[010引②向反应体系①中加入过量己酸己醋，加热回流1小时然后冷却到室温，过滤；剩 余固体真空干燥，得到中间体II，产率为73%。
[0109] 实施例3 :
[0110] 由中间体II与N，N-二己基甲胺在溶剂体系中反应获得中间体III，其反应方程式 为：
[0111]
[0112] 其反应过程为：
[0113] ①在装有机械揽装置和回流冷凝器的H口烧瓶中，加入1摩尔量的中间体II和20 摩尔量的N，N-二己基甲胺及过量甲醇，回流20小时，用TLC监视反应进程至反应结束；
[0114] ②将反应体系①降温至室温，抽滤收集产品，用过量己酸己醋洗涂滤饼固体；固体 在45°C-5(TC真空干燥至恒重即为中间体III，产率为75%。
[011引 实施例4;
[0116] 由中间体III与漠化氨反应获得中间体IV，其反应方程式为：
[0117]
[011引其反应过程为：
[0119] ①在带有揽拌器的1LH口烧瓶中，加500毫升浓度为48%的漠化氨水溶液，缓 慢将1摩尔量的中间体III加入漠化氨水溶液中；加入后，室温揽拌1小时；然后加热到 10(TC-11(TC，直到TLC检测反应结束；
[0120] ②反应结束，将反应物放到化烧杯用冰揽拌降温；用475mL氨水调低温反应液的 PH值到7-8 ;控制氨水的滴加速度，控制0°C-1(TC，必要时使用冰块降温；然后静止24小 时，析晶抽滤搜集产品即为中间体IV，产率为78%。
[0121] 参考图1，中间体IV的质谱分析方法如下：所得中间体IV经过贿化钢处理结晶析 出，所得晶体溶解于甲醇然后经过质谱测试，所得分子量为541，而此晶体的分子结构式为： C27H34N4I2;在质谱制备的过程中，此晶体发生离子化，分子结构式变为。2用34肿(带一个正电 荷)，分子量正是541，即质谱分析结果证明制备的中间体IV结构正确。
[012引实施例5;
[0123] 由中间体IV与礙酸基反应合成终产物，其反应方程式为：
[0124]
[01巧]其反应过程为：
[0126] ①125ml发烟硫酸降温到-1(TC，12. 5g原料中间体IV在揽拌条件下加到发烟硫 酸中，Ig-次，共12次，大约2小时加完；中间体IV投加完毕，揽拌至室温，TLC检测反应至 结束；
[0127] ②用250ml水溶解250g贿化钢，降温至-1(TC;将上述反应液①降到-2(TC并缓慢 加到贿化钢溶液中；加完后低温揽拌1小时，出现大量悬浊物；抽滤，收集固体，固体被加入 到300ml己氯中揽拌溶解，再揽拌24小时，直到没有沉淀；再加入600ml己離，揽拌，抽滤， 得到红色固体，抽滤得产品；固体产品真空干燥得到最终产品，产率为83%。
[012引参考图2,终产物在DMS0d6溶剂中的核磁共振（NMR)分析显示其结构式如下：
[0129]
[0130] 其中：位于1. 1左右的氨的数目为6个，对应两个己基CH2CH3中的C&中的6个 氨；位于2. 2左右的是甲基中的3个氨；位于2. 5左右的超大峰来自于溶剂峰；位于2. 9左 右的是连接两个N的CH2CH2CH2中的中间的CHz上的2个氨；3. 3左右的是左右的是连接两 个N的CH2CH2CH2中的两个端头上的邸2上的4个氨加两个己基（Et，即邸2邸3)中的邸2上 的4个氨；在4-5之间的氨为N&中的氨(部分可能与水进行了交换);位于芳香区域上的氨 为10个氨；所得氨数目同终产物氨数目相同。
[013。 实施例6;
[0132] 参考图3,本发明终产物与核酸染料Gelred的染色效果对比结果显示，使用本发 明提供的核酸染料pagegelred可W获得比常规核酸染料Gelred更优异的染色效果，用于 大分子核酸分离实验时可W更有效的对不同碱基对的DNA片段进行观察区分，其具体实验 条件如下：
[0133] ①核酸染料浓度：3XGelred与加Mpagegelred(本发明终产物）；
[0134]②所用凝胶为：15〇/〇ac巧lamideT邸gels(Criteriongels,BioRad);
[0135] ⑨后染30分钟，然后用水脱色15分钟；
[013引④从左到右：肥BlowMWladde巧Ong, 25ng, 12. 5ng;
[0137]⑤ 2sexposureunderEl:BrFilter。
[0138] 实施例7;
[013引参考图4,本发明终产物与化化（漠化己锭細比，本发明终产物不仅毒性极低，且 又能获得高于化化（漠化己锭）的染色效果；由图4可知，采用化化进行染色后的核酸在 凝胶电泳测试时存在严重拖尾现象，从而导致不同碱基对DNA片段区分效果较差；而采用 本发明提供的pagegelred核酸染料在同样条件下获得的凝胶电泳测试结果可知，不同碱 基对DNA片段的区分较为明显，不存在拖尾现象，其具体实验条件如下：
[0140] ①核酸染料浓度：5ug/mL化化与加Mpagegelred(本发明终产物）；
[014"②所用凝胶为：100/0ac巧lamideTBEgels(Criteriongels,BioRad);
[0142] ⑨后染30分钟；
[0143]④从左到右：肥BlowMWladderlOOng, 50ng;
[0144] ⑤ 2sexposureunderEl:BrFilter。
[014引实施例8;
[0146] 基于实施例6及实施例7的通用电泳方法如下：
[0147] ①按照常规方法进行电泳；
[014引②用&0将GelRedlOOOOX储液稀释约3300倍到0. 1M化C1中，制成3X染色液 (其他英光染料依据稀释比例制备相应浓度）；
[0149] ⑨将凝胶小必地放入合适的容器中，如聚丙帰容器中，缓慢加入足量的3X染色 液(或相应浓度其他染色液）浸没凝胶；
[0150] ④在室温下轻轻摇动凝胶板即振荡染色1个小时左右；
[0151] ⑤紫外下观察结果。
[015引实施例9;
[0153]图5显示的为针对实施例5获得的终产物与SYBRSafe核酸染料的安全性能测试 对比结果，其测试条件如下：
[0154] ①Hela细胞在37摄氏度下分别在IXpagegelred和IXSYBRSafe内培育30 分钟；
[015引②所得样品在英光显微镜下拍照，SYBRSafe曝光时间为200毫砂，化gegelred曝光时间为400毫砂；
[0156] ⑨化gegelred选用切3滤光片，SYBRSafe用的是FITC滤光片；
[0157] ④参考图5,可W清楚看到SYBRSafe能够很快穿透细胞壁并将核酸部分染色；而 化gegelred因为不能穿过所W几乎看不到任何被染色的物质，故本发明获得的核酸染料 对细胞具有优异的安全性能。
[015引对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。 对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的 一般原理可W在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明 将不会被限制于本文所示的送些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一 致的最宽的范围。
【主权项】
1. 一种新型核酸染料，其特征在于，其结构通式如下：其中，Ri、R2、R3为小于六个碳的烷基；n的取值范围为2-6 ; R4为礙酸基，为在菲巧6号位苯取代基上的任一位置上的取代基团。2. 根据权利要求1所述的一种新型核酸染料，其特征在于，所述Ri、R2、R3为C1-C4的 烷基。3. 根据权利要求2所述的一种新型核酸染料，其特征在于，所述n的取值范围为2-4。4. 一种如权利要求1所述的新型核酸染料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： 1) :由原料3, 8-二氨基-6-苯基菲巧在体系中反应获得中间体I，即：2) ;由中间体I在体系中反应获得中间体II，即；3) ;由中间体II与胺基反应获得中间体III，即：其中：4) ;由中间体III与漠化氨反应获得中间体IV，即；其中： 皿r为漠化氨，为中间体IV; 5) ;由中间体IV经过礙化反应继而经过贿化钢处理获得终产物，即；其中： 化I为贿化钢；为终产物，即产品核酸染料。5.根据权利要求4所述的一种新型核酸染料的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中 3, 8-二氨基-6-苯基菲巧与氯甲酸己醋在溶剂体系中反应生成中间体I，即：Pyridine为化巧； DMF为二甲基甲醜胺。6. 根据权利要求5所述的一种新型核酸染料的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中 反应温度为80-13(TC，即；7. 根据权利要求6所述的一种新型核酸染料的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中 合成中间体III是在溶剂体系中进行的，所述溶剂为低碳醇溶剂，优选的为甲醇溶剂，即：8. 根据权利要求7所述的一种新型核酸染料的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中 采用的为浓度为10-60%HBr溶液，即；9. 根据权利要求8所述的一种新型核酸染料的制备方法，其特征在于，所述步骤5)中 采用的为发烟硫酸，优选的为30%fumingH2SO4,即；其中，R4为礙酸基，为在菲巧6号位苯取代基上的任一位置上的取代基团。10. 权利要求1至9任一项所述的核酸染料在聚丙帰醜胺凝胶电泳或琼脂糖凝胶电泳 中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种结构通式为的新型核酸染料，其在保持了作为优良核酸染料的高敏感性、高稳定性、同现有检测仪器兼容的情况下，从分子结构上做了改进，从而可以很容易的渗透到聚丙烯酰胺凝胶这种高密集程度的高聚物中，即原来的核酸染料分子是大分子结构，而本发明所包括的产品都是小分子结构，从而解决了作为核酸凝胶染料的荧光染料很难渗透进去以致核酸染色效果不佳的技术难点。另外，本发明从分子结构上做了改进，增加了产品本身所携带电荷量，从而不能够穿透细胞膜，达到了高安全标准，因此，本产品亦解决了通常核酸染料所具有的高毒性问题。
【IPC分类】G01N1/30, G01N27/447, C09B57/00
【公开号】CN105001665
【申请号】CN201410149438
【发明人】夏继波
【申请人】苏州嘉恒生物科技有限公司
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2014年4月15日