一种新型核酸染料的制备及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种新型核酸染料的制备及其应用，W用 于聚丙帰醜胺凝胶电泳中核酸的染色。
【背景技术】
[0002] 带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。核酸电泳是进行核酸研究的重要手 段，是核酸探针、核酸扩增和序列分析等技术所不可或缺的组成部分。核酸电泳通常在琼脂 糖凝胶或聚丙帰醜胺凝胶中进行，浓度不同的琼脂糖和聚丙帰醜胺可形成分子筛网孔大小 不同的凝胶，可用于分离不同分子量的核酸片段。对于分子量较大的样品，如大分子核酸、 病毒等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。聚丙帰醜胺凝胶电泳是网状结 构，具有分子筛效应、浓缩效应、电荷效应，对于小片段DNA巧bp-5(K)bp)的分离效果最好。 琼脂糖凝胶约可区分相差lOObp的DNA片段但，其分辨率比聚丙帰醜胺凝胶低，如果需要分 辨率高的电泳，特别是只有几个bp的差别应该选择聚丙帰醜胺凝胶电泳，而且进行高压电 泳时，只能使用聚丙帰醜胺凝胶。
[0003] 聚丙帰醜胺凝胶通过丙帰醜胺单体、链聚合催化剂N，N，N'，N'-四甲基己二胺 灯EMED)和过硫酸倭W及交联剂N，N'-亚甲双丙帰醜胺之间的化学反应而形成。丙帰醜胺 单体在催化剂作用下产生聚合反应形成长链，长链经交联剂作用交叉连接形成凝胶，其孔 径由链长和交联度决定。链长取决于丙帰醜胺的浓度，调节丙帰醜胺和交联剂的浓度比例， 可改变聚合物的交联度。聚丙帰醜胺凝胶电泳可根据电泳样品的电荷、分子大小及形状的 差别达到分离目的，兼具分子筛和静电效应，分辨力高于琼脂糖凝胶电泳，可分离只相差1 个核巧酸的DNA片段。
[0004] 相比于琼脂糖凝胶，聚丙帰醜胺凝胶是密集程度更高的H维空间的高聚物，送种 高密集聚合物结构，使得在分离不同大小范围、不同浓度范围的的核酸分子时，作为核酸凝 胶染料的英光染料很难渗透进去W致核酸染色效果不佳。原有的部分核酸染料也可W用 于染色聚丙帰醜胺凝胶中的DNA，例如美国Biotium.Inc.生产的GelRed/GelGreen,美国 LifeTechnologies公司的SYBRSafeW及通常用的化hidiumE^romide,但是都存在染色 效果不佳，或者核酸染料本身具有高毒性、高危害性，比如；GelRed/GelGreen独特的油性 和大分子量特点使其不能穿透细胞膜进入细胞内，艾姆斯氏试验结果也表明，该染料的诱 变性远远小于邸，但GelRed/GelGreen的大分子量特点使其在难W穿透细胞膜的同时也 难W渗透高密集的聚丙帰醜胺凝胶，因而存在染色效果不佳的缺陷；SYBRSafe的诱变性比 邸要低的多，但检测灵敏性较低。
[0005] 综上所述，现有技术存在两大问题：
[0006] 第一个是因为聚丙帰醜胺凝胶是密集程度更高的H维空间的高聚物，送种高密集 聚合物结构，使得在分离不同大小范围、不同浓度范围的核酸分子时，现有的多种作为核酸 凝胶染料的英光染料很难渗透进去W致核酸染色效果不佳，因此，需要从分子结构上做改 进，从而使小分子的英光染料可W更容易的渗透到送种高密集程度的高聚物中；
[0007]第二个问题是，现有的多种核酸染料本身具有高毒性、高危害性，因为送些核酸染 料可W穿透细胞膜，从而和细胞里面的DNA分子结合，导致产生基因突变，具有强致癌性。
【发明内容】
[0008]为解决上述技术问题，本发明提供了一种新型核酸染料的制备方法与应用，W获 得具有染色性能好、毒性低的核酸染料用于聚丙帰醜胺凝胶电泳。
[0009] 为达到上述目的，本发明的技术方案如下：
[0010] 本发明提供了一种新型核酸染料，其结构通式如下：
[0011]
[001引其中，Ri、Rz、R3为小于六个碳的烷基；
[001引n的取值范围为2-6 ;
[0014]R4为礙酸基，为在菲巧6号位苯取代基上的任一位置上的取代基团。
[0015] 其中，所述Ri、R2、R3为C1-C4的烷基；优选的，所述Ri为C1-C3的烷基、R2与Rs为 C2-C4的烷基；优选的，所述Ri为甲基，所述R2与Rs为己基。
[0016] 其中，所述n的取值范围为2-4;优选的，所述n=3。
[0017] 本发明又提供了一种上述新型核酸染料的制备方法，包括如下步骤：
[0018] 1);由原料3, 8-二氨基-6-苯基菲巧在体系中反应获得中间体I，即： 「00191
[0023]2);由中间体I在体系中反应获得中间体II，即：
[0024]
[00巧]其中：
[002引
为中间体II;
[0027] 3);由中间体II与胺基反应获得中间体III，即：
[0028]
[0031] 4);由中间体III与漠化氨反应获得中间体IV，即：
[0032]
[003引其中：
[0034] 皿r为漠化氨，
[003引
为中间体IV;
[0036] 5);由中间体IV经过礙化反应继而经过贿化钢处理获得终产物，即；
[0037]
[003引其中：
[00測化I为贿化钢；
[0040]
为终产物，即产品核酸染料。
[0041] 优选的，所述步骤1)中3,8-二氨基-6-苯基菲巧与氯甲酸己醋在溶剂体系中反 应生成中间体I，即：
[0042]
[0045] Pyridine为化巧；
[004引DMF为二甲基甲醜胺。
[0047] 优选的，所述步骤2)中反应温度为80-13(TC，即；
[0048]
[0049] 优选的，所述步骤3)中合成中间体III是在溶剂体系中进行的，所述溶剂为低碳 醇溶剂，优选的为甲醇溶剂，即；
[0050]
[0051] 优选的，所述步骤4)中采用的为浓度为10-60%HBr溶液，即；
[0052]
[0053] 优选的，所述步骤5)中采用的为发烟硫酸，优选的为30%fumingH2SO4,即；
[0054]
[00巧]其中，R4为礙酸基，为在菲巧6号位苯取代基上的任一位置上的取代基团。
[0056] 本发明又提供了一种上述核酸染料在聚丙帰醜胺凝胶电泳或琼脂糖凝胶电泳中 的应用。
[0057] 通过上述技术方案，本发明提供的一种新型核酸染料，其在保持了作为优良核酸 染料的高敏感性、高稳定性、同现有检测仪器兼容的情况下，本发明从分子结构上做了改 进，从而可W很容易的渗透到聚丙帰醜胺凝胶送种高密集程度的高聚物中，即原来的核酸 染料分子是大分子结构，而本发明所包括的产品都是小分子结构，从而解决了作为核酸凝 胶染料的英光染料很难渗透进去W致核酸染色效果不佳的技术难点。另外，本发明从分子 结构上做了改进，增加了产品本身所携带电荷量，从而不能够穿透细胞膜，达到了高安全标 准，因此，本产品亦解决了通常核酸染料所具有的高毒性问题。
【附图说明】
[0058]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0059] 图1为本发明实施例所公开的中间体IV的质谱图；
[0060] 图2为本发明实施例所公开的终产物的核磁共振谱图；
[0061] 图3显示为本发明实施例所公开的终产物与核酸染料Gelred用于核酸染色后的 凝胶电泳效果对比图；
[0062] 图4显示为本发明实施例所公开的终产物与化化（漠化己锭）用于核酸染色后的 凝胶电泳效果对比图；
[0063] 图5显示为本发明实施例所公开的终产物与SYBRSafe核算染料的安全性能测试 对比结果。
【具体实施方式】
[0064] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完 整地描述。
[0065] 本发明提供了一种新型核酸染料，其结构通式如下：
[0066]
[0067]其中，Ri、尺2、Rs为小于六个碳的烷基；
[006引n的取值范围为2-6 ;
[0069]R4为礙酸基，为在菲巧6号位苯取代基上的任一位置上的取代基团。
[0070] 其中，所述Ri、R2、R3为C1-C4的烷基；优选的，所述Ri为C1-C3的烷基、Rz与Rs为 C2-C4的烷基；优选的，所述Ri为甲基，所述R2与Rs为己基。
[0071] 其中，所述n的取值范围为2-4 ;优选的，所述n=3。
[0072] 本发明又提供了一种上述新型核酸染料的制备方法，包括如下步骤：
[0073] 1);由原料3, 8-二氨基-6-苯基菲巧在体系中反应获得中间体I，即：
[0074]
[0078] 2);由中间体I在体系中反应获得中间体II，即：
[0079]
[0082] 3);由中间体II与胺基反应获得中间体III，即：
[0083]
[0086] 4);由中间体III与漠化氨反应获得中间体IV，即：
[0087]
[0091] 5);由中间体IV经过礙化反应继而经过贿化钢处理获得终产物，即；
[0092]
[0096] 实施例1 ;
[0097] 由原料3, 8-二氨基-6-苯基菲巧与氯甲酸己醋反应获得中间体I，其反应方程式 为：
[0098]
[0099] 其反应过程为：
[0100] ①在装有机械揽拌装置的H口烧瓶中，加入DMF，将1摩尔的3, 8-二氨基-6-苯基 菲巧加入其中，同时揽拌；随后加入2摩尔量的化巧，降温到0°C-5C;
[0101] ②2摩尔量的氯甲酸己醋被缓慢加入①的反应体系中，滴加过程中温度不能超过 15°C，TLC跟踪到反应结束；
[0102] ⑨此时得到粘稠状固体，抽滤除去化巧及DMF，剩余固体倒入水中充分洗涂；洗涂 完毕，得到的固体真空干燥，得到产品中间体I，产率为90%。
[0103] 实施例2 :
[0104] 由实施例1所获得的中间体I在体系中反应获得中间体II，其反应方程式为： [01051
[0106] 其反应过程为：
[0107] ①在装有机械揽拌装置的H口烧瓶中，加入等摩尔量的中间体I和1，3-2贿丙焼， 在105°C-115C下反应3-4天；