最后用pH 10的氨水溶液处理沉积 物，离心后收集上清液，冷冻干燥后，用MALDI分析，谱图见附图5。 使用相同的方法用于-酪蛋白酶解液中磷酸化肽段的富集，所获得的 MALDI谱图见附图6。从谱图上看，显著的峰都是磷酸肽的峰，说明 磷酸肽在聚合物颗粒上有高特异性的富集。
权利要求
1. 一种用于富集磷酸化肽段的聚合物材料的制备方法，其特征在于采用带有烯键和磷酸基团的化合物单体，进行聚合反应，形成磷酸基团聚合物，该材料经与锆离子作用后生成磷酸酯锆基团，可用于富集磷酸化肽段等带有磷酸基团的化合物。
2. 按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述带有烯键和 磷酸基团的化合物具有如式(I)结构，<formula>formula see original document page 2</formula>(i)R为CH2、 CH2CH2、 CH2CH2CH2之一，磷酸基团以磷酸酯键存在 于单体中，为磷酸一酯。
3. 按照权利要求l所述的制备方法，其特征在于 具体过程为，1) 以采用带有烯键和磷酸基团的化合物为功能单体、亚甲基双丙烯酰 胺作为交联剂，加入有机致孔剂，形成反应物料，进行热引发聚合反应， 形成磷酸基团聚合物；功能单体与交联剂的质量比为75-85: 55-65，致孔剂的加入量为反应 物料体积的75~85%;反应温度为50 8(TC;2) 将磷酸基团聚合物与10-lOOmM锆离子溶液接触，生成磷酸酯锆基 团，其可用于富集磷酸化肽段或带有磷酸基团的化合物。
4. 按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述致孔剂为十二 醇，二甲基亚砜和N,N-二甲基甲酰胺，十二醇、二甲基亚砜和N,N-二甲基 甲酰胺的体积比为18-22: 25 -30: 3-7。
5. 按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于引发剂为偶氮二异 丁腈、正丁基锂或硫酸铵或硫代硫酸钠，引发剂的加入量为功能单体与交 联剂总重量的0.1~5%。
全文摘要
本发明涉及磷酸化肽的高选择性富集，具体的说是一种用于富集磷酸化肽段的聚合物材料的制备方法。本方法采用带有磷酸基团的单体进行聚合反应直接形成带有磷酸基团的聚合物材料。该材料用含锆离子的溶液作用后生成磷酸酯锆基团，使其可以从复杂的蛋白酶解液中特异地富集和纯化磷酸肽。本发明采用聚合的方法直接合成出含功能基团的聚合物材料，无需额外化学改性，具有简单方便的特点。
文档编号B01J20/281GK101412778SQ20071015752
公开日2009年4月22日 申请日期2007年10月17日 优先权日2007年10月17日
发明者叶明亮, 周厚江, 靖 董, 邹汉法 申请人:中国科学院大连化学物理研究所