专利名称：一种用于含组氨酸肽段富集与测序的方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白质的测序方法及试剂盒；具体的说，本发明涉及一种含组氨酸肽段的色谱富集与质谱测序的方法和试剂盒。
背景技术：
随着质谱技术的发展，生物质谱在蛋白质的测序及鉴定中发挥着越来越重要的作用。但由于蛋白质分子太大，现有的质谱仪难以通过对整个蛋白质分子进行直接测序来鉴定未知蛋白质，而是先采用化学法或酶法将蛋白质分子切成较小的肽段，再对肽段进行测序。又由于蛋白质组含有很多种蛋白质，体系非常复杂，在质谱分析前必须进行分离，以降低体系的复杂程度。根据实验操作中蛋白质分离或酶切的先后次序的不同，当前的蛋白质组学技术策略可以粗分为“从上到下(Top-down)”和“从下到上(Bottom-up)”两大类。前者是先把复杂的蛋白质混合物进行多维分离，再把得到的单个蛋白质或简单混合物酶切后进行质谱分析；后者是先把复杂的蛋白质混合物进行全酶切，对肽段混合物进行多维分离后再进行质谱分析。由于分离技术本身或分离与后续鉴定的衔接上存在缺陷，如蛋白质色谱分离的分辨率及回收率不高，二维电泳不适于分离强疏水性的或极端等电点和分子量的蛋白质，以及不易实现操作的自动化及与质谱的在线联用，“从上到下”策略的应用受到很多限制。所以“从下到上”策略越来越受重视，得到越来越广泛的应用。
“从下到上”策略的优点是肽段分子小，利于色谱分离及与质谱的在线联用，但缺点是肽段混合物过于复杂，对色谱的分离效率提出了很大挑战，而且高丰度蛋白质的肽段和低丰度蛋白质的肽段可能共洗脱，从而影响低丰度蛋白质的鉴定。因此，降低肽段混合物的复杂程度，提高分离效率，减少高低丰度肽段的共洗脱，是该技术策略的关键。由于蛋白质数据库和标签肽(signature peptide)的存在，并不需要对蛋白质的所有肽段进行鉴定，而只要鉴定出一个或少数几个标签肽，就可以对整个蛋白质分子进行鉴定。这就为采用化学修饰辅助技术或亲合色谱技术分离富集具有代表性的标签肽，通过简化样品体系实现对整个蛋白质组的分析与鉴定提供了基础。
组氨酸是蛋白质分子中丰度相对较低的一种氨基酸，含组氨酸的肽段在所有肽段中所占比例较低，而绝大多数蛋白质都含有组氨酸肽段。据统计，Swiss Prot 46.0版人类蛋白质数据库中的11,936个蛋白质经理论酶切可产生694,584个肽段，其中只有127,143个(占18.3％)含组氨酸肽，却可以覆盖97.1％的蛋白质。因此，富集组氨酸肽段可以大大降低肽段混合物的复杂程度。文献中基本采用固相金属亲合色谱(IMAC)技术来富集组氨酸肽[1-4]，Regnier等对该方法的选择性、回收率、重现性、特异性和柱寿命都进行了考察，发现其选择性、回收率及重现性受洗脱条件的影响很大，对标准蛋白中组氨酸肽的捕获效率为85％，还观察到非特异结合及金属离子的丢失[5]。更重要的是，这些未经化学修饰的肽段的质谱裂解行为比较复杂，影响了其二级质谱图的质量及对其序列的分析。有文献报道[6-7]，在胰酶酶切肽段的N端引入磺酸基，可以促进肽段的裂解并简化其二级质谱图，使其二级质谱图中出现连续的y离子，使二级质谱图的解析及肽序列的分析非常简单，也提高了蛋白质鉴定的可信度。
发明内容
本发明提供了一种简单有效，既可富集含组氨酸肽，又可促进其质谱测序，提高蛋白质鉴定可信度的方法。该方法包括以下步骤(1)用还原剂打开蛋白质分子中的二硫键，破坏其高级结构；用烷基化试剂封闭巯基，防止其重新形成二硫键；(2)用化学消化或酶消化法对蛋白质进行消化，产生适于质谱分析的肽段；用试剂对酶切肽段的侧链氨基进行保护；(3)对肽段进行化学修饰和处理并进行质谱分析；其特征在于所述步骤(3)的处理方法为(a)用一种或多种化学试剂，对肽段的N端氨基进行修饰，使其带上酸性基团；(b)对肽段样品进行脱盐；(c)用阳离子交换色谱柱分离富集含组氨酸肽；(d)用质谱使含组氨酸肽裂解产生碎片离子的质谱图，对质谱数据进行解析，鉴定产生含组氨酸肽的蛋白质。
其中，步骤(a)中所述酸性基团选自下述磺酸衍生物中的一种或多种2-磺基乙酰基，3-磺基丙酰基，2-磺基苯甲酰基或3-磺基苯甲酰基。
步骤(b)中所述脱盐的方法为反相色谱法，优选在线联用反相色谱法。
步骤(d)中所述质谱选自MALDI串联质谱、电喷雾离子化串联质谱或液一质联用串联质谱，优选MALDI串联质谱；所述质谱数据的解析及蛋白质的鉴定方法优选使用商品软件或数据库搜索。
该方法在蛋白质酶切肽段的N末端加上较强的酸性基团，通过离子交换色谱分离富集含组氨酸肽以降低肽段混合物的复杂程度，然后进行质谱分析以鉴定原蛋白质。加在N端的酸性基团在离子交换色谱条件下带负电荷，中和了肽段C端碱性氨基酸残基所带的正电荷，使占大多数的非组氨酸肽所带净电荷为零，而占小部分的含组氨酸肽仍带正的净电荷，从而实现在离子交换色谱中含组氨酸肽的分离与富集。在质谱分析中，C端碱性氨基酸残基被质子化的同时，N端的酸性基团被去质子化，两者的电荷互相中和，带有弱碱性氨基酸残基的含组氨酸肽相对于非组氨酸肽，在正离子分析模式中更易于捕获质子而被电离，因而具有较高的离子化效率和检测灵敏度。而且，碱性较弱的组氨酸残基并不影响离子化该肽段的另一个质子沿肽骨架的“自由”移动和酰胺基的随机质子化。本发明通过上述原理得以实现。
利用本方法，大大降低了肽段混合物的复杂程度，显著提高了含组氨酸肽被质谱检出的机会及其在二级质谱中的裂解效率，使碎片离子的信噪比大大提高，二级质谱图的质量明显改善，可根据二级质谱图实现对含组氨酸肽的从头测序。
另一方面，本发明还提供了一种用于含组氨酸肽段富集与测序的试剂盒，该试剂盒的组分包含(a)一种或多种对肽段的N端氨基进行修饰，使其带上酸性基团的试剂；(b)一种或多种能进行肽段脱盐和阳离子交换色谱分离的设备；(c)一种或多种用于肽段脱盐和阳离子交换色谱分离的缓冲体系。
其中，组分(a)优选具磺酸基的酰化试剂；组分(b)优选在线联用型的常规分析色谱柱或枪头式填充小柱。
为方便使用，该试剂盒还可包含以下组分中的一种或多种用于打开蛋白质分子中二硫键的还原剂，如二硫苏糖醇(DTT)和三羧乙基膦(TCEP)；封闭巯基防止其重新形成二硫键的烷基化试剂，如碘乙酰胺和碘乙酸；蛋白质消化剂，如胰蛋白酶；侧链氨基保护试剂，如O-甲基异脲；此外还可含有一种或多种消化辅助剂；国家行政机关批准的使用说明等。
本发明的新方法和试剂盒适用于蛋白质或多肽混合物中含组氨酸肽段蛋白质的富集和质谱测序，特别适用于生物学、医学和药物学领域中进行蛋白质或蛋白质组分析。本发明的方法和试剂盒具有广泛的实用性。用途包括但不限于在医学、药学、农业和畜牧业等领域进行各种动植物和微生物的蛋白质组研究。
图1.从马心肌红蛋白酶切肽段中富集到的含组氨酸肽的质谱图，带*号者为含组氨酸肽。
图2.含组氨酸肽(VEADIAGHGQEVLIR，17-3 1)的二级质谱图。
图3.从牛乳球蛋白酶切肽段中富集到的含组氨酸肽的质谱图，带*号者为含组氨酸肽。
图4.含组氨酸肽(ALPMHIR，142-148)的二级质谱图。
具体实施例方式
下面的实施例将对本发明作进一步的解释，但是本发明并不仅仅局限于这些实施例，这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。本领域的技术人员在权利要求的范围内所做出的某些改变和调整也应认为属于本发明的范围。
实施例1 马心肌红蛋白中含组氨酸肽段的富集与测序1.1取1mg马心肌红蛋白，溶于1mL 0.2M pH 8的硼酸盐溶液。肌红蛋白不含半胱氨酸残基，故可省去还原烷基化步骤。加入20ug胰蛋白酶，37℃酶切12小时。加入0.1M o-甲基异脲，用氢氧化钠调至pH 11，37℃反应4小时后，再用盐酸调pH值为8，加入20mM的邻磺基苯甲酸酐，室温反应1小时。
1.2在依利特P230液相色谱仪(大连依利特公司)上，用C18-反相色谱柱(200×4.6mm，5um，300，大连依利特公司)与强阳离子交换色谱柱(200×4.6mm，5um，300，大连依利特公司)串联，进行组氨酸肽段的富集。先用0.1％三氟乙酸(TFA)平衡色谱系统，上样后用10倍柱体积的0.1％三氟乙酸(TFA)洗柱脱盐，再用60％甲醇(含1％乙酸)洗柱，最后用60％甲醇(含0.5M氯化钠，1％乙酸)洗脱并收集馏份。
1.3质谱分析在装备了氮激光器(337nm)的4700 Proteomics Analyzer质谱仪(美国应用生物系统公司)上进行。先在样品靶上点0.6uL基质溶液(5mg/mL α-氰基-4-羟基肉桂酸，用含0.1％TFA的50％乙腈配制)，干后再点0.6uL馏份，自然挥干后进行质谱分析。先用肽标准物进行外部质量校准，质量测量的准确度通常为±0.2Da，在负离子反射模式下采集一级质谱图，可见1495.7，1602.9，1726.7，1788.9，2109.1等含组氨酸肽的[M-H+]-质谱峰(见图1)。然后切换到正离子反射模式下，选择相应肽的[M+H+]+离子作为母离子进行串联质谱分析，可观察到质量很好的二级质谱图，碎片离子以y离子为主。例如，1790.9的质谱图中可观察到y1至y15的所有y型离子(见图2)。
实施例2 牛乳球蛋白中含组氨酸肽的富集与测序2.1取1mg牛乳球蛋白，溶于0.1mL 0.2M pH 8的硼酸盐溶液(含6M盐酸胍)。加入10mM二硫苏糖醇(DTT)，37℃反应1小时后冷却至室温，加入20mM碘乙酰胺(IAA)，室温避光反应1小时后加入10mM DTT终止反应。用水稀释6倍后，加入20ug胰蛋白酶，37℃酶切12小时。加入0.1M o-甲基异脲，用氢氧化钠调至pH 11，37℃反应4小时后，再用盐酸调pH值为8，加入20mM的邻磺基苯甲酸酐，室温反应1小时。
2.2在依利特P230液相色谱仪(大连依利特公司)上，用C18-反相色谱柱(200×4.6mm，5um，300，大连依利特公司)与强阳离子交换色谱柱(200×4.6mm，5um，300，大连依利特公司)串联，进行组氨酸肽段的富集。先用0.1％三氟乙酸(TFA)平衡色谱系统，上样后用10倍柱体积的0.1％三氟乙酸(TFA)洗柱脱盐，再用60％甲醇(含1％乙酸)洗柱，最后用60％甲醇(含0.5M氯化钠，1％乙酸)洗脱并收集馏份。
2.3质谱分析在装备了氮激光器(337nm)的4700 Proteomics Analyzer质谱仪(美国应用生物系统公司)上进行。先在样品靶上点0.6uL基质溶液(5mg/mL α-氰基-4-羟基肉桂酸，用含0.1％TFA的50％乙腈配制)，干后再点0.6uL馏份，自然挥干后进行质谱分析。先用肽标准物进行外部质量校准，质量测量的准确度通常为±0.2Da，在负离子反射模式下采集一级质谱图，可见1019.6为含组氨酸肽的[M-H+]-质谱峰(见图3)。然后切换到正离子反射模式下，选择其[M+H+]+离子作为母离子进行串联质谱分析，可观察到质量很好的二级质谱图，碎片离子以y离子为主(见图4)。
参考文献1.Ji J，Chakraborty A，Geng M，Zhang X，Amini A，Bina M，Regnier F.J Chromatogr BBiomed Sci Appl.2000，745(1)197-210；2.Hansen P，Lindeberg G.J Chromatogr A.1995，690(2)155-9；3.Chaga，G.S.J.Biochem.Biophys.Metgods 2001，49，313-334；4.Amini A，Chakraborty A，Regnier F E.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci.2002，772(1)35-445.Ren D，Penner NA，Slentz BE，Mirzaei H，Regnier F.J Proteome Res.2003，2(3)321-9.
6.Keough T，Youngquist RS，Lacey MP.Proc Natl Acad Sci USA.1999，96，7131-7136.；7.Keough T，Lacey M P and Youngquist R S.Rapid Commun.Mass Spectrom.2000，14，2348-2356。
权利要求
1.一种用于含组氨酸肽段富集与测序的方法，该方法包括(1)用还原剂打开蛋白质分子中的二硫键，破坏其高级结构；用烷基化试剂封闭巯基，防止其重新形成二硫键；(2)用化学消化或酶消化法对蛋白质进行消化，产生适于质谱分析的肽段；用试剂对酶切肽段的侧链氨基进行保护；(3)对肽段进行化学修饰和处理并进行质谱分析；其特征在于所述步骤(3)的处理方法为(a)用一种或多种化学试剂，对肽段的N端氨基进行修饰，使其带上酸性基团；(b)对肽段样品进行脱盐；(c)用阳离子交换色谱柱分离富集含组氨酸肽；(d)用质谱使含组氨酸肽裂解产生碎片离子的质谱图，对质谱数据进行解析，鉴定产生含组氨酸肽的蛋白质。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(a)中所述酸性基团选自下述磺酸衍生物中的一种或多种2-磺基乙酰基，3-磺基丙酰基，2-磺基苯甲酰基或3-磺基苯甲酰基。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(b)中所述脱盐的方法为反相色谱法。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(d)中所述质谱选自MALDI串联质谱、电喷雾离子化串联质谱或液-质联用串联质谱。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(d)中所述质谱数据的解析及蛋白质的鉴定方法为使用商品软件或数据库搜索。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)的处理方法为(a)用具磺酸基的酰化试剂对肽段的N端氨基进行修饰，使其带上酸性基团；(b)用在线联用反相色谱法对肽段样品进行脱盐；(c)用阳离子交换色谱柱分离富集含组氨酸肽；(d)用液-质联用串联质谱使含组氨酸肽裂解产生碎片离子的质谱图，使用商品软件或数据库搜索对质谱数据进行解析，鉴定产生含组氨酸肽的蛋白质。
7.一种用于含组氨酸肽段富集与测序的试剂盒，其特征在于该试剂盒的组分包括(a)一种或多种对肽段的N端氨基进行修饰，使其带上酸性基团的试剂；(b)一种或多种能进行肽段脱盐和阳离子交换色谱分离的设备；(c)一种或多种用于肽段脱盐和阳离子交换色谱分离的缓冲体系。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于组分(a)所述的试剂为具磺酸基的酰化试剂。
9.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于组分(b)所述的设备为在线联用型常规分析色谱柱或枪头式填充小柱。
全文摘要
本发明提供了一种用于含组氨酸肽段的富集与测序的新方法和试剂盒。该方法通过蛋白质的还原烷基化和胰蛋白酶酶切、肽段N端氨基的修饰、组氨酸肽的色谱富集与质谱测序，对酶切肽段混合物中含组氨酸肽段进行蛋白质鉴定。利用本方法，大大降低了肽段混合物的复杂程度，显著提高了含组氨酸肽被质谱检出的机会及其在二级质谱中的裂解效率，使碎片离子的信噪比大大提高，二级质谱图的质量明显改善，可根据二级质谱图实现对含组氨酸肽的从头测序。本发明还提供了用于该方法实施的试剂盒。
文档编号G01N30/06GK101042377SQ200610065079
公开日2007年9月26日 申请日期2006年3月20日 优先权日2006年3月20日
发明者钱小红, 周春喜, 张养军 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所