专利名称：用于核酸检测的新型荧光染料组合物的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域。具体而言，本发明涉及例如扩增反应如聚合酶链反应(PCR)中的核酸检测。本发明可特别用于基因分型、定量PCR、实时PCR和多重PCR。本发明具体涉及PCR中使用的染料。
背景技术：
荧光染料在分析化学、生物化学和分子生物学中有广泛的应用，如在DNA测序和核酸的检测和扩增中。荧光染料吸收特定波长光谱(“激发谱”)的光并在不同的特定波长光谱(“发射谱”)再发射能量。荧光染料通常用作分子标记与DNA和蛋白质探针或其它生物分子连接。多重聚合酶链反应(多重PCR)是一种能够在单个反应管中平行扩增两种或两种以上产物的PCR技术。它广泛应用于基因分型应用和分子生物学的其它方面，例如研究、法医学或诊断应用，包括人的鉴定和亲子鉴定以及传染病的诊断或同种异体骨髓移植后的嵌合状态分析。利用cDNA作为起始模板或结合以mRNA为起始材料的逆转录，多重PCR还可用于定性和半定量的基因表达分析。例如，被分析的核酸可来自各种真核(人、动物或植物) 与原核(细菌)或病毒来源。例如，多重PCR被用来同时检测多个标记基因和/或它们的多态性，例如单核苷酸多态性(SNP)、短串联重复(STR)或缺失-插入多态性(DIP或hdel)。扩增产物及其基因分型的检测通常在DNA测序仪中电泳分离(如毛细管凝胶电泳)后通过多色荧光检测进行。在实时定量多重PCR中，可通过同时检测不同荧光染料来同时监测多个目标序列的扩
+曰O用于多色荧光检测的仪器通常设计并校准为针对非常特定的荧光染料的组合，即按照激发和检测光谱和滤光片组。许多DNA序列分析仪采用毛细管电泳装置结合特殊的多波长荧光检测系统。此类仪器的基本设置见 Karger 等(1991)所述(Karger A, Harris JM, Gesteland RF. “采用毛细管电泳的DNA测序多波长荧光检测(Multiwavelength fluorescence detection for DNA sequencing using capillary electrophoresis)，，· Nucleic Acids Res 18, 4955-4962，1991)，并通过应用生物系统公司(Applied Biosystems)(美国加利福尼亚州福斯特城(Foster City, CA, USA))的 ABI Prism 系列遗传分析仪(310、3100、3130 等) 进入商业应用。这些仪器可用于DNA序列分析、遗传多态性(SNP、DIP、STR)的多重基因分型、mRNA表达分析，或更一般地用于扩增DNA片段的长度分析。后者还是法医学和亲子鉴定领域中多重PCR STR基因分型的当前标准。在该情况中，在多重扩增中使用的各引物对中的至少一个引物在其5' -OH端或内部碱基上标记有共价连接的荧光染料。这些仪器的光学检测单元使用可调至IOmW的多线氩离子激光器，其可以在488nm(主波长)和514nm 激发多个荧光团(Wenz H, Robertson JM, Menchen S, Oaks F, Demorest DM, Scheibler D, Rosenblum BB, Wike C, Gilbert DA, Efcavitch JW. “通过变性毛细管电泳进行高精度基因分型(High-precision genotyping by denaturing capillary electrophoresis)". Genome Res 8，69-80页，1998)。记录525到680nm之间的荧光发射。分离出发射光以便通过摄谱仪(棱镜)进行多色荧光的同时检测并成像在冷却的CCD(电荷耦合器件(charge coupled device))相机上。在现有构造中，可通过约IOnm重量的数字带通滤波器在C⑶芯片上设定最多5个波长带。这些数字带通滤波器的相对位置由生产商针对有限数量的染料组合进行专有设定(见表1)。所述装置的这些设定也称为虚拟滤光片组。数字带通滤波器的确切位置和范围未见公开。新一代的多毛细管DNA测序仪如ABI Prism 3130遗传分析仪另外还具有两个可变虚拟滤光片组，称为“any4dyes”或“any5dyeS”，使客户能针对其它染料组合调整预设的数字带通滤波器。因此，所谓的条件限定数可有一定程度的改变。然而仍然没有关于这些数字带通滤波器的相对位置和波长范围的信息。表1:用于ABI Prism 遗传分析仪的已知荧光染料组合以及虚拟滤光片组。5， 6-FAM:5-和6-羧基荧光素；6-FAM:6-羧基荧光素JOE :6-羧基-4' ,5' -二氯， 7' -二甲氧基荧光素；HEX:4，7，2' ,4' ,5' ,7'-六氯 _6_ 羧基荧光素；TET :4，7，2‘， 7'-四氯-6-羧基荧光素；TAMRA :6-羧基四甲基-罗丹明；VIC :2'-氯-7'-苯基-1， 4-二氯-6-羧基荧光素；NED :2'-氯-5'-氟_7 ‘，8'-苯_1，4-二氯-6-羧基荧光素；ROX :5-和6-羧基-X-罗丹明；PET和LIZ为未公开的应用生物系统公司(美国加利福尼亚州)的专有染料。
荧光染料的组合以及色道推荐的虚拟滤光片组 τ^绿黄 (远红外)6-FAMJOETAMRAROX-F或A6-FAMTETHEXTAMRA-C5,6-FAMJOETAMRAROX-F或A6-FAMJOENEDROX-F6-FAMHEXNEDROX-F或D6-FAMVICNEDPETLIZG5此外，必须针对为了同时检测4或5个不同色而选定的多色滤光片组进行光谱校准，以产生数学矩阵来校正染料重叠的荧光发射谱。这一计算所运用的数学算法尚未公开。还需要着重注意的是，由单个氩离子激光器、摄谱仪、与CCD相机联用的虚拟滤光片组和光谱校准算法组成的用于同时检测不同荧光染料的ABIPrism 遗传分析仪的光学设置与其它测序仪或实时PCR热循环仪所用的设置具有本质不同。后者具有来通过不同的滤光器组合和短时补偿(时间分辨)分析不同染料的多组激发和发射滤光器。此外，ABI Prism 遗传分析仪的具体光学设置也限制了多荧光检测中不同染料的兼容性。如表1所列，只有几组荧光染料可用于DNA寡核苷酸的标记和通过应用生物系统公司的DNA自动测序设备进行的同时检测。由于所使用的单个氩激光器在488nm的激发最强，这些染料在蓝色道到红色道之间的相对灵敏度显著降低。此外，各颜色的相对灵敏度和适当的分析分离受到光谱重叠的影响。这些染料中有很多(如VIC、HEX、NED、PET、LIZ)是应用生物系统公司专有的，这一事实造成了进一步的限制。用VIC、NED和PET染料标记的定制PCR引物只能通过该公司的合成实验室获得，而LIZ只能作为应用生物系统公司的市售产品和带标记DNA长度标准一起得到。此外，PET和LIZ的化学结构是未知的。因此，出于技术和经济方面的原因，需要新的颜色组合物。
发明内容
本发明特别致力于用于DNA序列分析仪的染料组合物，该分析仪使用与特殊的多波长荧光检测系统联用的毛细管电泳装置。如上所述，这些仪器可用于DNA序列分析、遗传多态性(SNP、DIP、STR)的多重基因分型、mRNA表达分析，或更一般地用于扩增DNA片段的长度分析等。本发明涉及用于检测荧光标记核酸的荧光染料的替代组合。出乎意料地，本发明的发明人发现这些组合物与现有技术的组合物相比具有优异的性能，例如在灵敏度方面。 本发明的荧光染料组合物克服了已知组合物的许多局限和缺点。染料的相对灵敏度提高， 光谱重叠减少。如本发明的发明人在所附实施例中所示，本发明的染料组合物的积极效果不能从各单个染料的光谱性质检测得到。具体而言，本发明涉及对样品中至少4种用共价连接染料标记的核酸进行同时检测的方法，包括检测所述荧光染料激发后的荧光发射的步骤，其中一种选自5-FAM或6-FAM 或其混合物的荧光染料与第一核酸共价连接，一种选自DY-530、HEX、CAL Fluor Orange 560或ATTO 532的荧光染料与第二核酸共价连接，一种选自ATTO 550或DY-556的荧光染料与第三核酸共价连接，和一种选自ROX、DY-510XL或ATTO 565的荧光染料与第四核酸共价连接，以及任选地，一种选自DY-632或DY-520XL的荧光染料与第五核酸共价连接。本发明还涉及用于多重PCR的试剂盒和组合物，包含(i)与选自5-FAM或6-FAM或其混合物的荧光染料共价连接的第一核酸；(ii)与选自 DY-530、HEX、CAL Fluor Orange 560 或 ATTO 532 的荧光染料共价连接的第二核酸；(iii)与选自ATTO 550、DY-555或DY-556的荧光染料共价连接的第三核酸；(iv)与选自R0X、DY_510XL或ATTO 565的荧光染料共价连接的第四核酸。本发明的范围还包括至少4种荧光染料的组合物在多重聚合酶链反应中的应用， 其中各染料与和侧接待扩增基因座的序列基本互补的寡核苷酸引物或和待扩增基因座上的序列基本互补的寡核苷酸探针共价连接，其中 (i)第一染料是5-FAM或6-FAM或其混合物，(ii)第二染料选自 DY-530、HEX、CAL Fluor Orange 560 或 ATT0532，(iii)第三染料选自 ATTO 550 或 DY-556，(iv)第四染料选自 R0X、DY-510XL 或 ATTO 565，以及选自 DY-632 或 DY-520XL，(ν)任选地，第五染料选自DY-632或DY-520XL。发明详述本发明涉及用于检测荧光标记核酸的荧光染料的特定组合物。
具体而言，本发明涉及对样品中至少4种用共价连接染料标记的核酸进行同时检测的方法，包括检测所述荧光染料激发后的荧光发射的步骤，其中一种选自5-FAM或6-FAM 或其混合物的荧光染料与第一核酸共价连接，一种选自DY-530、HEX、CAL Fluor Orange 560或ATTO 532的荧光染料与第二核酸共价连接，一种选自ATTO 550、DY-555或DY-556 的荧光染料与第三核酸共价连接，和一种选自ROX、DY-510XL或ATTO 565的荧光染料与第四核酸共价连接，以及任选地，一种选自DY-632或DY-520XL的荧光染料与第五核酸共价连接。本发明的一个方面涉及同时检测扩增反应的扩增产物的方法，包括以下步骤(i)采用和侧接基因座的序列基本互补的引物或引物对扩增核酸模板上的三个或三个以上基因座；和(ii)通过荧光检测荧光标记的扩增产物或通过荧光检测与所述扩增产物的所述基因座上的序列互补的荧光标记寡核苷酸探针来检测所述扩增产物，其中荧光染料与所述扩增产物和/或所述寡核苷酸探针和/或所述引物和/或所述引物对中至少一个引物共价连接，并任选地与大小标记共价连接，且其中使用至少4 种不同染料，其中第一染料是5-FAM或6-FAM或其混合物，第二染料选自DY-530、HEX、CAL Fluor Orange 560 或 ATTO 532，第三染料选自 ATTO 550、DY_555 或 DY-556，第四染料选自 ROX、DY-510XL或ATTO 565，且任选地，第五荧光染料选自DY-632或DY-520XL。本发明还涉及同时检测核酸扩增反应的扩增产物的方法，包括以下步骤(i)用与侧接待扩增序列的引物或引物对扩增三个或三个以上核酸序列；和(ii)直接检测或利用与所述扩增产物互补的荧光标记寡核苷酸探针间接检测荧光标记的扩增产物，(iii)任选地，检测荧光标记的大小标记，其中，各待测序列有不同的荧光染料与所述扩增产物和/或所述寡核苷酸探针和 /或所述引物和/或所述引物对中至少一个引物共价连接，并任选地与大小标记共价连接，且其中使用至少4种不同染料，其中第一染料是5-FAM或6-FAM或其混合物，第二染料选自 DY-530、HEX、CAL Fluor Orange 560 或 ATTO 532，第三染料选自 ATTO 550、 DY-555或DY-556，第四染料选自R0X、DY_510XL或ATTO 565，且任选地，第五荧光染料选自 DY-632 或 DY-520XL。在本发明所述方法的一种具体实施方式
中，第一染料是5-FAM或6-FAM或其混合物，第二染料选自DY-530或ATTO 532，第三染料选自ATTO 550、DY-555或DY-556，第四染料选自DY-510XL或ATTO 565，且任选地，第五荧光染料选自DY-632或DY-520XL。如上所述，本发明涉及至少4种不同荧光染料的组合物。在上述方法的背景下，这意味着在使用本发明的一种染料荧光标记的大小标记时，那么根据所用的4种、5种或更多种不同染料的组合物，可扩增并检测至少3种核酸序列(即基因座)。若不使用荧光标记的大小标记，那么可扩增并检测至少4种序列。在上述方法中，为各待扩增(和检测)序列指定组合物中的一种特定染料，能检测和区分各具体扩增产物。本文中的“同时检测”是指可检测同一溶液中的多种染料，优选在同一时间进行。 因此，可利用例如多个检测器或滤光器。
本发明中的“基因座”是待扩增和/或检测的核酸序列的一部分，所述核酸为例如，染色体、mRNA、质粒、粘粒、DNA或RNA (任何来源的，例如，细菌、病毒、真核、原核、来自植物、真菌或动物，例如人源的)等。本文中的“扩增产物”是扩增反应，例如聚合酶链反应的核酸或寡核苷酸产物。例如，它们由扩增所用的引物所定义。本文中的“引物”是指包含与待扩增或转录的核酸(“模板”)互补的序列的寡核苷酸。在复制过程中，聚合酶使核苷酸与和模板上相应核苷酸互补的引物的3' -OH端连接。本文中的“寡核苷酸”是指一段核酸，例如RNA或DNA，其包含的序列具有两个或两个以上核苷酸，例如2-250个核苷酸，更优选2-200个，更优选2-100个，更优选2_30个，更优选2-25个，更优选2-20个，更优选5-25个，最优选10-25个核苷酸。在本方法的第一方面中，在扩增过程中，检测可采用例如荧光标记的寡核苷酸探针进行。或者，可使用荧光标记的引物。又或者，可使用结合入扩增产物的荧光标记的核苷酸。在该情况中，优选每个待扩增或检测的基因座都在单独的反应管中进行扩增。随后，可将扩增产物统一进行检测。因此，在一些情况中检测可在扩增过程中进行，例如在聚合酶链反应的各循环后或循环中和/或在扩增反应完成后。在本方法的第一方面的一种实施方式中，本方法还另外包括在检测所述扩增产物之前根据大小或分子量分离扩增产物的步骤。根据大小或分子量的分离可例如利用电泳例如凝胶电泳或色谱技术进行。扩增反应优选选自下组聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、基于转录的扩增体系(TAS)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、滚环扩增(RCA)、转录介导的扩增(TMA)、自主序列复制(3SR)、Qi3扩增和(热稳定性)解旋酶依赖性扩增((t)HAD)。更优选扩增反应是PCR。最优选扩增反应是多重PCR，即在单个管中扩增一种以上目标核酸序列。可同时扩增例如 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20 个基因座(目标核酸序列)。如上所述，可例如在同一反应管中同时扩增或例如在不同的反应管中分别扩增核酸序列(即基因座)，。本发明的方法优选同时扩增所述基因座。在同时检测扩增反应扩增产物的方法的一种具体实施方式
中，扩增反应是实时多重聚合酶链反应，所述方法包括以下步骤(i)利用侧接所述待扩增序列的引物对同时扩增至少4种核酸序列；(ii)对各待扩增序列采用至少一种寡核苷酸探针检测所述扩增产物，其中所述寡核苷酸探针与所述扩增产物上的序列基本互补，其中，荧光染料与各寡核苷酸探针共价连接，其中第一染料是5-FAM或6-FAM或其混合物，第二染料选自DY-530、HEX、CAL Fluor Orange 560或ATTO 532，第三染料选自 ATTO 550、DY-555或DY-556，第四染料选自ROX、DY-510XL或ATTO 565，且任选地，第五荧光染料选自DY-632或DY-520XL。在本发明的方法一种优选实施方式中，第三染料是ATTO 550或DY-556。在另一种优选实施方式中，第三染料是ATTO 550或DY-555。在另一种优选实施方式中，第三染料是ATTO 550。在本方法的一种优选实施方式中，第二染料是DY-530，第三染料是ATTO 550，第四染料选自ROX或DY-510XL。更优选地，第四染料是DY-510XL。当使用选自DY-632或DY-520XL的第五染料时，第三染料优选ATT0550，第四染料优选选自 DY-5IOXL 或 ATTO 565。在本发明的一些具体实施方式
中，至少一种染料与寡核苷酸大小标记共价连接。 换言之，在一种优选实施方式中，至少一种核酸是寡核苷酸大小标记。优选地，所述第四核酸为寡核苷酸大小标记。寡核苷酸大小标记是一种大小限定的寡核苷酸或大小限定的寡核苷酸的混合物。在混合物的情况中，所有相同大小的寡核苷酸可与相同的荧光染料连接，或所有寡核苷酸可与相同的荧光染料连接。本发明还涉及包含以下组分的组合物(i)与选自5-FAM或6-FAM或其混合物的荧光染料共价连接的第一核酸；(ii)与选自 DY-530、HEX、CAL Fluor Orange 560 或 ATTO 532 的荧光染料共价连
接的第二核酸；(iii)与选自ATTO 550、DY-555或DY-556的荧光染料共价连接的第三核酸；和(iv)与选自ROX、DY-510XL或ATTO 565的荧光染料共价连接的第四核酸。在一种具体实施方式
中，所述组合物还包含(ν)与选自DY-632或DY-520XL的荧光染料共价连接的第五核酸。优选地，第三染料是ATTO 550，第四染料选自DY-510XL或ATTO 565。在所述组合物的一种实施方式中，组合物中各核酸是相同等位基因梯的成员。换言之，本发明在一个方面涉及包含上述标记核酸的组合物的等位基因梯。本发明的组合物可用作大小标记。在该情况中，各不同核酸具有限定的已知长度。 因此，在所述组合物的一种优选实施方式中，至少一种核酸是寡核苷酸大小标记。优选地， 所述第四核酸为寡核苷酸大小标记。在本发明组合物的一种具体实施方式
中，第一染料是5-FAM或6-FAM或其混合物，第二染料选自 DY-530、CAL Fluor Orange 560 或 ATTO 532，第三染料选自 ATTO 550、 DY-555或DY-556，第四染料选自DY-510XL或ATTO 565，且任选地，第五荧光染料选自 DY-632或DY-520XL。在本发明组合物的另一个具体实施方式
中，第一染料是5-FAM或 6-FAM或其混合物，第二染料选自DY-530或ATTO 532，第三染料选自ATTO 550、DY-555 或DY-556，第四染料选自DY-510XL或ATTO 565，且任选地，第五荧光染料选自DY-632或 DY-520XL。本发明还涉及用于多重PCR的试剂盒，其包含适于共价连接到用于多重PCR的核苷酸、引物、大小标记或寡核苷酸探针的至少4种不同的荧光染料，其中第一染料是5-FAM 或 6-FAM 或其混合物，第二染料选自 DY-530、HEX、CAL Fluor Orange 560 或 ATTO 532，第三染料选自ATTO 550、DY-555或DY-556，第四染料选自R0X、DY-510XL或ATTO 565，且任选地，第五荧光染料选自DY-632或DY-520XL。本发明在另一方面涉及用于多重PCR的试剂盒，其包含(i)与选自5-FAM或6-FAM或其混合物的荧光染料共价连接的至少一种第一核酸；
(ii)与选自 DY-530、HEX、CAL Fluor Orange 560 或 ATTO 532 的荧光染料共价连
接的至少一种第二核酸；(iii)与选自ATTO 550、DY-555或DY-556的荧光染料共价连接的至少一种第三核酸；和(iv)与选自ROX、DY-510XL或ATTO 565的荧光染料共价连接的至少一种第四核酸。在本发明试剂盒的具体实施方式
中，所述第一、第二、第三和/或第四核酸可以是探针。这些核酸中的一种或多种还可以是大小标记。具体而言，本发明的试剂盒是用于多重PCR的试剂盒，其包含(i)至少三种不同的引物对，其中荧光染料与各引物对的至少一种引物共价连接； 和(ii)任选地包含寡核苷酸大小标记，其中荧光染料与所述大小标记共价连接；其中使用至少4种不同染料，其中第一染料是5-FAM或6-FAM或其混合物，第二染料选自 DY-530、HEX、CAL Fluor Orange 560 或 ATTO 532，第三染料选自 ATTO 550、DY_555 或DY-556，第四染料选自R0X、DY-510XL或ATTO 565，且任选地，第五荧光染料选自DY-632 或DY-520XL。在一种优选实施方式中，所述试剂盒包含至少5种不同的荧光染料，其中第三染料是ATTO 550，第四染料选自由DY-510XL或ATTO 565。在本发明试剂盒的一种具体实施方式
中，第一染料是5-FAM或6-FAM或其混合物，第二染料选自 DY-530、CAL Fluor Orange 560 或 ATTO 532，第三染料选自 ATTO 550、 DY-555或DY-556，第四染料选自DY-510XL或ATTO 565，且任选地，第五荧光染料选自 DY-632或DY-520XL。在本发明试剂盒的又一种具体实施方式
中，第一染料是5-FAM或 6-FAM或其混合物，第二染料选自DY-530或ATTO 532，第三染料选自ATTO 550、DY-555 或DY-556，第四染料选自DY-510XL或ATTO 565，且任选地，第五荧光染料选自DY-632或 DY-520XL。本发明的范围还包括至少4种荧光染料的组合物在多重聚合酶链反应中的应用， 其中各染料与和侧接待扩增基因座的序列基本互补的寡核苷酸引物或和待扩增基因座上的序列基本互补的寡核苷酸探针共价连接，其中(i)第一染料是5-FAM或6-FAM或其混合物，(ii)第二染料选自 DY-530、HEX、CAL Fluor Orange 560 或 ATT0532，(iii)第三染料选自 ATTO 550、DY_555 或 DY-556，(iv)第四染料选自 R0X、DY-510XL 或 ATTO 565，以及选自 DY-632 或 DY-520XL，(ν)任选地，第五染料选自DY-632或DY-520XL。在本发明所述应用的一种实施方式中，第三染料是ATTO 550或DY-556。在所述应用的一种实施方式中，第三染料是ATTO 550。 在本发明所述应用的另一种实施方式中，第三染料是ATTO 550，第四染料选自由 DY-510XL 或 ATTO 565。 在本发明所述应用的另一种实施方式中，第二染料是DY-530，第三染料是ATTO 550，第四染料选自ROX或DY-510XL。
当使用选自DY-632或DY-520XL的第五染料时，优选第二染料是DY-530，第三染料是ATTO 550，第四染料是DY-510XL。在至少4种荧光染料的组合物的应用的一种具体实施方式
中，第一染料是5-FAM 或6-FAM或其混合物，第二染料选自DY-530、CAL Fluor Orange 560或ATTO 532，第三染料选自ATTO 550、DY-555或DY-556，第四染料选自DY-510XL或ATTO 565，且任选地，第五荧光染料选自DY-632或DY-520XL。在至少4种荧光染料的组合物的应用的另一种具体实施方式
中，第一染料是5-FAM或6-FAM或其混合物，第二染料选自DY-530或ATT0532，第三染料选自ATTO 550、DY-555或DY-556，第四染料选自DY-510XL或ATTO 565，且任选地，第五荧光染料选自DY-632或DY-520XL。在本发明所述应用的一些实施方式中，一种染料与寡核苷酸大小标记共价连接。本发明的方法、试剂盒和组合物还可用于法医学和亲子鉴定。美国专利第6,316,610号和EP 1 155 027 Bl公开了 5_FAM(5_羧基荧光素)和6-FAM(6-羧基荧光素)、HEX(6-羧基-2' ,4,4'，5' ,7,7'-六氯荧光素)、 VIC(2 ‘-氯-7'苯-1，4-二氯-6-羧基荧光素)、NED(2‘-氯 _5 ‘-氟 _7 ‘ ,8'-苯并-1，4-二氯-6-羧基荧光素)和ROX (5-羧基-X-罗丹明)的结构(参见US 6，316，610B2 和 EP 1 155 027 Bl 的图 3_5)。DY-530、DY-556、DY-510XL、DY-632 和 DY-520XL 的结构分别见附图IA-E所示。ATTO 565的结构见附图2所示。CAL Fluor 560 OrangeXAL Fluor Red 590,CAL Fluor Red 610和CALFluor Red 6；35的亚磷酰胺结构分别见附图3A-D所示。 DY-555 的结构见图 5 所示。DY-530、DY-556、DY-510XL、DY-632 和 DY-520XL 是德国耶拿的戴欧米克斯公司(Dyomics GmbH, Jena, Germany)的产品。ATTO 532、ATT0550 和 ATTO 565 是德国锡根的 ATTO-TEC 公司(ATTO-TEC GMBH, Siegen,Germany)的产品。VIC、NED、PET 和 LIZ是美国加利福尼亚州福斯特城的应用生物系统公司的产品。CAL Fluor 560 Orange, CAL Fluor Red 590、CALFluor Red 610 和 CAL Fluor Red 635 是美国加利福尼亚州诺瓦托的生物探索技术公司(Biosearch Technologies Inc. , Novato, CA, USA)的产品。本发明中染料与核苷酸、引物、探针和/或标记的连接可通过技术人员已知的标准偶联反应，例如通过N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯或亚磷酰胺偶联实现。本发明所述荧光染料的具体组合物可用于应用生物系统公司((美国加利福尼亚州福斯特城)的ABI Prism 系列遗传分析仪(310、3100、3130等)的自动DNA测序装置。 还可用于使用相同的光学配置进行多波长检测的其它电泳设备。此外，可使用常规的实时 PCR设备，例如应用生物系统公司(的ABI Prism 序列检测系统(SDS)系列、司查塔基公司(Stratagene)(美国加利福尼亚州拉霍亚(La Jolla, CA, USA))的Mx系列或艾本德公司 (Eppendorf)(德国汉堡)的 Mastercycler ep realplex。荧光染料6-FAM、VIC、NED、PET或ROX与LIZ是应用生物系统公司一度最推荐的分别用于多波长检测试验中蓝、绿、黄、红和橙色道的染料。本发明所述荧光染料的具体组合物已与本领域已知组合物进行了比较，如所附实施例3所示具有如下技术优势。本发明染料组合物的优势特别是其相对灵敏度方面见实施例3的表4所示。与本领域已知的染料组合物相比，获得了更好的灵敏度，具体而言，ATTO 532、DY-530和CAL Fluor Orange 560与使用VIC的组合物相比灵敏度更好。比较而言，ATTO 550所得结果比NED好，DY-510XL比 PET好。因此，发现新的染料组合物显著改善了绿、黄和红色标记的PCR扩增子的灵敏度。这为设计灵敏的多重PCR提供了更多的灵活度，特别是在法医学领域(例如污点检测)和临床应用(例如癌症和产前诊断)中。新的绿、黄和红色染料还可与已知的兼容染料联用， 例如，组合物 6-FAM、VIC、ATT0 550 和 ROX 或 6-FAM、VIC、ATTO 550、PET 和 DY-632 (数据未显示)。可采用其它组合物。此外，鉴定出染料DY-632和DY-520XL可替代LIZ用于新的内部长度标准的合成。 实施例2和4显示就DY-632而言此类标准在60-380bp范围内(增幅20bp)的可行性。如实施例1和3所示，无法通过观察荧光染料的光谱数据(例如，最大吸收和发射、消光系数)来确定它们对多重核酸检测的染料组合物的适用性。荧光染料的具体组合物的选择不能仅从各染料的光谱性质推断得到。如上所述，ABI Prism 遗传分析仪具有独特的设置。所述设备的光学规格尚未完全公开(例如，虚拟滤光片组中数字带通滤波器的确切位置、校正染料重叠荧光发射光谱的算法)。在DNA序列自动装置的检测单元中在电泳条件下进行记录之前，荧光染料的光谱数据都不存在，特别是来自应用生物系统公司的染料。因此，无法根据标准化公开染料光学性质(最大激发和发射、量子产率等)或其它设备(例如实时热循环仪)的推荐选择和ABI Prism 遗传分析仪兼容的染料组合物，而是必须在适当的运行(缓冲液、pH)和检测条件 (虚拟滤光片组、光谱校准)进行评估(见实施例1)。此外，必须确保共价标记的PCR扩增子在毛细管电泳中产生具有精确大小分辨率的单个片段峰。对于只能以非对映异构体混合物形式得到的荧光染料来说，有时并非如此。对于这一事实，按厂商所述为三种非对映异构体的混合物的染料ATTO 550令人感兴趣并出乎意料地在50-400碱基范围内产生明显的单个扩增子的峰。最后，所有染料在所有应用条件(例如，寡核苷酸合成、寡核苷酸纯化、PCR 和毛细管电泳)下必须具有化学和物理稳定性。必须凭经验评估各种无法测知性因素。为此，详细描述了新的基于PCR的染料组合物的评估试验(实施例3)。附图简述
图1 来自戴欧米克斯公司(德国耶拿)的荧光染料的结构。(A)DY_530游离羧酸， (B)DY-556NHS 酯、一钠盐，(C)DY-632 游离酸、二钠盐，(D)DY-510XL 游离羧酸，(E)DY_520XL 羧酸。在(A)、(C)、⑶和(E)的情况中，游离羧基用于寡核苷酸5'端的NHS偶联。图2 来自ATTO-TEC公司(德国锡根)的荧光染料的结构。(A)ATTO 565 (高氯酸盐)NHS酯，(B)ATTO 550，一种非对映异构体的游离酸。游离羧基用于寡核苷酸5'端的 NHS偶联。图3 来自生物探索技术公司(美国加利福尼亚州诺瓦托)的荧光染料的结构。 (A)CAL Fluor Orange 560， (B)CAL Fluor Red 590， (C)CAL Fluor Red 610， (D)CAL Fluor Red 6；35。ift·异丙基，CE β-氰基乙基。图4:通过多重PCR扩增和具有重叠片段范围的4种短串联重复(STR)的基因分型进行人DNA序型分析。所示电泳图显示碱基对[bp]表示的片段大小上6-FAM、DY-530、 ATTO 550、DY-510-XL和DY-632染料的相对荧光单位(RFU)。如实施例4所述，从500pg基因组DNA开始进行多重PCR和基因分型。利用内部DY-632标记的大小标准品计算片段大小(底部的电泳图)。在各电泳图的底部空白处标注了 STR基因座的名称及其片段范围。图5 荧光染料DY-555(戴欧米克斯公司(德国耶拿))的结构。DY-555的NHS酯， 氯化盐的结构。实施例实施例1 记录溶于电泳缓冲液中的荧光染料标记的寡核苷酸的光谱数据荧光染料的光谱特性受到溶剂系统、缓冲液组成和PH值的显著影响。通常，未偶联荧光染料的公开光谱数据由染料生产商在水或有机溶剂如甲醇、乙醇、二甲基甲酰胺或二甲基亚砜中记录。很少得到在限定的PCR缓冲液中测得的数据，且此前没有用DNA序列自动装置的检测单元在电泳条件下记录的数据，特别是本发明关注的那些来自应用生物系统公司(美国加利福尼亚州福斯特城)的染料。此外，已知荧光染料的光谱特性在与寡核苷酸偶联后会改变。在服务性实验室(例如，比利时瑟兰的友基公司(Eurogentec SA, Seraing, Belgium)；美国加利福尼亚州福斯特城的应用生物系统公司)，通过标准的亚磷酰胺化学法合成寡核苷酸引物。荧光染料通过N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯偶联(Giusti WG,Adriano T. “5'-荧光染料标记的寡核苷酸的合成和表征(Synthesis and characterization of 5 ' -fluorescent-dye-labeled oligonucleotides)，，· PCR Methods Appl 2:223-227, 1993)或标准的亚磷酰胺化学法(Theisen P,McColIum C，Andrus Α. “寡核苷酸的荧光染料亚憐酉先胺标记(Fluorescent dye phosphoramidite labelling of oligonucleotides)，，· Nucleic Acids Symp Ser 27，pp. 99-100，1992)与寡核苷酸的5'端共价连接。所有引物在服务性实验室通过离子对反相高效液相色谱或聚丙烯酰胺凝胶电泳按照标准方法纯化， 溶于TE-缓冲液(IOmM Tris/HCl，室温调至pH 8. O, ImM EDTA)至100 μ M浓度，4°C避光保存直至进一步使用。分别将寡核苷酸稀释20倍和2000倍以便进行紫外/可见光(UV/Vis)光谱和荧光测定，测定在ABI Prism 遗传分析仪的毛细管电泳凝胶缓冲液中进行，其由IOOmM N-[三-(羟甲基)-甲基-3-氨基]-丙磺酸(TAPS) /NaOH (pH 8. 0，室温下调节)，8M尿素和 5% 2-吡咯烧酮组成(Rosenblum BB, Oaks F,Menchen S，Johnson B. “改善的毛细管电泳中HilDNA白勺ffiff石角(Improved single-strand DNA sizing accuracy in capillary electrophoresis.) "Nucleic Acids Res，25，pp. 3925-3929，1997)。用 SPEC0RD S 100 Bio UV/VIS-分光光度计(德国耶拿的耶拿艾纳立提克公司(Analytik Jena AG, Jena, Germany))记录200nm到700nm之间的吸收光谱。用SPEX Fluorolog _3荧光分光光度计(美国纽约州爱迪生的荷瑞巴JY公司(H0RIBA Jobin Yvon Inc, Edison, NY, USA))分析荧光光谱。使用与ABI Prism 遗传分析仪氩激光器的主发射波长对应的488nm的激发波长，并记录520nm到700nm之间的发射光谱。表2 不同荧光染料在其最大发射时的最大发射和相对信号高度。染料标记的寡核苷酸(引物WB 94，DNA序列5'-[染料]-AGATTGTACTGAGAGTG-3')以相同浓度溶于 ABI Prism 遗传分析仪的毛细管电泳凝胶缓冲液中。使用488nm的激发波长。将测得的最大激发和发射与文献数据比较。记录最大发射的信号高度(RFU，相对荧光单位)。将6-FAM 的信号高度设为100%以便计算相对信号高度。
权利要求
1.一种同时检测样品中用共价连接染料标记的至少4种核酸的方法，所述方法包括检测所述荧光染料在激发后的荧光发射的步骤，其中(i)选自5-FAM或6-FAM或其混合物的荧光染料与第一核酸共价连接；(ii)选自DY-530、HEX、CAL Fluor Orange 560 或 ATTO 532 的荧光染料与第二核酸共价连接；(iii)选自ATTO550、DY-555或DY-556的荧光染料与第三核酸共价连接；和(iv)选自R0X、DY-510XL或ATTO565的荧光染料与第四核酸共价连接；和(ν)任选地，选自DY-632或DY-520XL的荧光染料与第五核酸共价连接。
2.如权利要求1所述的同时检测核酸扩增反应的扩增产物的方法，其特征在于，其包括以下步骤(a)用侧接待扩增序列的引物或引物对扩增3种或3种以上核酸序列；和(b)对荧光标记的扩增产物进行直接检测或者利用与所述扩增产物互补的荧光标记寡核苷酸探针间接检测，(c)任选地，检测荧光标记的大小标记，其中，各待测序列有不同的荧光染料与所述扩增产物和/或所述寡核苷酸探针和/或所述引物和/或所述引物对中至少一个引物共价连接，并任选地与大小标记共价连接，且其中使用至少4种不同染料，其中第一染料是5-FAM或6-FAM或其混合物，第二染料选自 DY-530、HEX、CAL Fluor Orange 560 或 ATTO 532，第三染料选自 ATTO 550、DY_555 或 DY-556，第四染料选自R0X、DY-510XL或ATTO 565，且任选地，第五荧光染料选自DY-632或 DY-520XL。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述扩增反应选自下组聚合酶链反应 (PCR)、连接酶链反应(LCR)、基于转录的扩增体系(TAS)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、滚环扩增(RCA)、转录介导的扩增(TMA)、自主序列复制(3SR)、Qi3扩增和(热稳定性)解旋酶依赖性扩增((t)HAD)。
4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述核酸序列是同时扩增的。
5.如权利要求2-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述扩增反应是多重PCR。
6.如权利要求2-5中任一项所述的方法，其特征在于，其还包括在检测所述扩增产物之前根据大小或分子量分离所述扩增产物的步骤。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述扩增反应是实时多重聚合酶链反应，且所述方法包括以下步骤(i)利用侧接所述待扩增序列的引物对同时扩增至少4种核酸序列；( )对各待扩增序列采用至少一种寡核苷酸探针检测所述扩增产物，其中所述寡核苷酸探针与所述扩增产物上的序列基本互补，其中，荧光染料与各寡核苷酸探针共价连接且采用至少4种不同染料，其中第一染料是 5-FAM 或 6-FAM 或其混合物，第二染料选自 DY-530、HEX、CAL Fluor Orange 560 或 ATTO 532，第三染料选自 ATTO 550、DY-555 或 DY-556，第四染料选自 R0X、DY-510XL 或 ATTO 565， 且任选地，第五荧光染料选自DY-632或DY-520XL。
8.如权利要求2-6中任一项所述的方法，其特征在于，至少一种核酸是寡核苷酸大小标记。
9.一种组合物，其包含(i)与选自5-FAM或6-FAM或其混合物的荧光染料共价连接的第一核酸；(ii)与选自DY-530、HEX、CALFluor Orange 560或ATTO 532的荧光染料共价连接的第二核酸；(iii)与选自ATTO550、DY-555或DY-556的荧光染料共价连接的第三核酸；和(iv)与选自R0X、DY-510XL或ATTO565的荧光染料共价连接的第四核酸。
10.如权利要求9所述的组合物，其特征在于，其还包含(ν)与选自DY-632或DY-520XL的荧光染料共价连接的第五核酸。
11.如权利要求10或11所述的组合物，其特征在于，至少一种核酸是寡核苷酸大小标记。
12.如权利要求10或11所述的组合物，其特征在于，各核酸是相同的等位基因梯的成员O
13.一种用于多重PCR的试剂盒，其包含(i)与选自5-FAM或6-FAM或其混合物的荧光染料共价连接的至少一种第一核酸；(ii)与选自DY-530、HEX、CALFluor Orange 560或ATTO 532的荧光染料共价连接的至少一种第二核酸；(iii)与选自ATTO550、DY-555或DY-556的荧光染料共价连接的至少一种第三核酸；和(iv)与选自R0X、DY-510XL或ATTO565的荧光染料共价连接的至少一种第四核酸。
14.如权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述第一、第二、第三和/或第四核酸是探针或引物。
15.如权利要求13所述用于多重PCR的试剂盒，其特征在于，其包含(i)至少3种不同的引物对，其中荧光染料与各引物对的至少一种引物共价连接；和(ii)任选地包含寡核苷酸大小标记，其中荧光染料与所述大小标记共价连接； 其中使用至少4种不同荧光染料，其中第一染料是5-FAM或6-FAM或其混合物，第二染料选自 DY-530、HEX、CAL Fluor 0range560 或 ATTO 532，第三染料选自 ATTO 550、DY-555 或DY-556，第四染料选自R0X、DY-510XL或ATTO 565，且任选地，第五荧光染料选自DY-632 或DY-520XL。
16.如权利要求13-15中任一项所述的试剂盒，其特征在于，其包含至少5种不同的荧光染料，其中第三染料是ATTO 550，第四染料选自DY-510XL或ATTO 565。
17.至少4种荧光染料的组合物在多重聚合酶链反应中的应用，其中各染料与和侧接待扩增基因座的序列基本互补的寡核苷酸引物或和待扩增基因座上的序列基本互补的寡核苷酸探针共价连接，其中(i)第一染料是5-FAM或6-FAM或其混合物，(ii)第二染料选自DY-530、HEX、CAL Fluor Orange 560 或 ATTO 532，(iii)第三染料选自ATTO 550 或 DY-555、DY-556，(iv)第四染料选自R0X、DY-510XL 或 ATTO 565，以及选自 DY-632 或 DY-520XL， (ν)任选地，第五染料选自DY-632或DY-520XL。
全文摘要
本发明涉及用于分子生物学，特别是多重PCR中的荧光染料组合物。具体而言，本发明涉及用于扩增反应的染料组合物，其中使用至少4种不同染料，其中第一染料是5-FAM或6-FAM或其混合物，第二染料选自DY-530、HEX、CAL Fluor Orange 560或ATTO 532，第三染料选自ATTO550、DY-555或DY-556，第四染料选自ROX、DY-510XL或ATTO 565，并任选地，第五荧光染料选自DY-632或DY-520XL。
文档编号C12Q1/68GK102232118SQ200980149121
公开日2011年11月2日 申请日期2009年12月1日 优先权日2008年12月1日
发明者C·韦伯, W·布拉贝兹 申请人:凯杰德累斯顿有限公司