一种用于诱导表达锌指核酸酶的载体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种诱导表达锌指核酸酶的载体及其应用。该载体含有ColE1ori、Ampr基因，以及四个表达盒；从上游到下游，表达盒1依次包括PCMV?IE、Puror和SV40polyA，表达盒2依次包括PCMV、rtTA-Advanced和SV40polyA，表达盒3依次包括TREmod、PminCMV、DNA片段1和SV40polyA，表达盒4依次包括TREmod、PminCMV、DNA片段2和SV40polyA。实验证明，本发明具有如下优点：本发明所提供载体中带有一个用于药物筛选的基因，在转染效率低的条件下便于筛选和富集阳性细胞；本发明所提供载体将两个ZFN质粒整合到一起，故只要转染单个质粒即可，简化了转染环节；采用可诱导表达ZFNs的方法，控制ZFNs的表达时机，降低ZFNs对细胞的毒性。
【专利说明】—种用于诱导表达锌指核酸酶的载体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程领域，涉及一种用于诱导表达锌指核酸酶的载体及其应用。【背景技术】
[0002]基因打靶技术是20世纪80年代后期发展起来的一种在高等动物中精细修饰特定基因位点的技术。传统的同源重组(Homologous recombination,HR)介导的基因打祀方法效率低，大约只有1/106。锌指核酸酶(zinc finger nucleases, ZFNs)技术是近几年发展起来的一门新型基因打靶技术。ZFNs是一种人工构建的杂合分子，由一个与靶DNA序列特异性结合的多聚锌指结构域和一个切割DNA分子的核酸酶(Fol k I)结构域构成。DNA结合域使ZFN可以与特定DNA序列结合，核酸酶结构域可以将DNA双链切开。因此，ZFN可以在特定DNA区域切断DNA,之后通过诱导同源重组(Homologous recombination, HR)或者非同源末端连接(Non-homologous end joining, NHEJ)使特定基因位点产生突变,而使生物基因组发生遗传改变。
[0003]与传统的同源重组基因打靶相比，ZFNs具有效率高，特异性强，适用物种广泛等优点，因此在动植物遗传修饰及医学中具有极其广阔的应用前景。
[0004]虽然ZFNs具有打靶效率高的优点，但是目前的ZFNs技术体系对细胞的转染效率有很高的要求。主要表现在:1) ZFNs导入细胞的主要方法是通过转染ZFNs mRNA或ZFNs质粒DNA，这些方法都是在细胞内瞬时表达ZFNs，无法对转染后的细胞进行药物筛选，故需要大量分离和培养单细胞克隆以鉴定出发生中靶的细胞，在操作上极为不便，费时费力；2)功能性ZFNs是由一对质粒组 成，故需要同时转染两个质粒或其mRNA，对转染效率有一定影响；3)如果是稳定转染ZFNs质粒，ZFNs在细胞中持续表达，会对细胞产生脱靶毒性。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种用于诱导表达锌指核酸酶的载体。
[0006]本发明所提供的一个用于诱导表达锌指核酸酶的载体为环形载体。
[0007]所述环形载体，含有大肠杆菌复制起始区(Col Elori)、氨苄青霉素抗性基因(Ampr),以及表达盒1、表达盒2、表达盒3和表达盒4 ；
[0008]所述表达盒I从上游到下游依次包括如下元件=Paw IE^Puror和SV40polyA ;所述表达盒2从上游到下游依次包括如下元件f.、rtTA-Advanced和SV40polyA ;所述表达盒3从上游到下游依次包括如下元件:TREmtxnPminaw、DNA片段I和SV40polyA ;所述表达盒4从上游到下游依次包括如下元件:TREmml、PminQW、DNA片段2和SV40polyA ；
[0009]当所述表达盒3和所述表达盒4相邻且方向相反时，所述表达盒3中的所述TREnrod和所述表达盒4中的所述TREnwd可为同一个TREnwd,此时，所述表达盒3和所述表达盒4中的两个方向相反的Pniinaw和位于两个所述Pniinaw之间的共用的所述TREnrod构成Ptight元件。
[0010]所述DNA片段I和所述DNA片段2满足如下条件:所述DNA片段I编码的蛋白和所述DNA片段2编码的蛋白均含有能够与所述靶基因特异性结合的锌指结构域，以及能够切割所述靶基因的Fol k I结构域。
[0011]四个表达盒中，表达盒3和表达盒4的表达可诱导性依赖于TREnwd元件，由强力霉素结合到TREnwd元件上诱导表达盒3和4的表达。其它表达盒之间相互独立，方向可以不一样。
[0012]在所述环形载体A中，所述大肠杆菌复制起始区(Col Elori)的序列为序列表中序列I的第8632-9231位；所述氨苄青霉素抗性基因(Amplr)的序列为序列表中序列I的第10323-9393 位；
[0013]在所述表达盒I (正向)中，所述Paw IE的序列如序列表中序列I的第4196-4697位所示；所述Purolr的序列如序列表中序列I的第4810-5406位所示；所述SV40polyA的序列如序列表中序列I的第5673-5723位所示；
[0014]在所述表达盒2(反向冲，所述P.的序列如序列表中序列I的第8083-7502位所示；所述rtTA-Advanced的序列如序列表中序列I的第7394-6648位所示；所述SV40polyA的序列如序列表中序列I的第6625-6192位所示；
[0015]在所述表达盒3 (反向)中，所述TREnrod的序列如序列表中序列I的第1979-1730位所示；所述Pniinaw的序列如序列表中序列I的第1727-1659位所示；所述SV40polyA的序列如序列表中序列I的第458-265位所示；
[0016]在所述表达盒4 (正向)中，，所述TREnwd的序列如序列表中序列I的第1730-1979位所示；所述Pniinaw的 序列如序列表中序列I的第1985-2044位所示；所述SV40polyA的序列如序列表中序列I的第3377-3577位所示。
[0017]在本发明中，所述DNA片段I的序列如序列表中序列2所示；所述DNA片段2的序列如序列表中序列3所示。此时,所述环形载体为用于诱导表达作用于绵羊myostatin基因(序列4)第三外显子的特定位点(序列5)的锌指核酸酶的载体。
[0018]进一步，所述表达盒I (正向)的核苷酸序列为序列表中序列I的第4196-5723位；所述表达盒2 (反向)的核苷酸序列为序列表中序列I的第8083-6192位；所述表达盒3 (反向)的核苷酸序列为序列表中序列I的第1979-265位；所述表达盒4 (正向)的核苷酸序列为序列表中序列I的第1730-3577位。
[0019]更加具体的，所述环形载体的核苷酸序列为序列表中序列I。
[0020]本发明的再一个目的是提供所述环形载体(用于诱导表达作用于绵羊myostatin基因第三外显子的特定位点(序列5)的锌指核酸酶的载体)的制备方法。
[0021]所述环形载体的制备方法，具体可包括如下步骤:
[0022](I)用Hind III酶切pIRESpuro3质粒，将IRES和IVS片段切去，回收4.1kb片段，将其自连，得到重组载体，记为PPUR03 ；
[0023](2)用 Pvu II 酶切 pTet-on Advanced 质粒，回收 2.369kb 片段；用内切酶 Pvu II酶切所述PPUR03，回收线性载体骨架片段，记为片段A ;将所述2.369kb片段与所述片段A相连(正向相连和反向相连均可，在本发明中具体为反向相连)，得到重组载体，记为pAdvanced-Puro3。
[0024](3)用EcoR I和Xba I酶切序列表中序列2所示的DNA片段，回收1.185kb片段，记为ZFNl片段；用EcoR I和Xba I酶切pTRE-Tight-BI载体，回收线性载体骨架片段，记为片段B ;将所述ZFNl片段与所述片段B相连，得到重组载体，记为pTRE-Tight-B1-ZFNl ；[0025]用EcoR I和Xba I酶切序列表中序列3所示的DNA片段，回收1.185kb片段，记为ZFN2片段；用EcoR I和Xba I酶切pC1-neo载体，回收线性载体骨架片段，记为片段C ；将所述ZFN2片段与所述片段C相连，得到重组载体，记为pC1-ZFN2 ;用EcoR I和Not I酶切所述PC1-ZFN2，回收约1.2kb片段；用EcoR I和Not I酶切pIRESpuro3载体，回收线性载体骨架片段，记为片段D ;将所述约1.2kb片段与所述片段D相连，得到重组载体，记为pIRES-Puro3-ZFN2 ；
[0026](4)用 Nhe I 和 Not I 酶切所述 pIRES-Puro3_ZFN2，回收 1.247kb 片段；用 Nhe I和Not I酶切所述pTRE-Tight-B1-ZFNl，回收线性载体骨架片段，记为片段E ;将所述
1.247kb片段与所述片段E相连，得到重组载体，记为pTRE-Tight-B1-ZFNl/2 ；
[0027](5)用ApaL I酶切所述pTRE-Tight-B1-ZFNl/2，回收约4.0kb片段，将所述约4.0kb片段的末端补平,得到平齐末端片段I ;用Bgl II酶切所述pAdvanced-Puro3,回收线性载体骨架片段，记为片段F，将所述F片段的末端补平，得到平齐末端片段2 ;将所述平齐末端片段I和所述平齐末端片段2平末端相连(正向相连和反向相连均可，在本发明中具体为正向相连)，得到重组载体pTet-on-ZFNl/2。所述pTet-on-ZFNl/2即为用于诱导表达作用于绵羊myostatin基因第三外显子的特定位点(序列5)的锌指核酸酶的环形载体。
[0028]在步骤(5)中，末端补平去磷步骤为常规方法，平末端连接具体如下:1)将目的片段与载体片段混匀。2)50°C，2min。3) 16°C，lOmin。4)加入 T4DNA Ligase，Buffer 和50%PEG8000，混匀。5)6°C 10min,20°C 5min，4°C 2min，40 个循环。
[0029]所述环形载体(如pTet-on-ZFNl/2)在诱导表达作用于祀基因(如绵羊myostatin基因第三外显子的特定位 点(序列5))的锌指核酸酶中的应用也属于本发明保护范围。
[0030]本发明还提供了一种用于诱导表达作用于靶基因(如绵羊myostatin基因第三外显子的特定位点(序列5))的锌指核酸酶的组合物。
[0031]本发明所提供的用于诱导表达作用于靶基因(如绵羊myostatin基因第三外显子的特定位点(序列5))的锌指核酸酶的组合物，具体可由所述环形载体和强力霉素组成。
[0032]含有所述环形载体的重组菌或重组细胞属于本发明的保护范围。
[0033]本发明还一个目的是提供一种骨架载体。
[0034]本发明所提供的骨架载体为所述环形载体缺失所述DNA片段I和所述DNA片段2后形成的环形载体。
[0035]在本发明中，所有的所述绵羊myostatin基因的核苷酸序列如序列表中序列4所示。所有的所述绵羊myostatin基因第三外显子的特定位点均为序列表中序列5。
[0036]在本发明中，具体是通过如下实现诱导表达作用于靶基因(如绵羊myostatin基因)的锌指核酸酶的:在四环素类似物一强力霉素(Doxycycline，Dox)存在的情况下，Dox与所述rtTA-Advanced元件表达的蛋白rtTA结合,作用于所述Ptight元件,从而所述Pminaw驱动目的基因(如所述ZFNl和所述ZFN2)的表达，；在没有Dox的情况下，rtTA不能作用于所述Ptight元件，故目的基因(如所述ZFNl和所述ZFN2)不能表达。因此通过添加或撤除Dox来对目的基因(如所述ZFNl和所述ZFN2)实行可控表达。当所述ZFNl和所述ZFN2表达时，便可得到作用于绵羊myostatin基因第三外显子的特定位点(序列5)的锌指核酸酶。
[0037]本发明设计了一种诱导表达锌指核酸酶的载体和方法，优点是:1)载体中带有一个用于药物筛选的基因，在转染效率低的条件下便于筛选和富集阳性细胞；2)该载体将两个ZFN质粒整合到一起，故只要转染单个质粒即可，简化了转染环节；3)采用可诱导表达ZFNs的方法，控制ZFNs的表达时机，降低ZFNs对细胞的毒性。
【专利附图】
【附图说明】
[0038]图1为pC1-neo质粒的图谱。
[0039]图2为pIRESpuro3质粒的图谱。
[0040]图3 为 pTet-on-Advanced 质粒的图谱。
[0041]图4为pTRE-Tight-BI质粒的图谱。
[0042]图5为重组载体pTet-on-ZFNl/2的质粒图谱。
[0043]图6 为 pTet-on-ZFNl/2 质粒的酶切鉴定图。1:DNA Marker III ；2:Fsp I 酶切重组质粒 pTet-on-ZFNl/2 ；3:pTet-on_ZFNl/2 质粒对照；4:pAdvanced-puro3 质粒对照；5:Ikb ladder。
【具体实施方式】
[0044]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0045]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0046]pC1-neo 质粒购自 Promega 公司；pIRESpuro3 质粒、pTet-on-Advanced 质粒和pTRE-Tight-BI质粒均购自Clontech公司。其中，pC1-neo质粒的产品目录号为E1841 ；pIRESpuro3质粒的产品目录号为631619 ；pTet-0n Advanced质粒的产品目录号为630930 ；pTRE-Tight-BI质粒的产品目录号为631068。
[0047]实施例1、针对绵羊myostatin基因的ZFNs诱导表达载体的构建
[0048]本实施例所构建的重组载体pTet-on-ZFNl/2中ZFNl和ZFN2表达的蛋白特异识别并结合绵羊myostatin基因(序列4)的第三外显子(exon3)的特定基因位点(序列5)。若针对其它基因或其它位点，只需更换特异识别靶基因的ZFN序列或者根据研究需要更换其它的基因序列，其它采用与本发明相同的方法和材料即可。
[0049]本实施例构建针对绵羊myostatin基因的第三外显子(exon3)的特定基因位点(序列5)的ZFNs诱导表达载体pTet-on-ZFNl/2。所用到的原始质粒为pC1-neo质粒、pIRESpuro3 质粒、pTet-on-Advanced 质粒、pTRE-Tight-BI 质粒。其中，pC1-neo 质粒的图谱如图1所示；pIRESpuro3质粒的图谱如图2所示；pTet-on_Advanced质粒的图谱如图3所示；pTRE-Tight-BI质粒的图谱如图4所示。
[0050]一、重组载体 pTet-on-ZFNl/2 的构建
[0051 ] 下述连接体系中除特别说明外，均为粘末端连接形式。
[0052](I)用内切酶把11(1111酶切口11?5?111'03质粒，将IRES和IVS片段切去，回收4.1kb片段(含有Pawi^PurcApolyA、Col Elori和Amplr),将其自连，得到重组载体，记为pPUR03 ；
[0053](2)用内切酶Pvu II酶切pTet-on Advanced质粒，回收2.369kb片段(含有Pciv> rtTA-Advanced和SV40polyA);用内切酶Pvu II酶切所述pTORCB，回收线性载体骨架片段，记为片段A ;将所述2.369kb片段与所述片段A反向相连，得到重组载体，记为pAdvanced-Puro3。
[0054](3)—方面，用内切酶EcoR I和Xba I酶切序列表中序列2所示的DNA片段，回收1.182kb片段，记为ZFNl片段；用内切酶EcoR I和Xba I酶切pTRE-Tight-BI载体，回收线性载体骨架片段，记为片段B ;将所述ZFNl片段与所述片段B相连，得到重组载体，记为 pTRE-Tight-B1-ZFNl ；
[0055]另一方面，用内切酶EcoR I和Xba I酶切序列表中序列3所示的DNA片段，回收
1.185kb片段，记为ZFN2片段；用内切酶EcoR I和Xba I酶切pC1-neo载体，回收线性载体骨架片段，记为片段C ;将所述ZFN2片段与所述片段C相连，得到重组载体，记为pC1-ZFN2 ；用内切酶EcoR I和Not I酶切所述PC1-ZFN2，回收约1.2kb片段(含有ZFN2片段)；用内切酶EcoR I和Not I酶切pIRESpuro3载体，回收线性载体骨架片段，记为片段D ;将所述约1.2kb片段与所述片段D相连，得到重组载体，记为pIRES-Puro3-ZFN2 ；
[0056](4)用内切酶 Nhe I 和 Not I 酶切所述 pIRES-Puro3_ZFN2，回收 1.247kb 片段(含有ZFN2片段)；用内切酶Nhe I和Not I酶切所述pTRE-Tight-BI_ZFN2，回收线性载体骨架片段，记为片段E ;将所述1.247kb片段与所述片段E相连，得到重组载体，记为pTRE-Tight-B1-ZFNl/2 ；
[0057](5)用内切酶 ApaL I 酶切所述 pTRE-Tight-B1-ZFNl/2，将 Ampr 和 Col Elori 片段切去，回收约 4.0kb 片段(含有 SV40polyA、Ptight、ZFNl、ZFN2 和 SV40polyA)，将所述约 4.0kb片段的末端补平，得到平齐末端片段I ;用内切酶Bgl II酶切所述pAdvanced-PurM，回收线性载体骨架片段，记为片段F，将所述F片段的末端补平，得到平齐末端片段2 ;将所述平齐末端片段I和所述平齐末端片段2正向相连，得到重组载体pTet-on-ZFNl/2。
[0058]其中，末端补平去磷步骤为常规方法，平末端连接具体如下:I)将目的片段与载体片段混匀。2)50°C，2mi n。3) 16°C，lOmin。4)加入 T4DNA Ligase，Buffer 和 50%PEG8000，混匀。5)6°C 10min,20°C 5min，4°C 2min，40 个循环。
[0059]重组载体pTet-on-ZFNl/2的质粒图谱如图5所示，重组载体pTet-on-ZFNl/2,含有大肠杆菌复制起始区(Col Elori)、氨苄青霉素抗性基因(AmpD，以及4个表达盒(记为表达盒1、表达盒2、表达盒3和表达盒4)。所述表达盒I从上游到下游依次包括如下元件Tcmv IE、Puror和SV40polyA ;所述表达盒2从上游到下游依次包括如下元件:PCMV、rtTA-Advanced和SV40polyA ;所述表达盒3从上游到下游依次包括如下元件:TREm()d、PminCMv> ZFNl和SV40polyA ;所述表达盒4从上游到下游依次包括如下元件:TREm()d、PminCMV、ZFN2和SV40polyA。其中，所述表达盒3和所述表达盒4共用同一个TREnrod，所述表达盒3和所述表达盒4中两个方向相反的Pminaw和位于两个所述Pminaw之间的TREnwd组成Ptight元件。
[0060]二、重组载体 pTet-on-ZFNl/2 的鉴定
[0061]1、分子鉴定
[0062]用Fsp I酶切重组质粒pTet-on-ZFNl/2，检测酶切产物的大小。同时以未经酶切的重组质粒pTet-on-ZFNl/2,以及未经酶切的pAdvanced_Puro3质粒作为对照。
[0063]结果如图6所示，用Fsp I酶切重组质粒pTet-on-ZFNl/2，切开后为单片段，长度约10kb，为重组质粒pTet-on-ZFNl/2全长。酶切鉴定结果与序列分析结果一致，因此初步判断重组质粒pTet-on-ZFNl/2经酶切鉴定是正确的。
[0064]2、测序分析
[0065]对所述重组载体pTet-on-ZFNl/2进行序列测定，结果显示:所述重组载体pTet-on-ZFNl/2的全载体序列为序列表中序列I。
[0066]其中，第8632-9231位为大肠杆菌复制起始区(Col Elori)的序列。
[0067]第10323-9393位(序列I中的测序顺序是该读框的反向)为氨苄青霉素抗性基因(Ampr)的序列。
[0068]第4196-5723位为步骤一中所述的表达盒I。具体而言，第4196-4697位为Pqw IE的序列；第4810-5406位为Purolr的序列；第5673-5723位为SV40polyA的序列。
[0069]第8083-6192位(序列I中的测序顺序是其反向)为步骤一中所述的表达盒2。具体而言，第8083-7502位为Pcmv的序列；第7394-6648位为rtTA-Advanced的序列；第6625-6192 位为 SV40polyA 的序列。
[0070]第1979-265位(序列I中的测序顺序是其反向)为步骤一中所述的表达盒3。具体而言，第1979-1730位为TREnwd的序列，第1727-1659位为Pminaw的序列，第1647-466位为ZFNl的序列，第458-265位为SV40polyA的序列。
[0071]第1730-3577位为步骤一中所述的表达盒4。具体而言，第1730-1979位为TREnrod的序列，第1985-2044位为Pminaw的序列，第2139-3323位为ZFN2的序列，第3377-3577位为SV40polyA的序列。
[0072]实施例2、利 用诱导表达ZFNs的方法敲除绵羊胎儿成纤维细胞的myostatin基因
[0073]—、原代绵羊胎儿成纤维细胞的分离培养
[0074]细胞培养液:DMEM/F12 (Gibco公司产品，产品目录号为12500062) +10% (体积分数)胎牛血清
[0075]细胞消化液:称取NaC18.0g, KC10.4g，葡萄糖 1.0g, NaHCO3,0.35g，EDTA.四钠盐
2.(^，胰酶2.58，用1^1110 H2O定容至1L。过滤除菌，_20°C保存备用。
[0076]细胞冷冻液:DMEM/F12+20% (体积分数)胎牛血清+10% (体积分数)DMS0。
[0077]一、原代绵羊胎儿成纤维细胞的分离培养
[0078]1.胎儿组织的采集及细胞分离:
[0079]通过手术采集发育70天小尾寒羊胎儿，剪取胎儿小块皮肤组织，放到无菌生理盐水中带回实验室，在超净工作台中在无菌操作条件下将组织用剪刀剪碎至Imm3大小，然后将组织碎块转移到含有0.25% (0.25g/100mL)胰蛋白酶的无钙、镁PBS溶液中，在37°C下孵育消化30-60分钟。加入血清终止消化，利用三层无菌纱布过滤消化的组织，收集含有细胞的滤液，转移到试管中，在lOOOr/min下离心10分钟。离心后弃上清，加入细胞培养液重悬细胞沉淀，并稀释细胞到约IX IO7个细胞/毫升。将细胞接种到培养皿中，约12小时后可见大量细胞贴壁生长，之后每天观察细胞生长状态，每隔48小时换液一次。当细胞生长至80%汇合时进行传代。多次传代后原始细胞培养物中的成纤维细胞占主要优势，上皮细胞由于生长较慢被逐渐淘汰。成纤维细胞可通过常规显微镜下的形态判断。
[0080]2.细胞的传代
[0081]待细胞生长至80%汇合时，吸去细胞培养液，加入无钙、镁PBS溶液洗涤细胞2次，然后加入含有0.25% (0.25g/100mL)胰蛋白酶和0.02% (0.02g/100mL) EDTA的消化液消化细胞3-5分钟，待细胞变圆时，加37°C预热的培养液终止消化，吹打细胞使之彻底脱离培养皿底壁，并成单细胞，然后将细胞稀释至合适浓度，按照1:2或1:3比例接种到培养皿中。随后的传代方法与此相同。[0082]3.细胞的冷冻保存
[0083]根据实验需要，可将不同传代次数的细胞进行冷冻保存以用于下一步研究。冷冻方法是:待细胞生长至80%汇合时，吸去细胞培养液，加入无钙镁PBS洗涤细胞2次，然后加入含有0.25% (0.25g/100mL)胰蛋白酶和0.02% (0.02g/100mL) EDTA的消化液消化细胞
3-5分钟，待细胞变圆时，加37°C预热的培养液终止消化，吹打细胞使之彻底脱离培养皿底壁，并成单细胞，然后将细胞转移到15毫升离心管，在1000r/min下离心10分钟。离心后弃上清，加入细胞冷冻液重悬细胞沉淀，细胞浓度约为I X IO7个细胞/毫升，转移到冻存管中，分别在4°C放置30分钟，-20°C放置2小时，_80°C过夜，然后转入液氮中长期保存。
[0084]二、细胞转染
[0085]1、利用常规分子生物学方法大量提取纯化实施例1构建的pTet-on-ZFNl/2质粒。
[0086]2、利用限制性内切酶Fsp I线性化pTet-on-ZFNl/2质粒，酚仿抽提纯化，无水乙醇沉淀DNA，最后用超纯水或PBS溶液溶解DNA沉淀。
[0087]3、利用电转染方法将线性化pTet-on-ZFNl/2质粒转入步骤一获得的原代绵羊胎儿成纤维细胞细胞中。本实例中使用美国BTX公司生产的ECM830电穿孔仪进行转染，具体方法:当细胞生长至80%汇合时，用细胞消化液消化贴壁的细胞，离心收集细胞(方法同前“细胞的传代”)。将收集到的细胞放到电击杯中，每个电击杯中400μ I电转染液(DMEM/F12)，在每个电击杯中加 入7.5 yg线性化质粒，打开电穿孔仪，设置参数。将电击杯放置在电穿孔仪中的电击池中，电击2min后放于4°C冰箱中lOmin。IOmin后，将电击杯中的细胞分装到10盘IOcm细胞培养皿中。24h后，观察细胞生长状况，加药筛选单克隆。
[0088]三、强力霉素(Dox)诱导
[0089]在转染后24-48小时，用加有终浓度为Ing/μ I的强力霉素(Dox)和终浓度为
2.0 μ g/ml嘌呤霉素(puromycin)的细胞培养液(同前)培养细胞，48小时后去除Dox，用加有2.0 μ g/ml嘌呤霉素的细胞培养液继续培养细胞，10天后存活细胞形成单克隆。
[0090]四、细胞鉴定
[0091]1、在体式显微镜下，将细胞消化液滴到单细胞克隆上，约I分钟后用玻璃吸管轻轻吹打，使细胞脱离，用玻璃吸管把悬浮的单细胞转移到48孔板继续扩增培养。几次扩增传代获取足够数量细胞后，一部分细胞用于分子鉴定，剩余部分进行冷冻保存。
[0092]2、用于分子鉴定的细胞按如下方法处理:用PCR裂解液裂解细胞，利用特异性引物(引物I/引物2)扩增myostatin基因目标片段。对PCR产物进行测序,鉴定myostatin基因突变情况。
[0093]其中，PCR裂解液配方如下:67mmol/L Tris-Cl (pH8.8)，16.6mmol/L 硫酸铵，5mmol/Li3-疏基乙醇，6.7mmol/L MgCl2,6.7 μ mol/L EDTA (pH8.0), 1.7 μ mol/L SDS,50 μ g/ml蛋白酶K。各浓度均为相应组分在裂解液中的终浓度。
[0094]引物1:5，-TGAGGAAAACAGCGATAAAC-3，；
[0095]引物2:5’ -CACAAGATGGGTATGAGGAT-3’。
[0096]检测结果显示，在214个单克隆的测序结果中，有12个单克隆的myostatin基因发生了突变，效率达到5.6%。最后成功扩增了 9个myostatin基因的第三外显子(exon3)发生突变的单克隆细胞株(编号为ZFN-1至ZFN-9)。在这9个单克隆中，有2个单克隆发生了双等位基因突变，其中一个单克隆的双等位基因均缺失了 5个碱基“AGAAG”;另一个单克隆的一个等位基因缺失一个“A”碱基，另一个等位基因缺失了 12个碱基“TCAAGGTAACAG” ；剩余的7个单克隆均发生了单等位基因突变，其中一个单克隆的一个等位基因增加了一个“T”碱基；其余6个单克隆发生了相同的突变，均只有一个等位基因缺失一个“T”碱基。详见表1。
[0097]表19个单克隆细胞株myostatin基因的第三外显子的测序结果
[0098]
【权利要求】
1.用于诱导表达作用于靶基因的锌指核酸酶环形载体，含有大肠杆菌复制起始区、氨苄青霉素抗性基因，以及表达盒1、表达盒2、表达盒3和表达盒4 ； 所述表达盒I从上游到下游依次包括如下元件:Ρ.IE、Purc/和SV40polyA ;所述表达盒2从上游到下游依次包括如下元件f。.、rtTA-Advanced和SV40polyA ;所述表达盒3从上游到下游依次包括如下元件:TREmml、PminCMV> DNA片段I和SV40polyA ;所述表达盒4从上游到下游依次包括如下元件:TREmml、PminCMV> DNA片段2和SV40polyA ； 所述DNA片段I和所述DNA片段2满足如下条件:所述DNA片段I编码的蛋白和所述DNA片段2编码的蛋白均含有能够与所述靶基因特异性结合的锌指结构域，以及能够切割所述靶基因的Fol k I结构域。
2.根据权利要求1所述的环形载体，其特征在于:所述大肠杆菌复制起始区的序列为序列表中序列I的第8632-9231位；所述氨苄青霉素抗性基因的序列为序列表中序列I的第10323-9393位；和/或 在所述表达盒I中，所述P.IE的序列如序列表中序列I的第4196-4697位所示；所述Purolr的序列如序列表中序列I的第4810-5406位所示；所述SV40polyA的序列如序列表中序列I的第5673-5723位所示；和/或 在所述表达盒2中，所述P.的序列如序列表中序列I的第8083-7502位所示；所述rtTA-Advanced的序列如序列表中序列I的第7394-6648位所示；所述SV40polyA的序列如序列表中序列I的第6625-6192位所示；和/或 在所述表达盒3中，所述TREnrod的序列如序列表中序列I的第1979-1730位所示；所述PminCiv的序列如序列表中序列I的第1727-1659位所示；所述SV40polyA的序列如序列表中序列I的第458-265位所示；和/或 在所述表达盒4中，所述TREnrod的序列如序列表中序列I的第1730-1979位所示；所述PminCiv的序列如序列表中序列I的第1985-2044位所示；所述SV40polyA的序列如序列表中序列I的第3377-3577位所示。
3.根据权利要求1或2所述的环形载体，其特征在于:所述DNA片段I的序列如序列表中序列2所示；所述DNA片段2的序列如序列表中序列3所示。
4.根据权利要求1-3中任一所述的环形载体，其特征在于:所述表达盒I的核苷酸序列为序列表中序列I的第4196-5723位；和/或 所述表达盒2的核苷酸序列为序列表中序列I的第8083-6192位；和/或 所述表达盒3的核苷酸序列为序列表中序列I的第1979-265位；和/或 所述表达盒4的核苷酸序列为序列表中序列I的第1730-3577位。
5.根据权利要求1-4中任一所述的环形载体，其特征在于:所述环形载体的核苷酸序列为序列表中序列I。
6.权利要求5所述环形载体的制备方法，包括如下步骤: (1)用HindIII酶切pIRESpuro3质粒，将IRES和IVS片段切去，回收4.1kb片段，将其自连，得到重组载体，记为PPUR03 ； (2)用PvuII酶切pTet-on Advanced质粒，回收2.369kb片段;用内切酶Pvu II酶切所述PPUR03，回收线性载体骨架片段，记为片段A ;将所述2.369kb片段与所述片段A相连，得到重组载体，记为pAdvanced_Puro3。(3)用EcoRI和Xba I酶切序列表中序列2所示的DNA片段，回收1.182kb片段，记为ZFNl片段；用EcoR I和Xba I酶切pTRE-Tight-BI载体，回收线性载体骨架片段，记为片段B ;将所述ZFNl片段与所述片段B相连，得到重组载体，记为pTRE-Tight-B1-ZFNl ； 用EcoR I和Xba I酶切序列表中序列3所示的DNA片段，回收1.185kb片段，记为ZFN2片段；用EcoR I和Xba I酶切pC1-neo载体，回收线性载体骨架片段，记为片段C ;将所述ZFN2片段与所述片段C相连，得到重组载体，记为pC1-ZFN2 ;用EcoR I和Not I酶切所述PC1-ZFN2，回收1.2kb片段；用EcoR I和Not I酶切pIRESpuro3载体，回收线性载体骨架片段，记为片段D ;将所述1.2kb片段与所述片段D相连，得到重组载体，记为pIRES-Puro3-ZFN2 ； (4)用Nhe I 和 Not I 酶切所述 pIRES_Puro3_ZFN2，回收 1.247kb 片段；用 Nhe I 和Not I酶切所述pTRE-Tight-B1-ZFNl，回收线性载体骨架片段，记为片段E ;将所述1.247kb片段与所述片段E相连，得到重组载体，记为pTRE-Tight-B1-ZFNl/2 ； (5)用ApaLI酶切所述pTRE-Tight-B1-ZFNl/2，回收4.0kb片段，将所述4.0kb片段的末端补平，得到平齐末端片段I ;用Bgl II酶切所述pAdvanced-PurM，回收线性载体骨架片段，记为片段F，将所述F片段的末端补平，得到平齐末端片段2 ;将所述平齐末端片段I和所述平齐末端片段2相连，得到重组载体pTet-on-ZFNl/2 ;所述重组载体pTet-on-ZFNl/2即为所述环形载体。
7.权利要求1-5中任 一所述的环形载体在诱导表达作用于靶基因的锌指核酸酶中的应用。
8.用于诱导表达作用于靶基因的锌指核酸酶的组合物，由权利要求1-5中任一所述的环形载体和强力霉素组成。
9.含有权利要求1-5中任一所述的环形载体的重组菌或重组细胞。
10.骨架载体，为权利要求1-5中任一所述的环形载体缺失权利要求1-5任一中所述的DNA片段I和所述的DNA片段2后形成的环形载体。
【文档编号】C12N1/15GK103757037SQ201310692299
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2013年12月17日 优先权日:2013年12月17日
【发明者】侯健, 麻富强, 安晓荣 申请人:中国农业大学