一种地木耳抗肿瘤多糖及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种地木耳抗肿瘤多糖及其制备方法，以及该多糖在制备抗肿瘤药物和保健食品中的应用。其制备方法是将纯天然地木耳干燥后粉碎，称取适量，加蒸馏水回流浸提，合并提取液；将上述提取液旋转蒸发浓缩至适量，以体积比1：1加入10.6％亚铁氰化钾溶液和21.9％乙酸锌溶液沉淀蛋白，离心后吸取上清液；再减压旋转蒸发浓缩至一定体积，将浓缩液蒸馏水透析后，加入无水乙醇析出白色絮状物，离心后再真空冷冻干燥，即得到地木耳多糖。体外抗肿瘤实验表明，该多糖能明显抑制人乳腺癌细胞增殖而无细胞毒性，具有良好的抗肿瘤活性，为开发研制新型抗癌保健品或药物提供了可能。
【专利说明】一种地木耳抗肿瘤多糖及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及蓝绿藻类植物多糖的制备和应用，具体属于一种地木耳抗肿瘤多糖及 其制备方法，以及在制备抗肿瘤药物和天然保健食品中的应用。
【背景技术】
[0002] 地木耳，学名普通念珠藻（Nostoc commune Vauch.)，俗称地皮菜，别名地衣、地 菜燕、地软儿、地菜皮、地耳，为藻类蓝藻纲念珠藻科（nostocaceae)念珠藻属植物念珠藻 (nostoc commune vauch)的片状藻类。一般生长在潮湿的砂质土壤表面，常混杂于杂草基 部的茎叶间、大树的基部及苔醉植物群间。地木耳几乎在全国均有分布，在东北地区尤其是 长白山区有广泛的野生资源分布，在山西亦有很高的产量。
[0003] 《本草纲目》记述地木耳："气味：甘、平、无毒；主治：明目益气，补肾。"《名医 别录》中记述"主明目，益气，令人有子。"《食物考》中认为："清神解热，痰火能疗""久 服延年，盖亦能清脏热者。目前已有文献报道：它含有丰富的蛋白质、糖类、多种微量元素 及一定的粗脂肪和粗纤维，具有较高的食用和营养价值，是典型绿色山野天然食品；同时经 常食用具有清热解毒、凉血明目、促进新陈代谢的功效，是很好的医疗保健食品。因此，地木 耳可以作为一种食药两用的保健食品。
[0004] 多糖类物质是指一类由10个以上单糖分子聚合而成的天然高分子化合物，是维 持正常生命活动的大分子物质之一。有研究表明，地木耳多糖物质具有抗氧化和抑菌活性， 还有抗疲劳、抗病毒、降血糖、降血脂、消炎等功能，但尚未看到地木耳多糖抗肿瘤活性的研 究。本实验以地木耳为材料，提取出一种具有抗肿瘤活性的多糖，该多糖能够显著抑制人乳 腺癌细胞的增殖。因此，本发明不仅能够应用于抗肿瘤药物、天然新食品和健康饮品的研制 开发，同时为促进地木耳资源的深度开发和有效利用提供理论依据。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种具有抗肿瘤活性的地木耳多糖及其制备方法，以及其 在制备抗肿瘤药物和保健食品中的应用。
[0006] 本发明提供的一种地木耳抗肿瘤多糖的方法，包括如下步骤：
[0007] 第一步：取地木耳，60°C干燥2小时后粉碎，加蒸馏水加热回流3小时，静置，双层 纱布过滤，取上清液，如上重复提取1次，合并滤液，减压蒸发浓缩至粘稠状；
[0008] 第二步：浓缩后的提取液边搅拌边加入10. 6 %的亚铁氰化钾 (K4 [Fe (CN) 6] · 3H20)，摇勻，再加入21. 9 %的乙酸锌（C4H804Zn)，振摇均勻，以沉淀蛋白，室温 下放置30分钟，5000rpm离心20分钟后取上清液，减压蒸发浓缩至粘稠状；所述的亚铁氰 化钾、乙酸锌和提取液体积比为1 : 1 : 8-15;
[0009] 第三步：用截留量为3000的透析袋，将第二步得到的浓缩液在蒸馏水中透析，每 12小时换水一次，直至透析液电导率不变，以除去离子和单糖等小分子杂质；
[0010] 第四步：在第三步得到的提取液中加入无水乙醇，涡旋，室温放置〇. 5-1小时，以 沉淀多糖，然后5000rpm离心15-20分钟，收集沉淀；所述的提取液和无水乙醇体积比为 3-2 ： 7-8 ；
[0011] 第五步：在上述沉淀中加入适量蒸馏水，50-60°C下搅拌溶解，直至成均一液体， 再真空冷冻干燥成絮状物即得粗多糖样品，命名为NVPS，于4°C保存。
[0012] 第二步中所述的10. 6%亚铁氰化钾溶液、21. 9%乙酸锌溶液和提取液体积比优选 为 1 : 1 : 10。
[0013] 第四步中所述的提取液和无水乙醇体积比优选为3 : 7。
[0014] 第五步中所述的溶解沉淀加热温度优选为55°C。
[0015] 上述制备方法制得的地木耳多糖可在制备新型抗癌药物中应用，也可在制备保健 品中应用。
[0016] 经体外抗肿瘤活性检测显示，上述制备方法制得的地木耳多糖可明显抑制癌细胞 增殖，具有良好的抗癌活性。结果显示用不同浓度该多糖处理人乳腺癌细胞（MCF-7)24小 时、浓度为300ug/ml时，致死率达到约25% ;处理36小时、浓度为200ug/ml时，致死率 高至约60%，所以该多糖对癌细胞（MCF-7)具有良好的抑制效果。
[0017] 该方法制备的多糖，因其来源于纯天然藻类，加之纯化工艺简单，因此有较大的开 发前景和应用价值。如：在医药方面，可作为其他药物的辅料或制备具有抗肿瘤活性的癌症 辅助药物；在保健品方面，可制备具有抗肿瘤和抗氧化功能的保健口服液；另外，还可以作 为天然食品添加剂应用在饮料和点心中，还可作为乳化剂、保湿剂添加在化妆品中。
【专利附图】
【附图说明】
[0018] 图1地木耳抗肿瘤多糖（NVPS)样品
[0019] 图2地木耳抗肿瘤多糖（NVPS)对细胞毒性的影响柱形图
[0020] 图3地木耳抗肿瘤多糖（NVPS)诱导MCF-7细胞凋亡具有剂量依赖性柱形图
【具体实施方式】
[0021] 实施例1地木耳抗肿瘤多糖（NVPS)的制备方法
[0022] (1)将天然地木耳60°C干燥2小时，粉碎。
[0023] (2)取地木耳粉末100g，加5L蒸馏水加热回流3小时，静置，双层纱布过滤，取上 清液，如上重复提取1次，2次滤液合并，减压蒸发浓缩至1000ml ;
[0024] (3)将步骤⑵中获得的地皮菜提取液边搅拌边加入100ml亚铁氰化钾 (K4[Fe(CN) 6] · 3H20) (10.6% )，摇匀，再加入 100ml 乙酸锌（C4H804Zn) (21.9% )，振摇均 匀，以沉淀蛋白，室温下放置30分钟，5000rpm离心20分钟后取上清液，减压蒸发浓缩至 100ml ；
[0025] (4)将步骤（3)得到的浓缩液用截留量为3000的透析袋在蒸馏水中透析，每12 小时换水一次，直至透析液电导率几乎不变，得到除去离子和单糖等小分子杂质的透析液 120ml ；
[0026] (5)在步骤⑷得到的提取液中加入280ml无水乙醇，涡旋，室温放置1小时，以沉 淀多糖，然后5000rpm离心20分钟，收集沉淀；
[0027] (6)在步骤（5)得到的沉淀中加入50ml蒸馏水加热搅拌溶解，直至成均一液体，再 真空冷冻干燥成絮状物即得粗多糖样品，命名为NVPS，于4°C保存；
[0028] 采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖为标准品测定地木耳多糖含量。结果发现100g的地 木耳粉末中多糖含量约为8. 734g地木耳多糖样品（如图1所示）。
[0029] 实施例2 :选取对数生长期的MCF-7细胞，将细胞制成细胞悬液，通过细胞计数，每 孔4X104个接种到96孔板中，37°C、5% C02培养箱培养24小时待细胞贴壁后，弃掉旧的 培养基，加入不同多糖终浓度（〇、25、50、100、200、300ug/ml)的培养基，设5个平行孔，将培 养板继续培养24小时，每孔加入20 μ L5. Omg/mL MTT，再孵育4小时。移去板中培养液，每 孔加入150 μ L的DMS0溶解活细胞产生的甲瓒结晶，置摇床上振荡lOmin，在酶标仪于波长 570nm处测定各孔光吸光度。与对照孔相比如果含多糖提取物的孔吸光度的减少大于10% (也就是抑制率大于10% )，则认为该浓度下对细胞有毒性。
[0030] 细胞毒性实验结果表明：用不同浓度（25、50、100、200、300ug/ml)地木耳多糖 (NVPS)处理MCF-7细胞24小时，与对照相比抑制率分别约为7. 62 %、9. 25 %、9. 51 %、 5. 25%、8. 64%，抑制率均小于10%，所以NVPS在这些浓度下对细胞没有毒性（如图2所 示）。
[0031] 实施例3:
[0032] 选取对数生长期的MCF-7细胞，调整细胞浓度为每孔8 X 103个细胞/100 μ 1培养 液，加到96孔培养板中。37°C、5%C02培养箱中过夜培养。待细胞贴壁后取出培养板，更 换含不同浓度（〇、25、50、100、200、300ug/ml)地木耳多糖的培养基，设5个平行孔。培养 板放回培养箱中继续培养24小时和36小时，每孔加入20 μ L5. Omg/mL MTT，继续孵育4小 时。吸去板中培养液，每孔加入150μ 1的DMS0溶解活细胞产生的甲瓒结晶，置摇床上振荡 lOmin，在酶标仪于波长570nm处测定各孔光吸光度。
[0033] 本发明所得地木耳多糖（NVPS)，对人乳腺癌癌细胞株进行上述体外抗肿瘤活性检 测。结果表明：用不同浓度的NVPS(0、25、50、100、200、300ug/ml)处理MCF-7细胞24小时， 以及处理36小时，25、50、100ug/ml的NVPS对MCF-7抑制率均在20%左右及以下，而处理 36小时浓度在200、300ug/ml时，NVPS对MCF-7抑制率分别为57. 6%、73. 3%，与对照组相 比具有极显著性差异（P〈〇. 01)(如图3所示）。
【权利要求】
1. 一种地木耳抗肿瘤多糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： 第一步：取地木耳，60°c干燥2小时后粉碎，加蒸馏水加热回流3小时，静置，双层纱布 过滤，取上清液，如上重复提取1次，合并滤液，减压蒸发浓缩至粘稠状； 第二步：浓缩后的提取液边搅拌边加入10. 6%的亚铁氰化钾，摇匀，再加入21. 9%的 乙酸锌，振摇均匀，室温下放置30分钟，5000rpm离心20分钟后取上清液，减压蒸发浓缩至 粘稠状；所述的亚铁氰化钾、乙酸锌和提取液体积比为1 : 1 : 8-15; 第三步：用截留量为3000的透析袋，将第二步得到的浓缩液在蒸馏水中透析，每12小 时换水一次，直至透析液电导率不变； 第四步：在第三步得到的提取液中加入无水乙醇，涡旋，室温放置0.5-1小时，然后 5000rpm离心15-20分钟，收集沉淀；所述的提取液和无水乙醇体积比为3-2 : 7-8 ; 第五步：在上述沉淀中加入适量蒸馏水，50-6(TC下搅拌溶解，直至成均一液体，再真 空冷冻干燥成絮状物即得粗多糖样品，于4°C保存。
2. 如权利要求1所述的一种地木耳抗肿瘤多糖的制备方法，其特征在于，第二步中所 述的10. 6%亚铁氰化钾溶液、21. 9%乙酸锌溶液和提取液体积比为1 : 1 : 10。
3. 如权利要求1所述的一种地木耳抗肿瘤多糖的制备方法，其特征在于，第四步中所 述的提取液和无水乙醇体积比为3 : 7。
4. 如权利要求1所述的一种地木耳抗肿瘤多糖的制备方法，其特征在于，第五步中所 述的溶解沉淀加热温度为55°C。
5. 如权利要求1、2、3或4所述制备方法制得的地木耳抗肿瘤多糖。
6. 如权利要求5所述的地木耳抗肿瘤多糖在制备新型抗癌药物中的应用。
7. 如权利要求5所述的地木耳抗肿瘤多糖在制备保健品中的应用。
【文档编号】C08B37/00GK104193845SQ201410459857
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年9月11日 优先权日:2014年9月11日
【发明者】李卓玉, 郭敏, 郭松佳, 单树花, 李宗伟, 卢德赵, 李汉卿 申请人:山西大学