在固体表面保存核酸的方法及其保存液的制作方法
【专利说明】在固体表面保存核酸的方法及其保存液
[0001] _
技术领域
[0002]本发明涉及核酸的温度保存，尤其涉及在固体表面保存核酸的方法及其保存液。
[0003]
【背景技术】
[0004]能够从细胞裂解物和其他来源提取核酸的微流技术的发展促进了对生物样品的核酸进行快速分析。快速提取方法可以与聚合酶链式反应(PCR)之类的扩增技术组合以从血液、组织、培养的细胞或其他生物材料的微量样品中提取有用量的核酸。
[0005]然而，核糖核酸(RNA)是最难以保存的生物分子之一。因此，来自于生物样本的RNA的提取和保存是一个难点，那些降解RNA的条件不仅包括但不限于用于提取或收集的RNA，pH值，温度，还有最主要和特别的无处不在的强大的核糖核酸酶。
[0006]因此，RNA 一般需要存放在零下80度的环境下才能比较稳定，防止水解酶降解，保存最完整的RNA样品。当前在环境条件下以液体状态保存RNA的方法都集中在通过使用核糖核酸酶失活，例如,去垢剂,还原剂,过渡金属，有机溶剂,螯合剂,蛋白酶,核糖核酸酶肽抑制剂，抗RNA酶抗体。大多数市售的RNA保存产品，但只能保存在液体状态的RNA在室温下几天或几周。
[0007]因此，业界需要可成功将RNA的收集和稳定保存在干燥的固相载体上。
[0008]
【发明内容】
[0009]为了克服现有技术的不足，本发明旨在提供固体表面保存核酸的方法及其保存液。
[0010]为了达到上述发明目的，本发明的一个方面为一种在固体表面保存核酸的方法，其特征在于，包括如下步骤:
(a)制备保存液；(b)设置固相载体，并将所述保存液放置在所述固相载体上；(c)使得所述保存液干燥，以形成固相保存介质；(d)使得核糖核酸与所述固相保存介质混合，以形成保存混合物?’及(e)使得所述保存混合物干燥，从而在所述固相载体上保存所述核酸。
[0011]—些实施例中，所述固相载体为金属，并且所述金属固相载体的表面形成有多个圆形槽。
[0012]一些实施例中，在所述圆形槽的内周壁涂覆所述保存液，并且在所述孔的底部涂覆纤维素膜。
[0013]一些实施例中，所述步骤(c)中，对所述保存液进行冻干，以形成所述固相保存介质。
[0014]一些实施例中，所述步骤(d)中，所述核糖核酸为液相核糖核酸，并且沿所述内周壁将所述液相核糖核酸滴入所述圆形槽。
[0015]一些实施例中，所述步骤(e)中，使得所述混合物自然风干。
[0016]—些实施例中，包括:液相保存基质；及金属螯合剂。
[0017]一些实施例中，所述液相保存基质包括2-氨基-2 -羟甲基丙烷-1，3 - 二醇液(Tris),柠檬酸盐缓冲液，或磷酸盐缓冲液，或者它们的组合。
[0018]一些实施例中，所述液相保存基质还包括2 - (N-吗啉代)乙磺酸(MES)，3，(N_吗啉代)丙磺酸(M0PS)，或4 - (2 -羟乙基)_1 -哌嗪乙磺酸(HEPES)，或者它们的组合。
[0019]一些实施例中，还包括紫外保护剂，所述紫外线保护剂为氢醌单甲醚(MEHQ)，氢醌(HQ)，甲基氢醌(THQ)，抗坏血酸，或者它们的组合。
[0020]一些实施例中，还包括蛋白质变性剂，所述蛋白质变性剂为盐酸胍，异硫氰酸胍(GITC)，精氨酸钠，十二烷基硫酸钠(SDS)，或尿素，或者它们的组合。
[0021]一些实施例中，还包括还原剂，所述还原剂为二硫苏糖醇(DTT)，2_巯基乙醇(2-ME )，或三(2-羧乙基)膦(TCEP )，或者它们的组合。
[0022]一些实施例中，还包括RNA酶抑制剂，所述RNA酶抑制剂为氧钒核糖核苷复合物(VRC)的核苷酸类似物，或市售的RNA酶抑制剂。
[0023]本发明的优点在于，现有检测试剂盒一般是将样本存放于核酸保存液，待回到实验室后，使用其它提取方法进行提取，整个过程超过一个小时，如果样本多的情况下，提取时间还会大大延长，因此，提取速度决定了标本的一半以上的检测时间。本技术可以将细胞等样本放入核酸提取保存液后，并使DNA稳定保存于核酸提取保存液中，节省实验室提取核酸时间。
[0024]
【附图说明】
[0025]结合附图，参考下文对多个实施例的描述，可更全面地理解本发明，其中:
图1示出了根据本发明实施例之方法的流程图。
[0026]
【具体实施方式】
[0027]参见示出本发明实施例的附图，下文将更详细地描述本发明。然而，本发明可以以许多不同形式实现，并且不应解释为受在此提出之实施例的限制。相反，提出这些实施例是为了达成充分及完整公开，并且使本技术领域的技术人员完全了解本发明的范围。这些附图中，为清楚起见，可能放大了层及区域的尺寸及相对尺寸。
[0028]应理解，本发明的描述/图示为单个单元的部分可存在于两个或两个以上的物理上独立但合作实现所描述/图示之功能的实体。此外，描述/图示为两个或两个以上物理上独立的部分可集成入一个单独的物理上实体以进行所描述/图示的功能。
[0029]现通过详细说明根据本发明的固体表面保存核酸的方法及其保存液的较佳具体实施例，以对本发明做进一步阐述。
[0030]本实施例中，可对血清、血浆、细胞进行保存和裂解。细胞可例如包括口腔脱落细胞、上皮组织细胞等。然而，本发明不限于此，而是可对任何合适的需要进行DNA裂解和提取的样本进行保存。
[0031]根据本发明的实施例的核酸提取保存液，包括:缓冲液，非离子型表面活性剂，生物表面活性剂，及牛血清白蛋白。根据本发明的实施例，所述核酸提取保存液可对样本进行保存和DNA裂解。本实施例中，所述样本可为以阴道分泌物为代表的含有较多杂质和干扰物质的样本。
[0032]缓冲液含10mM Tris-HCl，pH为8.3-9.Ο (室温)，而在延伸温度(72 °C)下，pH值接近7.2。缓冲液中含有一种二价阳离子，用于激活DNA聚合酶的活性中心，一般使用Mg2+，有时使用Mn2+。一般以MgC12的形式提供，标准浓度为1.5mM。Mg2+浓度的高低会影响扩增的特异性和产率。缓冲液中还含有50mM的钾离子。有些缓冲液中还加入一些添加剂和共溶剂可降低错配率，提高富含G+C模板的扩增效率。
[0033]本实施例中，所述缓冲液包括Tris-HCl,氯化钾，或氯化镁，或者它们的组合。较佳实施例中，Tris-HCl的含量为20 — 400毫摩尔/升，氯化钾的含量为20 — 50毫摩尔/升，氯化镁的含量为1 一 3毫摩尔/升。
[0034]提供水中的一个离子缓冲浓度，此为常用的缓冲体系。Tris是一种双极性离子缓冲液，20°C 时其 pKa 值为 8.3，ApKa 值为-0.021/°C。因此，20mmol/l Tris-HCl (ρΗ8.3，20°C )。在实际PCR中，pH变化于6.8-7.8之间。改变反应液的缓冲能力，如将Tris浓度加大到50mmol/L，pH8.9，有时会增加产量。
[0035]反应混合液中50mmol/L以内的KCl，pH8.9有利于引物的退火，镁离子为DNA聚合酶酶催化过程中，结合到酶一底物结合体上，从而使催化反应的活化能更加降低。使得反应能够进行。
[0036]本实施例中，所述非离子型表面活性剂为聚山梨酯或聚乙二醇辛基苯基醚，或者它们的组合。较佳实施例中，所述聚山梨酯的含量为0.01%-1%质量百分比，聚乙二醇辛基苯基醚的含量为0.01%-1%质量百分比。
[0037]本实施例中，所述聚山梨酯可选用吐温20，以起到保护DNA聚合酶作用。所述聚乙二醇辛基苯基醚可选用Triton X-100，分子量为646.86 (C34H62011)，其能溶解脂质，以增加抗体对细胞膜的通透性。
[0038]本实施例中，所述生物表面活性剂为表面活性肽。较佳实施例中，所述表面活性肽的含量为0.01%-1%质量百分比。
[0039]牛血清白蛋白在生化实验中有广泛的应用，例如在western blot中作为Blockingage ;在酶切反应缓冲液中加入BSA，通过提高溶液中蛋白质的浓度，对酶起保护作用。防止酶的分解和非特异性吸附，能减轻有些酶的变性，能减轻有些不利环境因素如加热，表面张力及化学因素引起的变性的。本实施例中，所述牛血清白蛋白的含量为1-3毫克/毫升。
[0040]此外，根据本实施例的核酸提取保存液，还可包括0.1-1%质量百分比的十二烷基硫酸钠，0.01-1%质量百分比的蛋白酶K，及/或0.1-1%质量百分比的叠氮化钠。
[0041 ] 较佳实施例中，根据本实施例的核酸提取保存液还包括脱氧核苷三磷酸(dNTP)。脱氧核苷三磷酸是DNA合成的底物，标准的PCR反应体系中含有等摩尔浓度的4种dNTP，即 dATP、dTTP、dCTP 和 dGTP，浓度一般为 350-600 毫摩尔 / 升。
[0042]较佳实施例中，为了进一步加快后续的DNA分解，所述核酸提取保存液还可包括
0.1-2 U /毫升的DNA聚合酶。本实施例中，所述DNA聚合酶可为Taq DNA聚合酶，Tth DNA聚合酶，Vent DNA聚合酶，Pwo DNA聚合酶，或Pfu DNA聚合酶。
[0043]现详细描述根据本发明实施例的核酸提取保存液的实例。
[0044]需要30万级及以下洁净区，使用分子级别洁净水，除水及缓冲液之外的所有成分采购自成家SIGMA，使用大型烧杯和磁力搅拌器。
[0045]实例一