专利名称：一种多层电泳凝胶及其在核酸分离和制备中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物化学技术，特别是涉及核酸分离和制备中的电泳凝胶及其应用。
背景技术：
凝胶电泳是生物化学分离的最基本技术之一，在核酸分离分析和制备方面用得最普遍的凝胶是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。琼脂糖凝胶的浓度通常为0.7％-2％，适合分离几百至20,000碱基的较大的核酸分子，采用更高浓度的琼脂糖凝胶例如4％琼脂糖可分离小于100碱基的核酸，但太高浓度琼脂糖凝胶制作困难而且分辩率差，通常采用聚丙烯酰胺凝胶来分离这种小分子核酸；采用更低浓度的琼脂糖凝胶如0.5％琼脂糖可分离更大分子量的核酸，但太低浓度的琼脂糖凝胶制作困难机械强度太差，往往采用特殊的脉冲琼脂糖凝胶电泳技术来分离特大分子量的核酸。聚丙烯酰胺凝胶浓度通常为4％-20％，适合分离几十碱基至2,000碱基的较小的核酸，采用更低浓度聚丙烯酰胺凝胶如2.5-3％则机械性能很差或根本不能形成凝胶，而且提高核酸分离幅度极其有限，往往采用琼脂糖凝胶来分离大分子核酸。以上所谈分离核酸的范围是指聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶的总的分离范围，对于一个特定的胶即某个浓度的胶，它能分离核酸的范围均大大小于上述总的范围。例如，2％琼脂糖胶很难分离大于5000碱基的核酸，而0.5％琼脂糖胶很难分离小于500碱基的核酸，同样4％的聚丙烯酰胺凝胶很难分离小于100碱基的核酸，而20％的聚丙烯酰胺凝胶很难分离大于1000碱基的核酸。为了克服单一浓度胶分离核酸范围较小的缺点，扩展一个特定胶的分离范围，早就发明设计了胶浓度从胶顶部至低部逐步增高的聚丙烯酰胺梯度凝胶。琼脂糖凝胶是用水平方式铺板的，至今未见有梯度琼脂糖凝胶的报导。聚丙烯酰胺梯度凝胶虽然分离范围比单一浓度胶有所提高但存在若干缺点第一，梯度胶制作比较困难，需专门的设备。第二，胶与胶之间及同一胶内不同纵切面的梯度变化往往不匀一，造成不同电泳行的核酸迁移速度不一。第三，无论是线性梯度还是指数梯度凝胶，凝胶的浓度是按这二种规律以无级的方式变化，指定梯度凝胶的上限和下限后选择变化的空间就很有限。第四，梯度凝胶设计的原意是想通过浓度的梯度变化，既顾及较大分子核酸的分离又顾及较小分子核酸的分离。但是，正因为梯度凝胶的胶浓度呈无级改变，最适合某分子量核酸分离的区间很短。例如4％浓度适合分离2000碱基的核酸，但在4-20％的梯度胶内适合2000碱基核酸分离的4％浓度胶层仅存在于顶部，大分子核酸还未分开就进入浓度较低的胶层了。同样20％浓度的胶适合分离20碱基的小分子核酸，但在4-20％的梯度凝胶内适合分离20碱基的20％浓度胶仅仅存在于胶的底部，尚未很好分开的小分子一旦进入适合其分离的胶层电泳也就得宣告结束。随着分子生物学和临床医学研究的发展，单一浓度凝胶或梯度聚丙烯酰胺凝胶不能满足各种核酸分离检测的需要。例如PCR，基因克隆和限制性核酸内切酶作用后的片段分析，往往需要在同一凝胶上既分离显示分子量极大的核酸又要检测另一个分子量相当小的核酸，或者需要在二个核酸区段内均有较高的分辩率。目前尚无一种多层凝胶特别是双层凝胶，凝胶内分二个或二个以上浓度层次，它既不同于浓度固定不变的单一层凝胶，又不同于浓度呈无级变化的梯度胶。多层凝胶有分离范围宽、分辩率高和性能变化多端能满足不同需要等优点，其性能超过现有的各种单一浓度凝胶和梯度聚丙烯酰胺凝胶。
发明内容
本发明所要解决的技术问题本发明提供一种多层电泳凝胶及其在核酸分离和制备中的应用，以克服现有的浓度固定不变的单一层凝胶和浓度呈无级变化的梯度凝胶分离范围窄、分辩率低和性能缺乏变化以及不能满足不同需要等缺点。
技术方案本发明提供的一种多层电泳凝胶，其各层凝胶由聚丙烯酰胺和琼脂糖两种组分构成，或由不同浓度的聚丙烯酰胺凝胶、或不同浓度的琼脂糖凝胶所构成。
上述的电泳凝胶，其不同组分或不同浓度的凝胶之间的界面与电泳方向垂直、平行或者斜向相交，优选界面与电泳方向垂直。
本发明的另一种技术方案为上述的电泳凝胶，其不同组分或不同浓度的凝胶之间的pH值不同。或者，其各层凝胶分别含有核酸的染色剂、变性剂、显色剂、交联剂、核酸探针、抗体或者组蛋白的成分。
上述的多层电泳凝胶，按其制作和使用的方式可分为垂直夹板式凝胶或水平式凝胶。
以上所述的多层电泳凝胶在核酸分离和制备中的应用，与现有技术的不同在于核酸在各个凝胶层中的迁移速度均有差异，优选由不同核酸分子在凝胶层中的迁移速度差异较大的单层凝胶组成。
上述的多层电泳凝胶在核酸分离和制备中的另一应用方案为，多层凝胶为界面垂直于电泳方向的水平式琼脂糖凝胶，优选由两层不同浓度的琼脂糖凝胶组成的水平式凝胶。
本发明的多层凝胶在制作和应用上与现有的单层或者梯度凝胶有着显著的差异，同时也带来了独特的技术效果，总结如下1〕本发明的多层电泳凝胶，就实际应用而言通常为双层凝胶，根据需要可设计为三层或更多层。
2〕本发明的多层凝胶的每一层凝胶都起分离作用，它有别于分离蛋白质用的SDS-聚丙烯酰胺凝胶，该种凝胶的点样层仅有浓缩功能而无分离作用。
3〕本发明的多层凝胶主要用于核酸的分离，但也可用于其他生化物质的分离。
4〕本发明多层胶制作方便，除了常规的的灌胶设备不需要添任何装置。
5〕本发明的多层凝胶可用于各种垂直式凝胶如垂直板式聚丙烯酰胺凝胶。也可用于各种水平式凝胶如琼脂糖凝胶。
6〕本发明的多层凝胶可以是同一种凝胶，层与层之间仅浓度不同，例如一层低浓度聚丙烯酰胺凝胶和一层高浓度聚丙烯酰胺凝胶，或一层低浓度琼脂糖凝胶和一层高浓度琼脂糖凝胶。本发明的多层凝胶也可以各种性质不同的凝胶，例如一层聚丙烯酰胺凝胶和一层琼脂糖凝胶。
7〕本发明多层凝胶在层与层之间的浓度差别和长度比例上没有限制。针对既定的核酸分离要求，例如最大与最小目标分离核酸的分子量，在一个以上区段内二个目标核酸均有高的分辩率等等来设计出最适合的多层凝胶。
8〕本发明的多层凝胶就应用而言主要是横向分层，即在与电泳走向垂直的方向上分二层，但也可根据需要作纵向分层，即在与电泳走向平行的方向上分层，也可以斜向分层，既有横向又有纵向分层，或任何其他方式的分层。从制作方便角度考虑，分层方式较复杂的各种多层凝胶更适合于水平式凝胶。
9〕本发明的多层胶的层与层之间除浓度可不同外，还可根据需要在某一层中加核酸染色剂而另一层中不加，也可在不同层中加不同的染色剂，也可加与不加，或加不同的符合需要又与电泳原理不违背的其他物质。
10〕本发明多层凝胶是在单一浓度胶基础上发展起来的，它简单而又有效地能改进了电泳的分离范围和分辩率。这种改进完全不依赖于凝胶本身的特性。凝胶本身特性改进如凝胶原料质量，添加剂成份，pH等等使电泳分离范围和分辩的提高，均不会限制本发明的应用，换言之，在各种改进的基础上再使用多层胶将会使分离范围和分辩更高。
具体实施例方式
实施例1.
包括4个聚丙烯酰胺凝胶电泳。其中，4-20％聚丙烯酰胺梯度凝胶系美国伯乐公司(Bio-rad)产品，4％单一浓度聚丙烯酰胺凝胶、15％单一浓度聚丙烯酰胺凝胶和上层为4％浓度聚丙烯酰胺下层为15％浓度聚丙烯酰胺的双层凝胶均用伯乐公司出品的灌胶装置制备。胶的长度均为7cm，实际胶的走距为6-6.5cm。所有胶均用伯乐公司生产的与胶大小匹配的小型垂直式电泳槽。单层胶按常规方法灌注。制备双层胶时先灌注下层高浓度胶，待下层凝固后再加上层高浓度胶并放好点样梳子，待全部胶凝固后去除梳子开始点样电泳。每个胶分别加标准核酸A15μL，标准核酸B和C各10μL。各种标准核酸的名称和所含核酸条带数和每一条带的碱基数列于表1。
表1.用于本发明的标准DNA
加样缓冲液为Promega出的6X加样染料含10mMTris-HCl，pH7.5和50mM-EDTA，和橙G，溴酚蓝和二甲本青蓝FF三种指示染料，其浓度分别为0.03％，0.03％和0.4％。除商品梯度胶采用TBE电泳液外均采用TAE电泳液。电泳时电压均固定为100V，当橙色指示染料到胶底线，即走胶6.5-7cm时停止电泳。取出凝胶用0.1ug/ml溴乙锭染色10分钟，然后用图象仪扫描核酸条带并记录结果。
扫描的结果表明4％单一浓度琼脂糖胶能分离较大的核酸，分离上限为3kb，但不能分离小于100bp的核酸。15％的单一浓度琼脂糖胶能分离小分子核酸，下限为20bp，但不能分离大于1.5kb的核酸。4-20％的商品梯度胶的分辩范围与15％单一浓度胶相比基本相同无明显改进。本发明的4％浓度和15％浓度各半的双层胶则能分离小至20bp大至3kb的核酸。
实施例2.
包括3个琼脂糖凝胶电泳，铺胶和电泳槽为小形普通水平式商品电泳槽，胶长和实际走胶距离分别为7和6.5cm。0.8％和2％单一浓度琼脂糖胶按常规方法铺胶。制备0.8％和2％双层胶时先以2％浓度琼脂糖铺胶，待凝固后用刀将胶切割一分为二，移走靠点样部位的一半胶，然后再铺浓度为0.8％的凝胶，使之达到同样厚度并加点样梳子。待凝胶全部凝固后点样电泳，所有条件与实施例1相同，但溴乙锭染色时间为30分种。结果表明0.8％单一琼脂糖凝胶能分离分子量达23kb的大分子核酸，但对分子量低于500bp的小分子核酸的分辩频率很差。2％单一的琼脂糖能分离分子量为100bp以上的小分子核酸，但对分子量高于5kb的大分子核酸分辩率很差。本发明的0.8％和2％的双层琼脂糖凝胶则既能分辩低至100bp的小分子核酸，又能分辩高至23kb的大分子核酸。
实施例3.
由琼脂糖和聚丙烯酰胺组成的垂直式双层凝胶，凝胶灌注装置和垂直式电泳槽与实施例1相同。先灌注8％聚丙烯酰胺凝胶，灌注高度为胶长度的一半，待下层凝固后再灌注1.2％的上层琼脂糖胶并加好点样梳子。待全部凝胶凝固后去除梳子点样并电泳，所有条件与实施例1相同。结果表明由琼脂糖和聚丙烯酰胺组成的双层凝胶既能分离低至20bp的小分子核酸，又能分离高至10kb的大分子核酸，其分离范围之宽超过了实施例1和2所示结果，也超过各种单一浓度或梯度商品胶所宣称的分离范围(表二)。
表2.各种商品单一浓度胶和梯度胶分离核酸的范围(走胶长度为6-8cm)
实施例4.
由1％和2％二层琼脂糖凝胶和一层10％聚丙烯酰胺凝胶组成的多层凝胶，在水平电泳槽上铺板并用水平电泳槽电泳。先按常规铺2％琼脂糖胶，待凝固后在胶的上下二侧各切割去除约三分之一的胶。然后在胶的上方铺1％琼脂糖胶并加点样梳子，在下方铺10％的聚丙烯酰胺凝胶，为避免氧对聚合的抑制作用在胶的上面轻轻复盖一张塑料薄膜，待胶凝固后移去薄膜。点样，电泳和染色的条件与条施例2相同，标准核酸D和E的加量也为10ul。结果表明此三层凝胶既能分离高至23kb的大分子核酸又能分离低至几十硷基的小分子核酸，在几百至10kb的范围内均显示很高的分辩率。
实施例5.
由二块1％琼脂糖凝胶按纵向分层(与电泳方向平行)组成的双层凝胶，左侧和右测分别含0.5ug/ml的核酸染色剂溴乙锭和SYBR金。二种核酸染色剂的灵敏度和最适激发光波长等特性不同。制备时先准备含0.5ug/ml溴乙锭的1％琼脂糖胶，按常规方法铺水平胶，并加点样梳子，待凝固后去除点样梳子，用刀片按纵向切割成二块，移去右侧一块留下左侧一块然后将点样梳插回原来的孔中，再在右侧灌注含0.5ug/mlSYBR金的1％琼脂糖，待全部凝固后再除去梳子点样电泳，条件与实施例4相同，电泳结束后免去染色步骤直接用图象仪检测记录。扫描时分别采用图象仪设定的溴乙锭和荧光素二个不同激发光的检测程序，应用二层胶可以方便，准确地在同一电泳凝胶内比较观察二种染色剂对核酸迁移速度的影响，染色剂的灵敏度和不同激发光对不同染色剂核酸显色的影响。
本实施例例结果表明含SYBR金的胶核酸迁移较慢，因为广泛的研究表明琼脂糖凝胶中预混溴乙锭对核酸迁移基本上无影响已广泛被采用，这就说明在所试条件下SYBR金对核酸迁移略有阻滞作用。但是，试验清楚地表明SYBR金的灵敏度显著高于溴乙锭，可使用的激发光波长范围又较宽，并且对大小分子的显色比较匀一。而预混溴乙锭染料方法在本试验条件下对小分子核酸的显色很弱，这可能是因为溴乙锭在电泳过程中较快的迁向负极即胶的上方，当小分子核酸到达胶的下方时该部分胶的染色剂可能已不复存在。
总之多层胶为比较在凝胶中预混染色剂的优劣利弊提供了十分简单和可比性强的方法。在分子生物研究中常常需要分析同一样品中以等克分子量存在的大小县殊的二种核酸，例如从一个5kb的质粒中切割出一个200碱基的插入片段，一个2kb的核酸片段用限制性核酸内切酶切割成1950和50硷基的二个片段，这些情况下大片段的含量将是小片段的几十倍，这不仅在选择凝胶进行分离比较相当困难，在选择染色剂和图象分析仪的的灵敏度及反差上也往往顾此失彼，如果采用浓度不同的双层胶，并且在上层即大分子核酸停留的部分预混灵敏度较低的染色剂，而在在下层即小分子量核酸停留的部分预混灵敏较高并且在电场中不迁移或迁移很慢的染色剂，这类经常迂到的实际问题便可迎刃而解。
权利要求
1.一种多层电泳凝胶，其特征在于各层凝胶由聚丙烯酰胺和琼脂糖两种组分构成，或由不同浓度的聚丙烯酰胺凝胶、或不同浓度的琼脂糖凝胶所构成。
2.根据权利要求1所述的电泳凝胶，其特征在于不同组分或不同浓度的凝胶之间的界面与电泳方向垂直、平行或者斜向相交。
3.根据权利要求1所述的电泳凝胶，其特征在于不同组分或不同浓度的凝胶之间的界面与电泳方向垂直。
4.根据权利要求1所述的电泳凝胶，其特征在于不同组分或不同浓度的凝胶之间的pH值不同。
5.根据权利要求1所述的电泳凝胶，其特征在于各层凝胶分别含有核酸的染色剂、变性剂、显色剂、交联剂、核酸探针、抗体或者组蛋白的成分。
6.根据权利要求1所述的电泳凝胶，其特征在于多层凝胶为垂直夹板式凝胶或水平式凝胶。
7.权利要求1所述的多层电泳凝胶在核酸分离和制备中的应用，其特征在于核酸在各个凝胶层中的迁移速度均有差异。
8.根据权利要求7所述的多层电泳凝胶在核酸分离和制备中的应用，其特征在于多层凝胶是由不同核酸分子在凝胶层中的迁移速度差异较大的单层凝胶组成。
9.根据权利要求7所述的多层电泳凝胶在核酸分离和制备中的应用，其特征在于多层凝胶为界面垂直于电泳方向的水平式琼脂糖凝胶。
10.根据权利要求9所述的多层电泳凝胶在核酸分离和制备中的应用，其特征在于多层凝胶为两层不同浓度的琼脂糖凝胶组成的水平式凝胶。
全文摘要
本发明提供一种用于分离核酸和其他生化物质的电泳凝胶及其应用，这种多层凝胶由聚丙烯酰胺和琼脂糖两种组分构成，或由不同浓度的聚丙烯酰胺凝胶、或不同浓度的琼脂糖凝胶所构成。特别是由二层不同浓度的同一种凝胶或二层不同性质的凝胶所组成。多层凝胶制备方法简单，形式变化多样可满足不同分离分析要求。在分离范围和分辨率上优于单一浓度凝胶和梯度凝胶。适用于核酸和其他生化物质的分离和制备。
文档编号C07H21/00GK1583778SQ03150449
公开日2005年2月23日 申请日期2003年8月19日 优先权日2003年8月19日
发明者徐定邦, 朱德芬, 谢文凯, 徐文慧 申请人:徐定邦, 徐文慧