专利名称：Dna前处理缓冲液及菌体dna、核酸dna的制备方法
技术领域：
本发明涉及环境微生物样本直接用于PCR反应的DNA前处理缓冲液及菌体DNA、核酸DNA的制备方法。
背景技术：
目前，用于环境样本中污水、污泥等DNA的制备的方法多数为人工配置药品，采用溶菌酶、反复冻融结合CTAB或十二烷基磺酸钠SDS法提取样本中微生物的DNA，或用试剂盒制备，费用较高而且DNA提取效果不好，多为弥散的条带，或者得率低；对于含有特殊的化学物质如油田污水更加不容易提取，需要的时间较长，最后的效果不一定好。重要的是当环境样本用于微生物分子生态学和特定菌种的定量检测研究时，DNA的损失率较大，对于数量少的微生物根本无法提取，这样的DNA用于微生物分子生态学的研究就不能够全面地反映种群的结构和种群演替情况，用于环境样本中微生物的定量检测则更加不准确。
发明内容
针对环境微生物样本中DNA提取的难度较大、得率小，甚至无法提取，样品损失较大、费用较高，不能全面真实地反映环境样本中微生物的种类和数量的问题，本发明提供一种环境微生物样本(污水、生物反应器污泥等)直接用于PCR反应的DNA前处理缓冲液及菌体DNA、核酸DNA的制备方法，它具有成本低廉、快速，能够获得高质量的DNA，获得的DNA能够真实的反映环境样本中微生物的数量和种类的优点。本发明的上述目的是通过下述技术方案实现的环境微生物样本直接用于PCR反应的DNA前处理缓冲液由贮存液和十二烷基磺酸钠制成，其中贮存液由下述成分组成70gNaCl、2g KCl、12gNa2HPO4和2g KH2PO4。
环境微生物样本直接用于PCR反应的菌体DNA的制备方法是通过以下步骤实现的a、首先紫外线条件下对工作平台灭菌20～40min，然后取环境微生物样本0.1ml注入到经灭菌的离心管中；b、样本在震荡器上充分震荡5min，13000r/min离心1min后弃上清液0.9ml；c、在剩余的0.1ml样本中加入上述DNA前处理缓冲液0.9ml，在震荡器上充分震荡5min，13000r/min离心2min，弃上清液0.98ml，继续充分震荡2min，得到菌体DNA。所述环境微生物样本为OD值≤0.1的污水(例如油田水系统中污水或生活污水)。
环境微生物样本直接用于PCR反应的核酸DNA的制备方法是通过以下步骤实现的a、紫外线条件下对工作平台灭菌20～40min，然后取环境微生物样本0.1ml注入到经灭菌的离心管中；b、样本在震荡器上充分震荡5min，13000r/min离心1min后弃上清液0.9ml；c、在剩余的0.1ml样本中加入上述DNA前处理缓冲液0.9ml，在震荡器上充分震荡5min，13000r/min离心2min，弃上清液0.98ml，继续充分震荡2min，得到菌体DNA；d、在PCR管内加入10μl菌体DNA、4μlPCR缓冲液和6μl去离子水，在94℃反应5min、4℃反应1min的条件下循环5次，获得核酸DNA。所述环境微生物样本为OD值≤0.1的污水(例如油田水系统中污水或生活污水)。
环境微生物样本直接用于PCR反应的菌体DNA的制备方法是通过以下步骤实现的a、紫外线条件下对工作平台灭菌20～40min，然后取环境微生物样本0.1ml注入到经灭菌的离心管中，同时加入0.9ml上述DNA前处理缓冲液，在震荡器上充分震荡5min；b、3600r/min离心1min，从管中搜集上清液移入另一个离心管中；c、加入与上清液等体积的DNA前处理缓冲液，再次在震荡器上充分震荡5min；d、重复b、c步骤；e、然后在13000r/min的条件下离心2min，弃上清液，管内加入DNA前处理缓冲液20μl，在震荡器上充分震荡5min，制备完毕得到菌体DNA。所述环境微生物样本为生物反应器内的污泥或污水。
环境微生物样本直接用于PCR反应的核酸DNA的制备方法是通过以下步骤实现的a、紫外线条件下对工作平台灭菌20～40min，然后取环境微生物样本0.1ml注入到经灭菌的离心管中，同时加入0.9ml上述DNA前处理缓冲液，在震荡器上充分震荡5min；b、3600r/min离心1min，从管中搜集上清液移入另一个离心管中；c、加入与上清液等体积的DNA前处理缓冲液，再次在震荡器上充分震荡5min；d、重复b、c步骤；e、然后在13000r/min的条件下离心2min，弃上清液，管内加入DNA前处理缓冲液20μl，在震荡器上充分震荡5min，制备完毕得到菌体DNA；e、在PCR管内加入10μl菌体DNA、4μlPCR缓冲液和6μl去离子水，在94℃反应5min、4℃反应1min的条件下循环5次，获得核酸DNA。所述环境微生物样本为生物反应器内的污泥或污水。
“菌体DNA”是将环境样本中的除微生物菌体以外的杂质去除，获得在缓冲液中只含有微生物菌体的直接用于PCR扩增的以菌体直接作为模板的DNA。本发明的快速制备直接用于PCR扩增的菌体DNA的方法，是将环境样本中的除微生物菌体以外的杂质去除，获得在缓冲液中只含有微生物菌体的菌体DNA，它的意义在于对于建立环境样本的文库和定量检测具有重要的意义，适用的分子生物学操作主要包扩常规的PCR、样本中特意的基因的扩增，以及基于菌体DNA的目的微生物的快速检测的研究。在菌体DNA的基础上，一步法快速获得核酸DNA，核酸DNA是我们通常意义的菌体裂解后的含有碱基的核酸；它的意义和操作范围是在分子生物学中必须以核酸为直接操作对象的分子生物学试验，如分子杂交等。
本发明涉及的环境微生物的样本主要包括，如油田水系统中污水、生物反应器内的污泥、生活污水、土壤样本等，能溶于水或部分溶于水的含有微生物的样本。对于油田污水采用震荡的方法制备菌体DNA和核酸DNA。对于生物反应器内的污水和污泥采用震荡加“梯度离心”的方法，除去大量的固体颗粒和杂质，能有效的使微生物从中分离开来，对于土壤样本、能溶于水或部分溶于水的含有微生物的样本来说，该方法同样适用。本发明的方法其结果表明，快速制备直接用于PCR扩增的菌体DNA的方法，可以直接用于PCR反应，能够有效的扩增出目的片段，该法对于含有大量的化学物质的油田污水效果较好。对于污水处理只需要20min，对于污泥处理需要30min；在此基础上的一步法快速获得核酸DNA的方法，可以获得较高浓度的DNA。油田污水全部过程只需要45min即可，对于污泥需要55min，本发明的方法成本极其低廉，快速，菌体DNA和核酸DNA的得率为98％以上，获得的DNA能够真实的反映环境样本中微生物的种类和数量，可以用于各种分子生物学试验。
具体实施例方式
具体实施方式
一本实施方式的DNA前处理缓冲液的组成成分和药品浓度为10×的贮存液(70g NaCl；2g KCl；12g Na2HPO4；2g KH2PO4)和SDS，所述SDS的加入量为贮存液质量的1‰，工作液为稀释10倍的DNA前处理缓冲液，pH为7.5。
具体实施例方式
二本实施方式的快速制备直接用于PCR扩增的菌体DNA的方法是通过以下步骤实现的(以石油污水为例，OD值(吸光度)≤0.1)a、以下步骤在超净工作台下完成工作台先紫外线灭菌20～40min，然后取样将用含有高纯氮气的厌氧管取回的油田污水的水样，取1mL注入到经灭菌的1.5mL的离心管中；b、在震荡器上充分震荡5min，13000r/min离心1min，从管中轻轻的弃上清液0.9mL；c、在剩余的0.1mL水样中加入DNA前处理缓冲液0.9mL，在震荡器上充分震荡5min；d、13000r/min离心2min，弃上清液0.98mL，充分震荡2min，制备完毕得到菌体DNA。短时间内使用4℃保存即可，长时间不用要-20℃保存。本实施方式所述DNA前处理缓冲液的组成成分和药品浓度为10×的贮存液(70g NaCl；2g KCl；12g Na2HPO4；2g KH2PO4)和SDS，所述SDS的加入量为贮存液质量的1‰，工作液为稀释10倍的DNA前处理缓冲液，pH为7.5。
具体实施例方式
三对于生物反应器内的污泥处理主要采用梯度离心的方法，具体步骤为a、以下步骤在超净工作台下完成，紫外线灭菌工作台20～40min，取样将用灭菌管取回的反应器污泥的水样，取0.1mL注入到经灭菌的1.5mL的离心管中，同时加入0.9mL DNA前处理缓冲液，在震荡器上充分震荡5min；b、3600r/min离心1min，从管中搜集上清液移入另一个1.5mL的离心管中；c、加入与上清液等体积的DNA前处理缓冲液，再次在震荡器上充分震荡5min；d、重复b、c步骤；e、13000r/min离心2min，弃上清液，管内加入DNA前处理缓冲液20μL，在震荡器上充分震荡5min，制备完毕得到菌体DNA。短时间内使用4℃保存即可，长时间不用要-20℃保存。本实施方式所述DNA前处理缓冲液的组成成分和药品浓度为10×的贮存液(70gNaCl；2g KCl；12g Na2HPO4；2g KH2HPO4)和SDS，所述SDS的加入量为贮存液质量的1‰，工作液为稀释10倍的DNA前处理缓冲液，pH为7.5。
具体实施例方式
四本实施方式与具体实施方式
二、三不同的是，一步法快速获得核酸DNA可以用于各种分子生物学实验，实验的步骤在菌体DNA的方法的基础上，增加两步1、PCR管内为20μL体系，管内加入10μL的菌体DNA，4μL的PCR缓冲液Buffer(10×)，6μL的去离子水；2、PCR反应的体系94℃5min，4℃1min，然后94℃1min，4℃1min，循环5次，即可获得核酸DNA，想获得高纯度的DNA，也可以将PCR产物放入带过滤膜的离心管中，1200r/min离心2min即可。
本实施方式中，对于水质比较清澈的污水来说，菌体DNA可以不经过具体实施方式
二、三中的处理，直接进行核酸DNA的制备，它同样属于本发明的保护范围。
权利要求
1.DNA前处理缓冲液，其特征在于所述DNA前处理缓冲液由贮存液和十二烷基磺酸钠制成，其中贮存液由下述成分组成70g NaCl、2g KCl、12gNa2HPO4和2g KH2PO4。
2.根据权利要求1所述的DNA前处理缓冲液，其特征在于所述十二烷基磺酸钠的加入量为贮存液质量的1‰。
3.菌体DNA的制备方法，其特征在于所述菌体DNA的制备方法是通过以下步骤实现的a、紫外线条件下对工作平台灭菌20～40min，然后取环境微生物样本0.1ml注入到经灭菌的离心管中；b、样本在震荡器上充分震荡5min，13000r/min离心1min后弃上清液0.9ml；c、在剩余的0.1ml样本中加入权利要求1所述DNA前处理缓冲液0.9ml，在震荡器上充分震荡5min，13000r/min离心2min，弃上清液0.98ml，继续充分震荡2min，得到菌体DNA。
4.根据权利要求3所述菌体DNA的制备方法，其特征在于所述环境微生物样本为OD值≤0.1的污水。
5.菌体DNA的制备方法，其特征在于所述菌体DNA的制备方法是通过以下步骤实现的a、紫外线条件下对工作平台灭菌20～40min，然后取环境微生物样本0.1ml注入到经灭菌的离心管中，同时加入0.9ml权利要求1所述DNA前处理缓冲液，在震荡器上充分震荡5min；b、3600r/min离心1min，从管中搜集上清液移入另一个离心管中；c、加入与上清液等体积的DNA前处理缓冲液，再次在震荡器上充分震荡5min；d、重复b、c步骤；e、然后在13000r/min的条件下离心2min，弃上清液，管内加入DNA前处理缓冲液20μl，在震荡器上充分震荡5min，制备完毕得到菌体DNA。
6.根据权利要求5所述菌体DNA的制备方法，其特征在于所述环境微生物样本为生物反应器内的污泥或污水。
7.核酸DNA的制备方法，其特征在于所述核酸DNA的制备方法是通过以下步骤实现的a、紫外线条件下对工作平台灭菌20～40min，然后取环境微生物样本0.1ml注入到经灭菌的离心管中；b、样本在震荡器上充分震荡5min，13000r/min离心1min后弃上清液0.9ml；c、在剩余的0.1ml样本中加入权利要求1所述DNA前处理缓冲液0.9ml，在震荡器上充分震荡5min，13000r/min离心2min，弃上清液0.98ml，继续充分震荡2min，得到菌体DNA；d、在PCR管内加入10μl菌体DNA、4μlPCR缓冲液和6μl去离子水，在94℃反应5min、4℃反应1min的条件下循环5次，获得核酸DNA。
8.根据权利要求7所述核酸DNA的制备方法，其特征在于所述环境微生物样本为OD值≤0.1的污水。
9.核酸DNA的制备方法，其特征在于所述核酸DNA的制备方法是通过以下步骤实现的a、紫外线条件下对工作平台灭菌20～40min，然后取环境微生物样本0.1ml注入到经灭菌的离心管中，同时加入0.9ml权利要求1所述DNA前处理缓冲液，在震荡器上充分震荡5min；b、3600r/min离心1min，从管中搜集上清液移入另一个离心管中；c、加入与上清液等体积的DNA前处理缓冲液，再次在震荡器上充分震荡5min；d、重复b、c步骤；e、然后在13000r/min的条件下离心2min，弃上清液，管内加入DNA前处理缓冲液20μl，在震荡器上充分震荡5min，制备完毕得到菌体DNA；e、在PCR管内加入10μl菌体DNA、4μl PCR缓冲液和6μl去离子水，在94℃反应5min、4℃反应1min的条件下循环5次，获得核酸DNA。
10.根据权利要求9所述核酸DNA的制备方法，其特征在于所述环境微生物样本为生物反应器内的污水或污泥。
全文摘要
DNA前处理缓冲液及菌体DNA、核酸DNA的制备方法，它涉及环境微生物样本直接用于PCR反应的DNA前处理缓冲液及菌体DNA、核酸DNA的制备方法。针对环境微生物样本中DNA提取的难度较大，得率小，甚至无法提取，样品损失较大，费用较高，不能全面真实反映环境样本中微生物的种类和数量的问题，本发明的DNA前处理缓冲液由贮存液和SDS制成。常规的污水(OD值≤0.1)菌体DNA制备震荡、离心、弃上清液、剩余的样本中加入DNA前处理缓冲液、震荡、离心、弃上清液、震荡。对于污泥处理主要采用梯度离心的方法。一步法快速获得核酸DNA的方法是在菌体DNA的基础进行PCR扩增。本发明具有成本低廉、快速的优点。
文档编号C07H21/04GK1752094SQ20051001045
公开日2006年3月29日 申请日期2005年10月21日 优先权日2005年10月21日
发明者魏利, 马放 申请人:哈尔滨工业大学