一种调控核酸酶序列选择性的酶复合物及方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程技术领域，涉及对酶的性质进行人工调控的领域，具体涉及一种调控核酸酶序列选择性的酶复合物及方法。
【背景技术】
[0002]人工调控酶的底物选择性及催化活性在生命科学研宄和生物工程应用方面都具有重要的意义。一方面，酶作为天然的生物催化剂，其催化性能强大，尤其是在催化大分子反应上，目前人工合成的催化剂种类还非常少，酶有着不可替代的广泛应用。另一方面，酶的制备周期长，产量小，现有酶的种类有限，还远远不能满足实际应用的需求。因此，对现有的酶进行改造，从而获得新的性质，可以极大地拓宽酶的应用范围，为相关研宄和应用提供有力的技术手段。目前最常用的人工调控酶性质的方法主要是通过分子生物学的手段改变酶的氨基酸序列，而对酶进行后修饰的方法少有报道。
[0003]核酸酶(nuclease)是以核酸为底物、催化磷酸二酯键水解的一类酶。核酸酶包含脱氧核糖核酸酶(DNase)及核糖核酸酶(RNase)。核酸酶的序列选择性在基因工程中有着重要的应用，特定地切割某种序列的DNA或者RNA，能够帮助人们更方便灵活地剪切、拼装或去除特定的DNA或者RNA片段，实现多种应用。限制性内切酶是目前应用最为广泛的序列选择性切割酶，它们能够识别特定序列进行切割，是实验室研宄和基因工程中重要的工具酶。但是已经发现的限制性内切酶只有300多种，每种限制性内切酶只能识别特定的一种序列，因此能够识别和选择性切割的序列也只有300多种。许多研宄小组一直致力于通过突变氨基酸(Bloom, J.et al.Evolving strategies for enzyme engineering.Current Opin1n in Structural B1logy, 2005, 15, 447-452)或者蛋白融合技术(Koide, S.Generat1n of new protein funct1ns by nonhomologous combinat1ns andrearrangements of domains and modules.2009，Curr Opin B1tech 20, 398-404)来人工改造已有的限制性内切酶，希望获得新的识别序列。但这些方法的工作量大，而且不具备通用性。因此需要开发更简单有效的调控手段，使核酸酶获得更加丰富多样的序列选择性，从而在实际应用中，能够针对不同的目标切割序列，实现相应的选择性调控。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种调控核酸酶序列选择性的酶复合物及方法，建立一种全新的化学调控手段，使原本没有序列特异性的核酸酶(DNase和RNase)获得序列选择性，并可以根据所需切割序列(以下均称为“目标序列”)的需要灵活调控酶的序列选择性。
[0005]在建立本发明的过程中，申请人发现了一个重要的现象:
[0006]如图1所示，将一条磷酸骨架全硫代的DNA单链(用S-DNA表示)与DNase I按照一定的比例混合，在37°C下反应lh，超滤纯化后得到的DNase IiS-DNA只能切割该S-DNA的互补链，而几乎不再切割其他序列无关的单链DNA、双链DNA及发夹型结构的DNA。这种由广谱序列切割活性到只对特定序列切割的性质变化，显示出S-DNA对DNase I的模板诱导作用，即S-DNA与DNase I形成了稳定的复合物，在结构上抑制了 DNase I对无关目标链的切割，而只对该S-DNA模板链的互补链表现出较强的切割活性。实验还发现，DNase I与S-DNA链的结合作用非常稳定，室温放置一天后，DNase 1S-DNA仍旧表现出序列选择性。
[0007]为了对照，申请人使用未经过任何处理的正常DNase I作用于上述的无关DNA链和S-DNA的互补链，发现对两种链均表现出较强的切割活性。申请人进一步将该方法应用到RNase A上，将RNase A与全硫代RNA链(S-RNA)按一定比例混合在37°C下温育反应一个小时后，超滤除去多余的S-RNA，获得的RNase AiS-RNA复合物对S-RNA的互补链仍旧具有很高的切割活性，但对其他无关RNA链的切割活性受到很大的抑制，表明与RNase A结合的S-RNA也具有模板诱导作用。
[0008]申请人的重要发现可总结为:全硫代DNA单链在一定条件下会与DNase I形成紧密结合的DNase IiS-DNA复合物，抑制DNase I切割其他DNA链的活性，但被抑制的DNaseI在遇到该全硫代链的互补DNA链时，活性可以重启，快速切割该链。此方法也适用于RNaseA，结合全硫代RNA链形成的RNase AiS-RNA不再切割其他无关RNA序列，而只对该S-RNA链的互补链表现出切割活性。上述分别与DNase I和RNase A相结合的全硫代DNA单链和全硫代RNA链以下均称为全硫代模板链。
[0009]根据上述重要发现，本发明提供一种调控核酸酶(DNase I/RNase A)序列选择性的酶复合物，所述酶复合物为核酸酶与全硫代模板链的复合物，可用于选择性切割与该全硫代模板链互补的目标序列。所述核酸酶与所述全硫代模板链的摩尔比为1:1?1:10。
[0010]进一步地，所述全硫代模板链的长度在15-50个核苷酸之间。
[0011]进一步地，所述核酸酶与所述全硫代模板链之间为非共价或共价连接。
[0012]进一步地，所述目标序列与全硫代模板链互补的碱基数目在15-30个之间，目标序列的总长度不限。
[0013]一种调控核酸酶序列选择性的方法，包括如下步骤:
[0014]I)设计合成与目标序列互补的全硫代模板链。
[0015]2)将核酸酶与全硫代模板链在pH7.0-8.0的缓冲溶液中混合反应，在37°C下温育I小时。
[0016]3)采用截止分子量在20_40kD之间的超滤膜超滤除去上述反应体系中游离的全硫代链，获得核酸酶@全硫代链复合物。
[0017]4)利用核酸酶@全硫代链复合物切割目标序列。
[0018]本发明中使用的全硫代模板链的序列通过化学法合成直接获得。其中全硫代的目的是防止该模板链被核酸酶水解。全硫代序列不宜过长，可以比待切割目标序列短。为了能够在超滤过程中有效除去游离的全硫代链，保留核酸酶与全硫代链的复合物，全硫代链长度控制在50个核苷酸以下较为合适。核酸酶的用量为10 μ g量级。
[0019]核酸酶与全硫代模板链的反应条件为:核酸酶浓度0.lmg/mL，全硫代链的浓度15-30 μΜ(优选29 μΜ)，核酸酶与全硫代链的摩尔比为1:1?1:10。反应温度为29-370C (优选37°C )，反应时间45min_lh (优选Ih)。反应溶液为中性缓冲溶液(pH范围:
7.0-8.0，优选0.05M磷酸盐缓冲液，含0.15M氯化钠，pH 7.2)。在上述条件下，DNase I与全硫代DNA单链及RNase A与全硫代RNA链均可形成非共价稳定结合物，即DNase IiS-DNA复合物和 RNase AOS-RNA0
[0020]在此基础上，也可以进一步将核酸酶与全硫代模板链进行共价连接，使核酸酶与全硫代模板链的结合更为牢固。可以使用的共价反应类型有:在全硫代模板链的末端修饰-SH，利用SPDP (中文名:3_ (2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)或者SMCC (中文名:琥珀酰亚胺-4-环已烷-1-碳酸酯)催化该-SH与蛋白上氨基的反应；或在全硫代模板链末端修饰-COOH，利用EDC/NHS(中文名:1-(3- 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺)催化-COOH与蛋白上氨基的反应等等。非共价连接或共价连接均可获得稳定、具有序列选择性的核酸酶@全硫代链复合物，相比而言，非共价连接方法更加简单易行。
[0021]本发明的有益效果在于:我们发展了一种简单易行的使核酸酶获得序列选择性的方法。通过用不同的全硫代模板链与酶形成复合物，可以选择性地切割不同的目标序列，为分子生物学研宄、药物研制和基因工程技术开发等提供了强有力的新工具。
【附图说明】
[0022]图1是全硫代DNA单链(S-DNA)调控脱氧核糖核酸酶酶I (DNase I)序列选择性的原理图。
[0023]图2 (a)是实施例1使用S-DNA与DNase I非共价结合后，生成的DNase IiS-DNA切割荧光标记的目标DNA链和无关DNA链的实时荧光曲线图。
[0024]图2 (b)是实施例1中DNase IiS-DNA切割无标记的目标DNA链和无关DNA链后，对产物进行凝胶电泳的成像图。
[0025]图3 (a)是实施例2中使用RNase AiS-RNA切割目标RNA链后，对产物
[0026]进行凝胶电泳的成像图。
[0027]图3 (b)是实施例2中使用RNase AiS-RNA切割无关RNA链后，对产物进行凝胶电泳的成像图。
[0028]图4是实施例3中使用S-DNA与DNase I共价结合后，生成的DNase IiS-DNA共价复合物切割荧光标记的目标DNA链和切割无关DNA链的速率比(图中编号2)与实施例2中获得的非共价复合物切割荧光标记的目标DNA链和切割无关DNA链的速率比(图中编号I)的对照图。
【具体实施方式】
[0029]下面结合附图，通过具体实施例进一步阐述本发明。本领域的技术人员应当理解这些实施例仅用于说明本发明而不限制本发明的范围。
[0030]实施例1〈调控DNase I的序列选择性>
[0031]在该实施例中，目标DNA链序列为:
[0032]5’-TAT CTG CAC TAG ATG CAC CTT-3’ ；
[0033]无关DNA链序列为:
[0034]5’-CGGAAGACAGATGCUAAGTGCTTGACCTTCCG-3’ ；
[0035]合成的目标DNA序列的全硫代DNA模板链(S-DNA)的序列为:
[0036]5’-AAAAAAAAAAAGGTGCATCTAGTGCAGATA-3’ ；
[0037]上述S-DNA与DNase I结合形成DNase 1S-DNA及序列选择性测定的原理参见图1
[0038]在本发明中，为了有效指示DNase I/RNase A对拟切割目标DNA/RNA序列和其他无关序列的切割情况，申请人使用了两种方法:
[0039]I)荧光探针指示法。如图1中所示，拟切割目标序列和无关序列均标记了荧光基团和猝灭基团，两种基团之间可发生高效率的FRET。常见的包括FAM与TAMRA ;FAM与BHQl ；TET与BHQ2 ；Cy3与Cy5等等。当以上双标记序列保持完整时，荧光基团受激后发出的荧光被猝灭基团吸收，从而检测不到荧光。而