专利名称：：3-羰基-6-乙氧甲酰基-噻唑并嘧啶类化合物及其合成方法和用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一类3-羰基-6-乙氧甲酰基-噻唑并嘧啶化合物和合成方法以及用途。尤其涉及一类作为表皮葡萄球菌信号转导系统YycG组氨酸激酶蛋白抑制剂的3-羰基-6-乙氧甲酰基-噻唑并嘧啶化合物和合成方法以及用途。
背景技术：
：葡萄球菌是引起细菌感染的重要病原体，位于各种细菌感染的前列。葡萄球菌会顽固滞留于医疗留置物表面形成细菌生物被膜。不但可以抵挡宿主的免疫杀伤，而且能够阻碍传统的抗生素穿过作用于细菌，发挥杀菌作用。其耐药性比浮游菌可高达1000倍，易造成慢性反复性感染，细菌生物膜病治疗难度很大。因此开发具有抗葡萄球菌生物膜作用，能够杀伤生物膜内细菌的新型抗生素尤为重要，具有广泛的应用前景。近年来，具有抗生物膜活性的药物越来越受到国内外的关注。T.EricBallard等通过还原酰化反应，合成了多种Oroidin化合物，具有抗生物膜活性。有机锡与配体所形成的络合物能够抑制生物膜的形成。中国专利CN1283996A报道络合剂的络合物形成的组合物能够杀菌、抗生物膜、抗真菌等，其中金属如铋、砷等被吡啶硫酮或其他硫醇化合物的络合剂所螯合。中国专利CN1875955A通过计算机辅助药物设计，发现一些药物分子结构能够抑制葡萄球菌生物膜的形成，但目前关于这些分子的合成还很少报道。细菌生物膜的信号调控有几种方式，其中双组分信号转导系统(twocomponentsignaltransductionsystems,TCSs)占有重要地位，具有调控细菌生长、毒力因子的分泌、生物膜的形成、耐药性的活性等重要功能。目前，在金黄色葡萄球菌中发现有两对双组分信号转导系统(VraS/VmR，YycG/YycF)与耐药性有关。阻断某些双组分信号转导系统可以抑制细菌生长并提高细菌对传统抗生素的敏感性。表皮葡萄球菌也具有类似的双组分信号转导系统YycG/YycF，抑制其中的YycG组氨酸激酶蛋白同样可以起到抗菌抗生物膜作用。因此，开发表皮葡萄球菌信号转导系统YyCG组氨酸激酶蛋白抑制剂具有重要意义。本发明旨在合成一类用于抑制表皮葡萄球菌信号转导系统YyCG组氨酸激酶蛋白的3-羰基-6-乙氧甲酰基-噻唑并嘧啶类化合物化合物，研究表明其具有良好的抗生物活性和抑制疟疾杆菌活性。本发明的目的是为了研究表皮葡萄球菌信号转导系统YyCG组氨酸激酶蛋白抑制剂而提供了一种3-羰基-6-乙氧甲酰基-噻唑并嘧啶化合物，本发明的另一目的是提供了上述化合物的制备方法，本发明还提供了上述化合物的用途。本发明的技术方案为3-羰基-6-乙氧甲酰基-噻唑并嘧啶类化合物，其结构式如下
发明内容其中Ri代表-CH3或或-Ph;，R3分别代表下列基团的化合物:5<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>9<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>更优选为:本发明还提供了上述化合物的合成方法，具体步骤为A.等摩尔的乙酰乙酸乙酯(或苯甲酰乙酸乙酯)、硫脲、芳基醛为原料，加入催化剂，在无水乙醇中回流至反应结束；冷却后加入冰水有白色固体析出，过滤，滤饼用无水乙醇重结晶，得到白色晶体；B.将A步所得的白色晶体和等摩尔的氯乙酸、乙酸钠，在乙酸和乙酸酐混合溶剂中回流至反应结束，冷却后加入冰水有黄色固体析出，过滤，滤饼用甲醇重结晶，得到金黄色晶体；C.将B步所得的金黄色晶体和等摩尔的取代芳基醛，以等摩尔的哌啶为催化剂，在乙醇中回流至反应结束，蒸干溶剂，残余物快速柱层析得产物；或将快速柱层析得产物中的羧酸酯类化合物，在等摩尔碳酸钾催化条件下在甲醇和水的混合溶剂中回流至反应结束，冷却后加浓盐酸调整pH至有固体析出，过滤，滤饼用甲醇重结晶得产物。上述步骤A中的芳基醛优选为苯甲醛、对甲氧基苯甲醛或胡椒醛；所述的催化剂为路易斯酸，优选为二水氯化亚锡、氯化锌或六水氯化铁，催化剂量为0.2~0.5摩尔/摩尔底物；回流时间为6~8小时；步骤B中的乙酸和乙酸酐混合溶剂的体积比为1:1~3:1，回流时间为79小时；步骤C中的取代芳基醛为4-的体积比为l:1~2:1，在甲醇和水混合溶剂中回流时间为812小时。本发明还提供了上述合成的3-羰基-6-乙氧甲酰基-噻唑并嘧啶类化合物在表皮葡萄球菌信号转导系统YyCG组氨酸激酶蛋白抑制剂中的应用，抑制葡萄球菌生物膜的形成，并能杀伤葡萄球菌生物膜中的细菌。并且提供此类化合物的医学用途包括破坏生物膜，抑制表皮葡萄球菌的活性。活性测试本发明通过经体外生物学实验证实所合成的小分子化合物能有效抑制葡萄球菌生物膜的形成，并能杀伤葡萄球菌生物膜中的细菌。本发明实验方法是采用96孔板生物膜形成体外模型，将表皮葡萄球菌生物膜形成阳性株ATCC35984于不同的小分子化合物混合(终浓度)，接种于96孔板上，同时以表皮葡萄球菌生物膜形成阴性株ATCC12228为阴性对照，37'C培养20小时后，细菌在孔内形成生物膜的强弱可用结晶紫染色后在OD57o读数判断。此外，用美国的NCCLS(theNationalCommitteeforClinicalLaboratoryStandards)推荐的标准试管稀释法检测小分子化合物的最小抑菌浓度(MIC)和,在乙醇中回流时间为35小时；甲醇和水混合溶剂10最小杀菌浓度(MBC)以及抑制生物膜浓度。有益效果本发明提供的作为表皮葡萄球菌信号转导系统YyCG组氨酸激酶蛋白抑制剂的3-羰基-6-乙氧甲酰基-噻唑并嘧啶类化合物结构新颖，所采取的化合物制备方法简洁，容易实施。最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的测定结果表明，化合物对葡萄球菌生物膜的形成具有良好的抑制作用，并能有效杀伤葡萄球菌生物膜中的细菌。图1是化合物1核磁共振氢谱。图2是化合物3核磁共振氢谱。图3是化合物5核磁共振氢谱。图4是化合物2-(4-羟基苯乙烯基)-3-羰基-5-(4-甲氧基苯基)-6-乙氧甲酰基-7-苯基-噻唑并嘧啶的核磁共振氢谱。图5是化合物2-(4-羟基-3-甲氧基苯乙烯基)-3-羰基-5-(4-甲氧基苯基)-6-乙氧甲酰基-7-苯基-噻唑并嘧啶的核磁共振氢谱。图6是化合物2-(3-甲氧基-4-甲氧甲酰乙氧基苯乙烯基)-3-羰基-5-(4-甲氧基苯基)-6-乙氧甲酰基-7-苯基-噻唑并嘧啶的核磁共振氢谱。具体实施例方式实施例l:中间体(1)的合成步骤及结构确证步骤l:将2.88g苯甲酰乙酸乙酯、1.36g硫脲、2.04g对甲氧基苯甲醛、675mg氯化亚锡、15ml无水乙醇混合，搅拌回流8h。冷却至室温，加入200ml冰水，搅拌，至有白色固体析出，过滤，用无水乙醇重结晶得4g(产率72%)。步骤2:步骤l产物736mg、189mg氯乙酸、164mg乙酸钠、乙酸和乙酸酐共12ml(体积比3:1)搅拌回流7h。冷却至25。C，加入200ml冰水，至黄色固体析出，过滤，用甲醇重结晶得740mg(产率90%)中间体(1)。'關MR(CDCl3)S6.857.43(m,9H)，3.733.92(m,7H)，0.84(t，3H).实施例2:中间体(2)的合成步骤及结构确证步骤l:将2.88g苯甲酰乙酸乙酯、1.36g硫脲、2.25g胡椒醛、675mg氯化亚锡、15ml无水乙醇混合，搅拌回流6h。冷却至室温，加入250ml冰水，搅拌，至有白色固体析出，过滤，用无水乙醇重结晶得3.6g(产率65%)。步骤2:步骤l产物764mg、189mg氯乙酸、164mg乙酸钠、乙酸和乙酸酐共12ml(体积比l:1)搅拌回流9h。冷却至室温，加入200ml冰水，析出黄色固体，过滤，用甲醇重结晶得700mg(产率85%)中间体(2)。'H-NMR(CDCl3)56.10~7.44(m，8H),5.95(s,2H)，3.75~3.92(m，4H),0.86(t，3H).实施例3:3-(2-(5-甲氧基呋喃基))苯甲酸酯的合成步骤及结构确证步骤l:2.05g邻氨基苯甲酸加入24ml水和浓盐酸8ml，向其中加入亚硝酸钠水溶液7ml(0.18g/ml),0'C搅拌0.5h。将10ml糠醛的丙酮溶液(0.14g/ml)，5ml氯化铜水溶液(0.17g/ml)加入其中，室温搅拌24h,抽滤，用热水洗涤，烘干得2.4g黄色固体(产率73%)。步骤2:步骤l产物lg、加入10ml甲醇和催化量的浓硫酸，搅拌回流4h，停止反应，乙酸乙酯萃取，快速柱层析(乙酸乙酯石油醚=1:4)得250mg粘稠液体(产率25%)。'H-NMR(CDCl3)59.55(s，H),6.808.30(m,6H),3.84(s,3H).实施例4:化合物2-(4-羟基苯乙烯基)-3-羰基-5-(4-甲氧基苯基)-6-乙氧甲酰基-7-苯基-噻唑并嘧啶的合成及结构确证步骤0.9g中间体(1)、0.27g对羟基苯甲醛、0.2g哌啶、20ml乙醇，搅拌回流3h。蒸干溶剂，残余物快速柱层析(乙酸乙酯石油醚=1.:6)得1.07g黄色固体(95%)。ESI-MSm/z513.1([M+H]+),535.0([M+Na]+).实施例5:化合物2-(4-羟基-3-甲氧基苯乙烯基)-3-羰基-5-(4-甲氧基苯基)-6-乙氧甲酰基-7-苯基-噻唑并嘧啶的合成及结构确证步骤0.9g中间体(1)、0.34g4-羟基-3甲氧基苯甲醛、0.2g哌啶、20ml乙醇，搅拌回流3h。蒸干溶剂，残余物快速柱层析(乙酸乙酯石油醚=1:5)得1.09g橙色固体(92%)。!H-NMR(CDCl3)S7.69(s，H)，6.27~7.48(m，13H)，3.87~3.91(m,5H),3.77(s,3H)，0.87(t，3H).实施例6:化合物2-(3-甲氧基-4-甲氧甲酰乙氧基苯乙烯基)-3-羰基-5-(4-甲氧基苯基)-6-乙氧甲酰基-7-苯基-噻唑并嘧啶的合成及结构确证的合成步骤及结构确证步骤0.9g中间体(1)、0.5g2-甲氧基-4-甲酰基苯氧基乙酸甲酯、0.2g哌啶、20ml乙醇，搅拌回流4h。蒸干溶剂，残余物快速柱层析(乙酸乙酯石油醚=1.:4)得1.28g黄色固体(95%)。ESI-MSm/z615.0([M+H]+),637.0([M+Na]+).实施例7:化合物2-(3-甲氧基-4-羟甲酰乙氧基苯乙烯基)-3-羰基-5-(4-甲氧基苯基)-6-乙氧甲酰基-7-苯基-噻唑并嘧啶的合成及结构确证的合成步骤及结构确证步骤实施例6产物2.6g、碳酸钾0.6g、甲醇和水共50ml(体积比1:1)搅拌回流8h。用37%盐酸调pH=2有固体析出，甲醇重结晶得橙色晶体1.7g(68%)。ESI-MSm/z601,0([M+H]+),623.9([M+Na]+).实施例8:化合物1的合成步骤及结构确证步骤l:0.9g中间体(1)、0.3g对甲酰基苯氧基乙酸甲酯、0.2g哌啶、20ml乙醇，搅拌回流3h。蒸干溶剂，残余物快速柱层析(乙酸乙酯石油醚=1.:6)得1.0g黄色固体(97%)。步骤2:步骤l产物2.4g、碳酸钾0.6g、甲醇和水共50ml(体积比1:1)搅拌回流8h。用37%盐酸调pH=2有固体析出，甲醇重结晶得黄色晶体1.4g(60%)。'H-NMR(CDCl3)S7.73(s,H),6.907.62(m,13H),4.85(s,2H),3.85(q,2H):3.76(s,3H)，0.84(t,3H).实施例9:化合物3的合成步骤及结构确证,COOCH.步骤1:4g中间体(1)、3-(2-(5-甲氧基呋喃基))苯甲酸酯2.3g、哌啶0.8g、40ml乙醇，搅拌回流4h。抽滤，滤饼用乙醇和石油醚洗涤3次，干燥得6g黄色固体(97%)。步骤2:步骤l产物3.3g、碳酸钾2,2g、甲醇和水120ml(体积比2:1)，搅拌回流12h。用浓盐酸调pl^2有固体析出，甲醇重结晶得黄色晶体2.1g(65。/。)。^-NMR(CDCl3)58.34(s,H)，6.908.05(m，15H),3.78(q,2H),3.71(s,3H),0.76(t,3H).实施例10:化合物5的合成步骤及结构确证15步骤1:4g中间体(2)、对甲酰基苯氧基乙酸甲酯2.3g、哌啶0.8g、40ml乙醇，搅拌回流5h。抽滤，滤饼用乙醇和石油醚洗涤多次，干燥得6g黄色固体(97%)。步骤2:步骤l产物3.3g、碳酸钾2,2g、甲醇50ml、水50ml，搅拌回流8h。用浓盐酸调pH-2有固体析出，甲醇重结晶得黄色晶体2.1g(65%)。'H陽NMR(CDCl3)S7.79(s,H),6.89~7.59(m,12H),6.08(s，H)，6.02(s，2H)，4.78(s，2H),3.83(q,2H)，0.80(t，3H).实施例11:化合物3和化合物5的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的测定最小抑菌浓度(MIC)测定参照美国临床和实验室标准研究所CLSI(ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute)推荐的操作规范，采用肉汤稀释方法(BrothMicro-dilution)进行最小抑菌浓度(MinimalInhibitoryConcentration,MIC)检测。并以大肠杆菌ATCC25922株作为质量控制标准菌株。(1)用无菌接种环沾取少许细菌(S.卬!'cfenm'cfoATCC12228，ATCC35984;S.awmyATCC49230;￡.co/ZATCC25922)菌种，在TSB平皿(Eco"在LB平皿)表面分区划线，37'C孵育过夜。(2)从平皿上挑取单个菌落，接种至35mLMH液体培养基中，37°C，220rpm振荡培养至对数生长中期(约需4h)。(3)菌液准备将处于对数生长中期的菌液用生理盐水调节浊度至0.5麦氏比浊标准(相当于0.5xl()SCFU/mL)，再用MH肉汤1:200稀释，使细菌的终浓度约为2.5xl05CFU/mL。(4)将化合物3和化合物5进行连续倍比稀释，药物浓度范围根据CLSI推荐采用合适的浓度梯度，若CLSI没有此种药物则参照同一类药物的范围。每个试管中加入稀释好药物溶液的最小量为1mL，因为在加入等体积的接种菌液时，药物将被1:2稀释，所以各管中抗菌药物的浓度应是所需最终浓度的2倍。(5)菌液接种用微量移液器分别取lmL稀释好的菌液依次接种至装有lmL含从低浓度到高浓度药物MH培养基的试管中，将每只试管混匀。这样试管内的药物均被1:2稀释，菌液的最终浓度约为105CFU/mL。同时设立不加药物的生长质控管和不加细菌的空白对照管。(6)培养和结果判断将菌液置于35。C，220rpm振荡培养1620h,肉眼观察有无细菌的生长。MIC为肉眼观察试管中的细菌生长完全被抑制时的最小药物浓度。最小杀菌浓度(MBC)测定从MIC浓度以上的试管(包括MIC浓度，均为肉眼观察细菌生长完全被抑制)中每管取100pL，均匀涂布于MH平板上，每个浓度涂板6块。37°C培养24小时，每板单克隆菌落数个时的最小浓度定为最小杀菌浓度(MBC)。化合物3和化合物5最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)见表1。实施例12:化合物3和化合物5的抑制生物膜浓度的测定将过夜培养的表皮葡萄球菌35984株按1:200接种于新鲜的TSB培养基,待生长至对数期,调节其浊度至0.5麦氏单位，按1:200接种于新鲜的TSB培养基,然后加入96孔板中，每孔200^11，37'C孵育6h。弃去培养上清，PBS洗涤3次,然后加入含有MIC以上浓度的新鲜TSB培养基200W，继续培养12h。最后对生物膜进行结晶紫染色。加药后生物膜比6h的生物膜少，说明药物确实有杀生物膜作用。化合物3和化合物5的抑制生物膜浓度见表1。表1.化合物3和化合物5最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)及抑制生物膜浓度<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>权利要求1、3-羰基-6-乙氧甲酰基-噻唑并嘧啶类化合物，其结构式如下其中R1为-CH3或-Ph；R2为id="icf0002"file="A2009101832970002C2.tif"wi="79"he="12"top="61"left="77"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="yes"/>R3为2.—种合成如权利要求1所述的3-羰基-6-乙氧甲酰基-噻唑并嘧啶化合物的方法，其具体步骤为A.等摩尔的乙酰乙酸乙酯或苯甲酰乙酸乙酯、硫脲、芳基醛为原料，加入催化剂，在无水乙醇中回流至反应结束；冷却后加入冰水有白色固体析出，过滤，滤饼用无水乙醇重结晶，得到白色晶体；B.将A步所得的白色晶体和等摩尔的氯乙酸和乙酸钠，在乙酸和乙酸酐混合溶剂中回流至反应结束，冷却后加入冰水有黄色固体析出，过滤，滤饼用甲醇重结晶，得到金黄色晶体；C.将B步所得金黄色晶体和等摩尔的取代芳基醛，以等摩尔的哌啶为催化剂，在乙醇中回流至反应结束，蒸干溶剂，残余物快速柱层析得产物；或将快速柱层析得产物中的羧酸酯类化合物，在等摩尔碳酸钾催化条件下，在甲醇和水的混合溶剂中回流至反应结束；冷却后加浓盐酸调整pH至有固体析出，过滤，滤饼用甲醇重结晶得产物。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤A中的芳基醛为苯甲醛、对甲氧基苯甲醛或胡椒醛；所述的催化剂为二水氯化亚锡、氯化锌或六水氯化铁，催化剂量为0.2~0.5摩尔/摩尔底物；回流时间为6~8小时；步骤B中的乙酸和乙酸酐混合溶剂的体积比为l:1~3:1，回流时间为79小时；步骤C中的取代芳基醛为4-羟基苯甲醛、4-羟基-3-甲氧基苯甲醛、3-羟基苯甲醛、时间为35小时；甲醇和水混合溶剂的体积比为1:1~2:1，在甲醇和水混合溶剂中回流时间为812小时。4.一种如权利要求1所述的化合物的在表皮葡萄球菌信号转导系统YyCG组氨酸激酶蛋白抑制剂中的应用，抑制葡萄球菌生物膜的形成，并能杀伤葡萄球菌生物膜中的细菌。在乙醇中回流全文摘要本发明涉及一类3-羰基-6-乙氧甲酰基-噻唑并嘧啶化合物和合成方法以及用途。该化合物的结构式如右。本发明提供的作为表皮葡萄球菌信号转导系统YyCG组氨酸激酶蛋白抑制剂的3-羰基-6-乙氧甲酰基-噻唑并嘧啶类化合物结构新颖，所采取的化合物制备方法简洁，容易实施。最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的测定结果表明，化合物对葡萄球菌生物膜的形成具有良好的抑制作用，并能有效杀伤葡萄球菌生物膜中的细菌。文档编号C07D513/04GK101613362SQ20091018329公开日2009年12月30日申请日期2009年7月31日优先权日2009年7月31日发明者旸吴,朱明莉,斌潘,涤瞿,韩世清,黄仁政申请人:南京工业大学;复旦大学