专利名称：Piwil2抗肿瘤ctl表位肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物化学领域中的多肽技术领域，具体涉及一种PIWIL2来源的抗肿 瘤CTL表位肽及其在制备肿瘤治疗性多肽疫苗中的应用。
背景技术：
PIWIL2属于肿瘤-睾丸抗原(Cancer-Testis Antigen, CTA)家族，在正常组织中 仅存在于睾丸组织中，在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌以及睾丸癌等肿瘤组织中呈现高表达， 而在正常乳腺组织中不表达。PIWIL2与肿瘤的发生、发展密切相关，是一个非常好的肿瘤诊 断和治疗的靶点，更重要的是，由于其特殊的组织表达特征以及与乳腺癌发生、发展的关联 性，使其成为一个非常理想的乳腺癌免疫治疗靶抗原。随着现代免疫学的发展，细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)在 肿瘤中发挥的重要作用越来越受到重视。如何有效地激发CTL介导的特异性细胞免疫应 答，发挥抗肿瘤效能，已经成为当今肿瘤治疗性多肽疫苗研制领域的一个重要课题。既往研 究发现，引起CTL免疫应答反应的，并非完整的肿瘤抗原分子，而是抗原来源的特异性CTL 表位(Epitope)。抗原递呈细胞摄取肿瘤抗原后，通过蛋白水解作用将其加工成为8-10个 氨基酸长度的多肽片段，即CTL表位，进而与内质网腔中的主要组织相容性复合体I(MHCI) 类分子结合形成多肽-MHC复合物(p^tide-MHC complex，pMHC)，并最终将pMHC递呈到细 胞表面供CD8+T细胞表面的T细胞受体(T cell receptor, TCR)识别，从而活化CTL细胞， 引发CTL免疫应答。但是，免疫原性弱和免疫耐受的存在是CTL表位作为肿瘤治疗性多肽 疫苗应用的两大障碍。因此，如何提高CTL表位的免疫原性以及打破机体对CTL表位的免 疫耐受成为肿瘤治疗性多肽疫苗发展的关键。目前，在众多肿瘤治疗性多肽疫苗的增强策略中，对CTL表位进行分子改造被认 为是最有前景的方法之一。CTL表位的改造，可以通过改造表位MHC结合位点，从而改善 表位与MHC的亲和力和pMHC的稳定性，以达到增强免疫原性的目的；也可以通过改造表位 TCR结合位点，从而改善pMHC与TCR结合的稳定性，以达到提高CTL活性并克服CTL耐受的 目的。近期研究表明，基于表位MHC结合位点改造的多肽疫苗虽然可以一定程度上提高疫 苗的免疫原性，但在肿瘤免疫治疗中达不到理想的抑瘤效果；而基于表位TCR结合位点改 造的多肽疫苗，有望通过增强对低亲和力T细胞的刺激能力或者招募一群新的具有交叉反 应性的T细胞打破肿瘤免疫耐受而达到理想的抑瘤效果。HLA-A2. 1分子主要与九肽结合，其二位和九位为MHC主要锚定位点。Jorg Ruppert (Prominent role of secondary anchor residues in peptide binding to HLA-A2.1 molecules. Cell. 1993,74(5) :929_37.)在研究主要锚定位点的优势氨基酸中发现二 位为L或M，九位为L、V或I，能将表位与MHC结合的能力提高10 100倍；而对与次 要锚定位点的改造，最常用且最有效的一种方法就是将一位的氨基酸使用酪氨酸(Tyr) 替换。 Tourdot(A general strategy to enhance immunogenicity of low-affinity HLA-A2. !-associated peptides !implication in the identification of cryptic
3tumor epitopes. Eur J Immunol. 2000,30(12) :3411_21.)指出一位 Tyr 的引入主要依靠 其侧链苯环的疏水作用以及酚羟基的氢键作用增强表位肽与HLA分子的相互作用。本申请主要是采用理论和实验相结合的方法，修饰并初步鉴定出与MHC分子结合 能力高的PIWIL2来源的候选CTL表位肽及其类似物。我们通过对CT datebase的筛选，发 现了一种新认定的在乳腺癌中高表达的癌睾抗原CT80(即PIWIL2)，它在乳腺癌中的阳性 表达率超过了 80%，是CT抗原中非常理想的一个乳腺癌免疫治疗靶抗原，而目前关于它们 的表位鉴定还没有文章报道。根据抗原的一级结构，采用免疫信息学手段，运用SYFPEITHI、 BIMAS和Net CTL 1. 2数据库对抗原PIWIL2的HLA-A2. 1限制性CTL表位进行了预测分析。
发明内容
本发明目的在于用人工合成的方法提供一种具有抗肿瘤作用的PIWIL2抗肿瘤 CTL表位肽，并提供了表位肽的制备方法。本发明另一目的在于提供该PIWIL2抗肿瘤CTL表位肽在制备肿瘤治疗性多肽疫 苗中的应用。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案PIWIL2 抗肿瘤 CTL 表位肽，为九肽，其序列为a-Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val ；其中，a 为 Lys 或 Tyr。当 a 为 Lys 时，序列为 Lys-Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val (即 KLGGELWGV，记 为P724)，分子量为958. 1。当 a 为 Tyr 时，序列为 Tyr-Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val (即 YLGGELWGV，记 为P724-1Y)，分子量为993. 1。所述PIWIL2抗肿瘤CTL表位肽的制备方法，可以采用固相合成法合成CTL表位 肽。基本流程如下首先将一个氨基被Fmoc基团保护的氨基酸连接在不溶性固相载体 Wang树脂上，然后脱掉氨基的保护基，第一个氨基酸即连接到固相载体上了 ；其次将氨基 被Fmoc基团保护的第二个氨基酸的羧基用缩合剂活化，活化后的氨基酸再与已接在固相 载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，此时在固相载体上就生成了一个带有保护基的 二肽。重复上述的肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度， 最后切割得到目的肽。经HPLC纯化后，其纯度大于90%，质谱分析并证实其分子量符合理 论值。所述PIWIL2抗肿瘤CTL表位肽在制备肿瘤治疗性多肽疫苗中的应用。本发明优点利用在乳腺癌中高表达而在人体正常组织中不表达的抗原PIWIL2， 筛选出具有抗肿瘤活性的表位肽，鉴定的九肽均未见文献报道，为研制基于抗原PIWIL2的 肿瘤治疗性多肽疫苗提供理论基础，并为后续多价的抗原肽疫苗构建奠定基础。
图1是本发明表位肽P724的质谱分析图谱；图2是本发明表位肽P724-1Y的质谱分析图谱；图3是本发明表位肽诱导的特异性CTL对肿瘤细胞MCF-7杀伤效应的检测结果；图4是本发明表位肽在转基因小鼠体内诱导的特异性CTL对肿瘤细胞MCF-7杀伤
4效应的检测结果。实验仪器名称与型号电喷雾-离子阱多级质谱仪BRU KER Esquire-3000德国布鲁克道尔顿仪器公司流式细胞仪Calibur美国BD公司
具体实施例方式以下通过实施例对本发明做进一步的说明，但本发明的保护范围不限于此。实施例1 抗肿瘤 CTL 表位肽 P724 (Lys-Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val)的 制备采用Fmoc固相合成法，从C端一N端逐个延长。用芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护 氨基酸的α -氨基，各种Fmoc保护氨基酸的侧链保护基分别为Trp (Boc), Glu (OtBu)、 Lys (Boc) (Boc代表叔丁氧羰基、OtBu代表叔丁脂)。先将α -氨基保护的C端第一个氨 基酸，即Fmoc-Val-OH用N、N' -二异丙基碳二亚胺(DIC)作缩合剂，并加入1_羟基苯并 三氮唑(HOBt)，将Fmoc-Val-OH连接到wang树脂上；依次用DMF、无水甲醇、二氯甲烷、DMF 洗涤；然后用哌啶-DMF混合液(Ve Vdmf =1:4)除去Fmoc保护基，依次用DMF、无水 甲醇、二氯甲烷、DMF洗涤。再与C端第二个氨基酸即Fmoc-Gly-OH用DIC作缩合剂，并加 HOBt，将Fmoc-Gly-OH连接到Val的氨基上，用哌啶-DMF混合液(V Vdmf=I 4)脱 去Fmoc保护基，依次用DMF、无水甲醇、二氯甲烷、DMF洗涤。得Gly-Val-Wang树脂。再与 Fmoc-Trp (Boc)-OH连接，重复上述步骤，依次连接上Leu、Glu、Gly、Gly、Leu、Lys，使肽链 按序列从C端一N端逐步延长，用哌啶-DMF混合液 Vdmf = 1 4)脱去Fmoc保护 基，用切割试齐U (ν三氟i酸V苯甲硫醚V水ν* Vi,2-i二硫醇=82. 5 5 5 5 2. 5) 将P724从Wang树脂上切下，并脱去BOC、0tBu、BOC保护基，得到抗肿瘤CTL表位肽P724粗
P
BFI οHPLC 分离纯化用 C18 制备性 HPLC 柱(Partisi 110 0DS-39. 4X 250mm, Whatman 公司)分离纯化。取上述P724粗品30mg溶于3ml含三氟乙酸(TFA)、乙腈(CAN)的水溶液 a (TFA体积含量为0. 1 %，CAN体积含量为30 % )中，用a进行等梯度洗脱，流速5ml/min， 收集主峰，冷冻干燥得精肽。将产物进行质谱分析见图1，结果证实分子量为958. 1，与理论 值相符合。实施例2 抗肿瘤 CTL 表位肽 P724-1Y (Tyr-Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val) 的制备采用与实施例1同样的合成方法，不同之处仅在于用Tyr替代Lys。将产物进行质谱分析，结果见图2，证实分子量为993. 1，与理论值相符合。上述制备的CTL表位肽，可用于制备肿瘤治疗性多肽疫苗，其应用实验如下1、表位肽与HLA-A2. 1分子结合力试验(1) 800rpm离心收集HLA-A2. 1表达阳性且内源性抗原加工处理能力缺失的T2细 胞(ATCC公司)，PH7. 2的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，无血清RPMI 1640培养基(Gibico 公司)重悬至细胞密度为1 X IOVmL,接种于24孔板中。(2)每孔加入50 μ g表位肽和0. 5 μ g人β 2微球蛋白(Sigma公司)，37°C共孵育 18h ；
(3)用4°C的PBA(将2g牛血清白蛋白，0. 2g叠氮化钠溶解于100ml PH7. 4的PBS 中即得PBA)洗涤3次，加100 μ 1用PH 7. 4的PBS 100倍稀释后的鼠抗人HLA-A2. 1分子 的单克隆抗体ΒΒ7. 2 (Sigma公司)，4°C避光孵育40min ；(4)用4°C的PBA洗涤3次，加入50 μ 1用PH 7. 4的PBS 50倍稀释后的异硫氰酸 荧光素(FITC)标记的羊抗鼠IgG(北京博奥森生物技术有限公司)，4°C避光孵育30min ；(5) PBA洗涤后于流式细胞仪检测。结果用荧光系数FI表示，详见表1。结果显示，两条表位肽均显示出较好的结合力，且改造肽P724-1Y远高于母体肽 P724。表1表位肽与HLA-A2. 1分子结合力试验结果
权利要求
PIWIL2抗肿瘤CTL表位肽，其特征在于，所述抗肿瘤CTL表位肽为九肽，其序列为a Leu Gly Gly Glu Leu Trp Gly Val；其中a为Lys或Tyr。
2.如权利要求1所述PIWIL2抗肿瘤CTL表位肽，其中a为Lys，序列为Lys-Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val。
3.如权利要求1所述PIWIL2抗肿瘤CTL表位肽，其中a为Tyr，序列为Tyr-Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val。
4.权利要求1至3任一所述PIWIL2抗肿瘤CTL表位肽的制备方法，其特征在于，采用 固相合成法制备CTL表位肽。
5.权利要求1至3任一所述的PIWIL2抗肿瘤CTL表位肽在制备肿瘤治疗性多肽疫苗 中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种PIWIL2来源的抗肿瘤CTL表位肽，为九肽，其序列为a-Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val(a为Lys或Tyr)。表位肽P724序列为Lys-Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val；抗肿瘤CTL表位肽P724-1Y序列为Tyr-Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val。本发明所述抗肿瘤CTL表位肽在体外和体内所诱导的特异性CTL对肿瘤细胞MCF-7均显示出一定的杀伤率，可用于制备肿瘤治疗性多肽疫苗。
文档编号C07K1/04GK101948508SQ20101027691
公开日2011年1月19日 申请日期2010年9月9日 优先权日2010年9月9日
发明者代怊, 刘伟, 吕虹, 吴亚红, 康巧珍, 祁元明, 翟明霞, 高艳锋 申请人:郑州大学