一种抗肿瘤肽变体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种抗肿瘤活性肽变体，该蛋白变体相对于野生型具有更强的抑制肿瘤细胞生长的效果。这些变体蛋白质和它们的衍生物可以用于包括肝癌、肺癌、乳腺癌等多种肿瘤的治疗。
【专利说明】一种抗肿瘤肽变体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体地说，本发明涉及抗肿瘤肽变体。
【背景技术】
[0002]ND100 是由 lAla、lGlu、lGly、lLeu、2Pro、IThrUTyr 组成的八肽。体外及体内试验均表明ND100具有明显的抑制肿瘤细胞生长的作用，可用来制备抗肿瘤药物，用于治疗肿瘤。
[0003]在现有技术中，为了提高多肽的活性，针对多肽序列进行特异性的改变，从而寻找活性更高的变体是常规的做法。为了进一步提高该多肽的生物活性， 申请人:通过大量的实验，针对多肽序列进行了氨基酸的改变，从而获得了比原始多肽本身具有更高抑制活性的变体。
[0004]发明详述
[0005]本发明涉及的多肽，序列如下:
[0006]NC:AlaGluGlyLeuProProThrTyr ；
[0007](NCl):AlaGluGlyLeuProProThrIle ；
[0008](NC2):AlaSerGlyLeuProProThrTyr ；
[0009](NC3):AlaGluGlyLeuProSerThrTyr ；
[0010](NC4):AlaGluGlyGlyLeuProProThrTyr ；
[0011](NC5):AlaGlu GlyGlyLeuProProProThrTyr ；
[0012](NC6):GlyAlaGluGlyLeuProProProThrTyr ；
[0013](NC7):AlaGlyGlyLeuProProThrTyr ；
[0014](NC8):GlyAlaGlyGlyLeuProProThrTyr ；
[0015](NC9):AlaGlyGlyLeuProSerThrTyr ；
[0016](NClO):GlyAlaGlyGlyLeuProSerThrTyr ；
[0017](NCll):GlyAlaGlyGlyLeuProProProThrTyr ；
[0018](NC12):AlaGlyGlyLeuProProProThrTyr ；
[0019](NC13):AlaGlyGlyLeuProProProThrIle ；
[0020]对照I =AlaGluGlyLeuProGlyThrTyr ；
[0021]对照2:AlaLeuGlyLeuProProThrTyr ；
[0022]本发明的多肽合成后，可以做成游离态形式，也可以做成阳离子盐，如:TFA盐(三氟乙酸盐)，HCl盐(盐酸盐)，醋酸盐形式。
[0023]本发明的多肽，可以选择和一种或多种药物载体组合，制成多种药物剂型，用于治疗。这些药物剂型涵盖:注射溶液、片剂、霜剂、胶囊、软膏、洗剂、舌含片等剂型局部或全身给药。
【具体实施方式】
[0024]实施例1:本发明多肽的人工化学合成
[0025]本发明的肽的制备采用液相合成法和活化酯逐个增长法，将本发明的肽的C端的第二个氨基酸的氨基用Boc基(叔丁氧羰酰基)保护，羧基用HOSu (N-羟基琥珀酰亚胺)活化，然后在KHCO3溶液中与C端第一个氨基酸在30°C水浴，反应2天。抽去有机溶剂，在冰浴中用2mol/LHCl调pH3~4(沉淀最多时)，用乙酸乙酯抽提，饱和NaCl洗3次，无水Na2SO4干燥，抽干，无水乙醚研磨，得带保护基的二肽。用50% TFA(三氟醋酸)处理，脱去Boc基，再与N端带Boc保护基，C端用HOSu活化的C端的第三个氨基酸缩合，用同样的方法逐个接上氨基酸，最后用催化氢化法脱去Glu侧链上的保护基，用50% TFA脱去本发明肽N端的Boc基，得粗肽，粗肽用HPLC进行分离纯化，可得98%纯度的本发明的多肽。经过电喷雾质谱测定，其序列与目标序列完全一致。
[0026]实施例2 =NDlOO的抗肿瘤活性
[0027](I)体外活性测定:
[0028]采用细胞培养和细胞计数的方法，人肝癌细胞7721、胃癌细胞MKN、肺癌细胞A549以各自常规的培养基，视不同情况加入10%左右的小牛血清，用T-25培养瓶在37°C，5%C02培养箱中单层培养。
[0029]当细胞生长成单层后消化，用含1%小牛血清的培养液制成细胞悬液，按每孔Iml接种到24孔培养板上，37°C、5% CO2培养箱中培养4h后，加入不同剂量的本申请的多肽，对照组和实验组均设三个重复孔，对照组加入10μ I的PBS，试验组加入不同剂量的本申请的多肽，继续培养72小时后，吸出培养液，用PBS洗，然后每孔加入200 μ I消化液消化，待细胞变圆后，加入800 μ I的PBS，在倒置显微镜下用血球计数板计数。
[0030]抑制率结果如下:
[0031]
[0032]
【权利要求】
1.一种抗肿瘤肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1-14所示。
2.如权利要求1所述的肿瘤肽变体在制备抑制肿瘤药物中的用途。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于:所述肿瘤为肝癌、胃癌或肺癌。
4.一种抗肿瘤药物制剂，它含有权利要求2所述的肿瘤肽变体以及药学上合适的载体 。
【文档编号】A61P35/00GK104130311SQ201410312285
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年6月27日 优先权日:2014年6月27日
【发明者】马海龙 申请人:马海龙