专利名称：单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生命科学领域，具体涉及到单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统及其构建方法和应用。
背景技术：
基因治疗是目前肿瘤治疗领域很有希望的治疗方法之一，而基因治疗中对所用治疗基因的准确快速的调控对提高疗效，减少治疗基因带来的负作用至关重要。Tet-on诱导表达系统，是四环素诱导系统的一种，特点是加入四环素或者其衍生物如强力霉素(Doxycycline, Dox)等诱导药物后,受控基因表达开启。Tet_on诱导表达系统是广泛应用的诱导表达系统，具有本底低，高诱导倍数，高特异性，诱导剂无明显毒性等优点，非常适合对治疗基因的调控。现阶段，该系统已被应用于诸多疾病的研究和治疗中。但现有的Tet-on 诱导表达系统依然存在较明显的本底渗漏和调控蛋白过量表达对细胞的干扰作用，同时以往Tet-o诱导表达系统的建立需要调控载体和反应载体两个质粒，如此降低了系统建立的效率。单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统可以克服两质粒系统的缺点，同时具有低本底渗漏，并易于用于如腺病毒等载体，因此对于肿瘤治疗至关重要。通过建立一种全部调控系统和目的基因都位于一个载体上，并具有低本底渗漏和高效诱导倍数的Tet-on诱导表达系统，实现对各种基因，如报告基因或者抗肿瘤基因TRAIL的有效调控表达；并能应用到如腺病毒载体等病毒载体上，使其获得的具有更好的活力，为肿瘤基因治疗提供有力的工具。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题在于提供一种单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统。本发明所要解决的另一个技术问题在于提供一种单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统的构建方法。本发明所要解决的还有一个技术问题在于为单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统提供一种新用途。解决上述技术问题采用的技术方案是单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统元件的连接顺序为 5_’ CMV-TetR-KRAB-SV40polyA-rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB-TRE- Tight-PminCMV-EcoR I -Spe I -SV40polyA_3’，Tight-PminCMV 左侧的复合兀件rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB-TRE 的连接方式为 3’ -rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB-TRE_5’ -5’ -Tight-PminCMV-3’，其余元件均按与该系统相同方向5’ -3’顺序连接；两个酶切位点EcoRI和Spe I位于元件Tight-PminCMV和元件SV40polyA之间，该系统序列如核苷酸序列表中 No. 11。本发明的TRE元件左侧的PminCMV元件的方向与右侧的Tight-PminCMV启动方向相反，均与TRE元件相邻。在本发明单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统的EcoR I与Spe I位点间连入的目的基因是报告基因或肿瘤治疗基因。单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统的构建方法包括下述步骤I、构建含有Kpn I -Cla I -Not I -Xho I -EcoR I -Spe I 限制性内切酶位点的腺病毒El区穿梭载体使用酶切连接法将DNA linker (Kpn I -Cla I -Not I -Xho I -EcoR I -SpeI -Spe I )连接入腺病毒El区穿梭载体，获得所需要的载体；2、扩增构建单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统所需的元件通过聚合酶链式反应扩增构建单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统所需的元 件，元件包括 CMV、TetR-KRAB, SV40polyA、Tight-PminCMV, rtTA2S_M2。3、构建带有复合元件TRE-KB-PminCMV-EB-rtTA2S-M2的中间载体通过酶切连接，将TRE-PminCMV 连接至 pShuttle-KSL-SV40polyA_KB，并使用Kpn I酶切后，T4 DNA聚合酶补平末端，再用T4 DNA连接酶进行平末端连接，使TRE-PminCMV序列中304位的Kpn I位点消失，获得TRE-KB-PminCMV元件；再将rtTA2S_M2连接到 TRE-KB-PminCMV 的 3’ 端，同样方法使 TRE-KB-PminCMV 与 rtTA2S_M2 间的 EcoR I位点消失，得到带有复合元件TRE-KB-PminCMV-EB-rtTA2S-M2的中间载体pShuttIe-TRE-KB-PminCMV-EB-rtTA2S-M2-SV40polyA。4、构建单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统使用连接酶连接法，将元件5’ -CMV-3’，5’ -TetR-KRAB-3’先后连接到pShuttle-KSL-SV40polyA 上，5’ -SV40polyA_3’ 与 3’ -rtTA2S-M2-TRE-PminCMV_5’ 连接为5’ -SV40polyA-3’ -3’ -rtTA2S-M2-TRE-PminCMV_5’，并一起连接到元件 TetR-KRAB 的 3’端，再将 5’ -Tight-PminCMV-3 连接到 3’ -rtTA2S-M2-TRE-PminCMV_5’ 的 5’ 端，得单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统。单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统在制备治疗结肠癌药物中的用途。有效成分制备El区携带单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统并调控表达目的基因TRAIL的腺病毒载体，制备治疗肿瘤药物用常规注射剂的形式来使用。所述的药用常规制剂含作为活性成分的制备El区携带单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统并调控表达目的基因TRAIL的腺病毒载体，该活性成分在制剂中与药学上可接受的载体如适宜于静脉注射给药的有机或无机液体赋形剂混合。单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统在制备治疗结肠癌药物中的用途，制备El区携带单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统并调控表达目的基因TRAIL的腺病毒载体，制备治疗结肠癌药物以注射液来使用，制备该药物1000支用原料及其配比如下El区携带单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统并调控表达目的基因TRAIL的腺病毒载体2 X IO15Vp注射用水加至2000mL制备方法按药剂学注射剂的常规方法进行。每支2mL，每mL含活性成分El区携带单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统并调控表达目的基因TRAIL的腺病毒载体I X IO12Vp。
使用时每日I次注射,按瘤体积计算,瘤体<3cm3，用量为2X IO12Vp病毒即I支；3cm3<瘤体<5cm3，用量为3X 1012vp病毒即I. 5支；瘤体>5cm3，用量为4X IO12Vp病毒即2支，每次多点瘤内注射。治疗一个疗程用药连续5天。用药期间同时按常规抗生素用量口服强力霉素。本发明改进了 Tet-on诱导表达系统的结构，使全部调控元件和目的基因的表达均构建在了一个载体上，克服2质粒Tet-on系统的低效性，同时对基因表达的调控具有严密性，并能应用于如腺病毒载体等病毒载体，使基因的治疗更为安全和有效。
图I 是载体 pShuttle-KSL-SV40polyA_KB 的构建流程。图2是带有复合元件TRE-KB-PminCMV-EB-rtTA2S-M2的中间载体的构建流程。
图3是单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统构建流程及结构。图4是载体pEl-Bi-Tet-on的结构。图5是载体pEl-r-Tet-on的结构。图6单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统对eGFP基因表达的调控作用。图7单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统对Flu基因表达的调控作用。图8单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统的时间诱导曲线。图9单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统药物剂量依赖曲线。图10单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统的去药物后关闭曲线。图11单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统对FAM76B_Flag基因表达的调控作用的Western Blot检测结果。图12是El区带有单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统并调控表达TRAIL基因的腺病毒载体在体外对人结肠癌细胞SW480的生长抑制作用。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。实施例I本实施例的单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统,其元件的连接顺序为5_’ CMV-TetR-KRAB-SV40polyA-rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB-TRE-Tight-PminCMV-EcoR I -Spe
I -SV40polyA-3，。Tight-PminCMV 左侧的复合元件 rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB_TRE 的连接方式为3’ -rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB-TRE-5’ -5’ -Tight-PminCMV-3’，其余元件均按与该系统相同方向5’ -3’顺序连接；两个酶切位点EcoR I和Spe I位于元件Tight-PminCMV和元件SV40polyA之间。该系统序列如核苷酸序列表中No. 11。其构建方法步骤如下I、构建含有Kpn I -Cla I -Not I -Xho I -EcoR I -Spe I 限制性内切酶位点的腺病毒El区穿梭载体委托生工生物上海有限公司合成两端含有酶切位点Xba I与Bgl II的双向多聚腺苷酸信号SV40polyA序列，连接在载体pUC19-SV40polyA上，经过Xba I与Bgl II双酶切后经过DNA琼脂糖电泳纯化回收后获得的SV40polyA片段与经相同酶切的腺病毒El区穿梭载体pShuttle (购买自addgene公司)连接。T4连接酶进行连接,连接条件为2μ I酶切纯化片段，5μ I 2ΧΤ4连接酶缓冲液，O. 5μ I pShuttle载体，O. 5μ I Τ4连接酶，2 μ I三蒸水，25°C连接I小时，将连接产物转化感受态的DH5a细胞。并涂布于含有30 μ g/ml的卡那霉素的LB平板中。挑取菌落,接种到30ug/ml的卡那霉素的LB培养液中，14-16小时后，经碱性裂解法提取质粒DNA，经Xba I与Bgl II双酶切鉴定获得阳性克隆。获得的载体命名为pShuttle-SV40polyA，见图I。再将此载体经过EcoR I酶切后，使用T4DNA聚合酶将粘性末端补平，反应体系为20 μ I酶切产物，3 μ I EcoR I酶切缓冲液，Ιμ IOmM dNTP, I μ I T4DNA聚合酶，25 μ I三蒸水，37°C反应I小时。补平末端的产物，进行平末端连接，连接条件为1μ I补平末端产物，5 μ I 2ΧΤ4连接酶缓冲液，O. 5μ IΤ4连接酶，3. 5 μ I三蒸水，25°C连接I小时，使得位于原pShuttle上2668位上的EcoR I消失，获得的载体称为 pShuttle-SV40polyA-EB，见图 I。将载体 pShuttle-SV40polyA_EB经 Kpn I 与 Xba I 双酶切后，与 DNAlinker (Kpn I -Cla I -Not I -Xho I -EcoRI -Spe I -Spe I )连接，获得的阳性克隆称为pShuttle-KSL_SV40polyA，见图I。将载 体pShuttle-KSL-SV40polyA经过Kpn I酶切，T4DNA聚合酶将粘性末端补平后，T4连接酶连接后，使载体pShuttle-KSL-SV40polyA上的Kpn I位点消失，获得的阳性克隆称为pShuttle-KSL-SV40polyA-KB，见图 I。2、扩增构建单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统所需的元件peGFPNl载体购自CL0NTECH公司，peGFPNl为聚合酶链式反应模板，经过聚合酶链式反应获得增人巨细胞病毒启动子CMV的序列，并在5’端引入Kpn I位点，3’端引入Cla I位点，PI-P2 为一对引物 PI: GGTACCAATAGTTATTAATAGTAA，P2: ATCGATGATCTGACGGTTCACTAA。聚合酶链式反应扩增条件是94°C、2分钟，94°C、50秒，55 °C、60秒，72 °C、60秒，30个循环。重叠聚合酶链式反应产物经质量浓度为1.0%的琼脂糖电泳后回收片段。将聚合酶链式反应片段与pGEMT easy载体连接。连接条件是2 μ I酶切纯化片段，5 μ I 2ΧΤ4连接酶缓冲液，O. 5μ1 pGEMT easy载体，O. 5μ I Τ4连接酶，2 μ I三蒸水，25°C连接I小时，将连接产物转化感受态的DH5 α细胞，并涂布于含有100 μ g/ml的氨苄青霉素的LB平板中。挑取菌落接种到含有100 μ g/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，14 16小时后，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定阳性克隆。将所获得阳性克隆命名为pGEMT/CMV。载体pLVCT-tTR-KRAB购买自addgene公司，以pLVCT-tTR-KRAB为聚合酶链式反应模板，经过聚合酶链式反应获得四环素转录沉默因子TetR-KRAB序列，并在5’端引入Cla I 位点，3 ’ 端引入 Not I 位点 P3-P4 为一对引物 P3 AATCGATATGGCTAGATTAGATAAA,P4: TGCGGCCGCTTAAACTGATGATTTGAT。聚合酶链式反应扩增条件是94 °C、2 分钟，94 °C、50秒，55 0C >60秒，72 0C >70秒，30个循环。产物如前所述，回收后与pGEMT easy载体连接，获得的阳性克隆称为pGEMT/TetR-KRAB。以步骤I中所述的pUC19-SV40polyA为模板，同样聚合酶链式反应扩增获得SV40polyA元件，并在5’端引入Not I位点，3’端引入Xba I位点，P5-P6为一对扩增引物，P5: GCGGCCGCCACAGCGGGGAGATCCAG, P6: CTCTAGACTCATGGCTGCGCCCCGA,聚合酶链式反应扩增条件是94°C、2分钟，94°C、50秒，55 °C、60秒，72 °C、30秒，30个循环。产物如前所述，回收后与pGEMT easy载体连接，获得的阳性克隆称为pGEMT/SV40polyA。
使用合成引物P7-P8为模板和引物，聚合酶链式反应扩增严谨型最小人巨细胞病毒启动子Tight-PminCMV序列，并在5’端引入Sal I位点，3’端引入EcoR I位点，P7 :GGTCGACTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGT, P8:GGAATTCGCGATCTGACGGTTCACTAAACGAGCTCTGCTTATATAGG。合酶链式反应扩增条件是94°C、2分钟，94°C、50秒，55°C >60秒，72 0C >20秒，30个循环，产物经过琼脂糖电泳回收后与pGEMT easy载体连接，获得的阳性克隆称为 pGEMT/Tight-PminCMV。载体pTet-on advanced,购自 CL0NTECH 公司，以 pTet-on advanced 为聚合酶链式反应模板，经过聚合酶链式反应获得反式四环素转录激活因子rtTA2S-M2序列，并在5’端引入EcoR I位点，3’端引入Spe I位点，P9-P10为一对扩增引物P9 :GGAATTCATGTCTAGACTGGACAAG, PlO GACTAGTTTACCCGGGGAGCATGTC0 合酶链式反应扩增条件是94 °C、2分钟，94°C、50秒，55 °C、60秒，72 °C、60秒，30个循环。产物如前所述，回收后与pGEMT easy载体连接，获得的阳性克隆称为pGEMT/rtTA2S_M2。3、构建带有复合元件TRE-KB-PminCMV-EB-rtTA2S-M2的中间载体 载体pTRE2pur载体购自CL0NTECH公司，经Xho I与EcoR I双酶切后，经反应产物经质量分数为I. 0%的琼脂糖电泳后回收带有四环素反应元件TRE的最小人巨细胞病毒启动子TRE-PminCMV片段，与经相同酶切的载体pShuttle-KSL-SV40polyA-KB (步骤I中所述)进行连接，连接条件是2μ I酶切纯化的TRE-PminCMV片段，5 μ I 2ΧΤ4连接酶缓冲液，O. 5 μ I pShutt I e-KSL-SV40po I yA-KB 载体，O. 5 μ I Τ4 连接酶，2 μ I 三蒸水，25°C连接I小时，连接产物转化入感受态的DH5a细胞，挑取克隆，经过Xho I与EcoR I双酶切鉴定后所获得的阳性克隆称为pShuttle-TRE-PminCMV-SV40polyA，见图2。将pShuttle-TRE-PminCMV-SV40polyA 经过 Kpn I 酶切，T4DNA 聚合酶将粘性末端补平，T4DNA连接酶连接后，使TRE-PminCMV片段中的Kpn I位点消失，转化并酶切鉴定后获得的阳性克隆称为 pShuttle-TRE-KB-PminCMV-SV40polyA，见图 2。将载体 pGEMT/rtTA2S_M2 经 EcoR I与Spe I双酶切后，经质量分数为I. 0%的琼脂糖电泳后回收得到片段rtTA2S-M2，将其与经相同酶切的载体pShuttle-TRE-KB-PminCMV-SV40polyA连接，获得的阳性克隆称为pShuttle-TRE-KB-PminCMV-rtTA2S-M2-SV40polyA，见图 2。将此载体再经过 EcoR I 酶切，补平末端，连接后，使TRE-KB-PminCMV-rtTA2S-M2之间的EcoR I位点消失，获得的阳性克隆称为 pShuttle-TRE-KB-PminCMV-EB-rtTA2S-M2-SV40polyA，见图 2。此载体即为构建过程中需要的中间载体，其上包含复合元件TRE-KB-PminCMV-EB-rtTA2S-M2。4、构建单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统将载体pGEMT/CMV经过Kpn I与Cla I双酶切，并经质量分数为I. 0%的琼脂糖电泳后回收得到的CMV片段与经相同酶切的载体pShuttle-KSL-SV40pOlyA进行连接，转化并酶切鉴定获得的阳性克隆称为pShuttle-CMV-SV40polyA。将载体pGEMT/TetR-KRAB经Cla I与Not I双酶切并经I. 0%的琼脂糖电泳后回收得到的TetR-KRAB片段与经相同酶切后的载体pShuttle-CMV-SV40polyA进行连接，转化并酶切鉴定，获得的阳性克隆称为 pShuttle-CMV-TetR-KRAB-SV40polyA。载体 pGEMT/SV40polyA 经 Not I 与 Xba I 双酶切，并经质量分数为I. 0%的琼脂糖电泳后回收得到SV40polyA片段，步骤2中获得的中间载体 pShuttle-TRE-KB-PminCMV-EB-rtTA2S-M2-SV40polyA 经 Spe I 与 Xho I 双酶切，并经质量分数为I. 0%的琼脂糖电泳后回收得到组合元件片段5’ -TRE-KB-PminCMV-EB-rtTA2S-M2-3’，载体 Shuttle-CMV-TetR-KRAB-SV40polyA 经 Not I 与 Xho I 双酶切后，同时与片段SV40polyA和片段TRE-KB-PminCMV-EB-rtTA2S_M2进行连接，连接条件是'2 μ I片段SV40polyA,2y I 片段 TRE-KB-PminCMV-EB-rtTA2S_M2，5 μ I 2ΧΤ4 连接酶缓冲液，O. 5 μ IpShuttle-CMV-TetR-KRAB-SV40polyA 载体，O. 5μ I Τ4 连接酶，25°C连接 I 小时。经转化，酶切鉴定后获得的阳性克隆称为 pShuttle-CMV-TetR-KRAB-SV40polyA-rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB-TRE-SV40polyA，此载体中复合元件 5’ -TRE-KB-PminCMV-EB-rtTA2S-M2_3’ 的连接方式为其3’端与CMV-TetR-KRAB-SV40polyA的3 ’端相连，而5’端位于载体上Xho I位点。载体pGEMT/Tight-PminCMV经Sal I与EcoR I双酶切后，经2. 0%的琼脂糖电泳后回收得到片段Tight-PminCMV，将其与经Xho I与EcoR I酶切后的载体pShuttle_CMV-TetR-KRAB-SV40polyA-rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB-TRE-SV40polyA 进行连接，转化并酶切鉴定，获得的阳性克隆为 pShuttle-CMV-TetR-KRAB-SV40polyA-rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB-TRE-Tight-PminCMV-SV40polyA,并将其命名为 pEl-K-Bi-Tet-on，见图 3，此载体上的 5_’ CMV-TetR-KRAB-SV40polyA-rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB-TRE-Tight-PminCMV-EcoRI -Spe I -SV40polyA-3’结构即为单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统，载体上的EcoR I -Spe I位点间可以插入目的基因或者DNA linker。本实施例中所构建的单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统具有双向启动结构，TRE右侧的Tight-PminCMV启动目的基因的表达，而TRE左侧的PminCMV则表达转录激活因子rtTA2S_M2，而转录激活因子rtTA2S-M2可以结合TRE序列，同时激活TRE两侧的基因表达，故rtTA2S_M2在自身启动子调控下，形成了自我激活的结构。而此结构在于当诱导药物不存在时，转录激活因子自身的表达彳艮少，除能降低目的基因非诱导时的本底渗漏外，也可以减少rtTA2S-M2对细胞的干扰。并且此系统也引入了转录沉默因子TetR-KRAB，此基因的产物蛋白，会结合TRE序列，抑制TRE两侧的基因表达，降低本底渗漏，而当加入诱导药物强力霉素后，TetR-KRAB会脱离TRE序列，解除转录抑制作用，而与此同时激活因子rtTA2S-M2会在药物作用下改变构相，并结合到TRE序列上，激活自身和目的基因的表达。且此系统结构中TRE序列位于系统中部，故消除了 TetR-KRAB具有的对TRE上下游2KB左右的转录抑制作用，故此系统应用到如腺病毒等病毒载体上时，不会影响到病毒基因组基因的转录，从而减少对腺病毒包装的影响。同时构建了载体 pShuttle-SV40polyA-rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB-TRE-Tight-PminCMV-SV40polyA,并命名为pEl-Bi-Tet-on，见图4，其构建方法与构建载体pEl-K-Bi-Tet-on类似，只是不连入CMV和TetR-KRAB这两个元件，其后的SV40polyA，TRE-KB-PminCMV-EB-rtTA2S-M2 和 Tight-PminCMV 均按上述酶切位点连入载体pShuttle-KSL-SV40polyA 中。另外，作为对照构建了 pEl-CMV-rtTA2S-M2-SV40polyA_TRE-Tight-PminCMV，另称为pEl-r-Tet-on，见图5，其结构特点为非双向启动，rtTA2S_M2由CMV启动子启动，目的基因由TRE-PminCMV启动。实施例2本实施例的表达eGFP基因的单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统，元件的连接顺序为 5-’CMV-TetR-KRAB-SV40polyA-rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB-TRE-Tight-PminCMV-EcoR I -eGFP-Spe I -SV40polyA_3’，两个酶切位点EcoR I和Spe I中插入了报告基因eGFP。
其构建方法步骤如下该实施例1-4步骤与实施例I完全相同。5、构建表达eGFP基因的单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统以载体pLVCT-tTR-KRAB为模板，聚合酶链式反应扩增eGFP基因，并在5’端引入EcoR I位点，3’端引入Spe I位点。P11-P12为一对扩增引物，Pll: CGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAG, P12: CACTAGTTTACTTGTACAGCTCGTC。产物回收后与 pGEMTeasy载体连接，获得的阳性克隆称为pGEMT/eGFP。使用EcoR I与Spe I双酶切后，回收纯化获得片段，与经相同酶切的载体pEl-K-Bi-Tet-on进行连接，获得的阳性克隆称为pEl-K-Bi-Tet-on-eGFP,此载体上的 5_’ CMV-TetR-KRAB-SV40polyA-rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB-TRE-Tight-PminCMV-EcoR I -eGFP-Spe I -SV40polyA_3’ 结构即为表达 eGFP基因的单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统。另外为作为对照，将eGFP片段连接入经EcoR I与Xba I双酶切的载体pcDNA3. I中，获得的载体称为pcDNA3. I/eGFP,连入 pEl-r-Tet-on中获得的载体称为pEl-r-Tet-on-eGFP,连入pEl-Bi-Tet-on中，获得的载体称为 pEl-Bi-Tet-on-eGFP。6、测试表达eGFP基因的单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统的诱导性能将本实施例构建的pEl-K-Bi-Tet-on-eGFP、pEl-Bi-Tet-on-eGFP、pEl-r-Tet-on-eGFP, pcDNA3. 1/eGFP、pcDNA3. I 载体转染入 HEK293 细胞。4 小时后换含有10%新生牛血清的DMEM培养基继续培养。每种质粒转染两盘细胞，并于其中一盘细胞中加入强力霉素，使其终浓度为2 μ g/ml，48小时后观察各个载体的表达强度和本底渗漏情况。使用倒置荧光显微镜照相，观察各组载体的诱导和非诱导状态下eGFP的表达情况，实验结果见图6，由图6可见，5为空载体pcDNA3. I组，此组为阴性对照组，无论是否加入诱导剂强力霉素均无绿色荧光信号；4为pcDNA3. Ι/eGFP组，此组为阳性对照组，无论是否加入强力霉素均有绿色荧光信号；3为pEl-r-Tet-on-eGFP，此单向启动结构的Tet-on系统在不加强力霉素时可见少许绿色突光 目号，提不存在本底渗漏；2为pEl-Bi-Tet-on-eGFP组,本组具有双向启动结构，本底渗漏明显少于pEl-r-Tet-on-eGFP组；I为pEl-K-Bi-Tet-on-eGFP组，即单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统组，本组只有加入了强力霉素后，才出现绿色荧光信号，说明本系统具有低的本底渗漏，而加入强力霉素其绿色荧光信号强度与阳性对照基本一致，说明本系统的诱导强度足够。实施例3本实施例的表达萤火虫萤光素酶基因(firefly luciferase, Flu)的单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统，元件的连接顺序为5-’CMV-TetR-KRAB-SV40polyA-rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB-TRE-Tight-PminCMV-EcoR I -Flu-Spe I -SV40polyA_3’，两个酶切位点EcoR I和Spe I中插入了报告基因Flu。其构建方法步骤如下该实施例1-4步骤与实施例I完全相同。5、构建表达Flu基因的单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统载体Luciferase_pcDNA3 购自 addgene 公司，以载体 Luciferase_pcDNA3 为模板，聚合酶链式反应扩增Flu基因，并在5’端引入EcoR I位点，3’端引入Spe I位点。P13-P14为一对扩增引物，P13: CGAATTCATGGAAGACGCCAAAAAC，P14: CACTAGTTTACACGGCGATCTTTCC。产物如前所述，回收后与PGEMT easy载体连接，获得的阳性克隆称为pGEMT/Flu。使用EcoRI与Spe I双酶切后，回收纯化获得片段，与经相同酶切的载体pEl-K-Bi-Tet-on进行连接，获得的阳性克隆称为pEl-K-Bi-Tet-on-Flu。此载体上的5-’CMV-TetR-KRAB_SV40polyA-rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB-TRE-Tight-PminCMV-EcoR I -Flu-Spe I -SV40polyA_3’结构即为表达Flu基因的单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统。另外为作为对照，将Flu片段连接入经EcoR I与Xba I双酶切的载体pcDNA3. I中，获得的载体称为pcDNA3. I/Flu。6、测试表达Flu基因的单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统的诱导性能接种HEK293细胞到24孔板，待细胞密度达到70%时，使用Lipofectamine 2000脂质体转染试剂盒转染细胞，分别取等摩尔数的pEl-K-Bi-Tet-on-Flu，阴性对照pcDNA3. I以及阳性对照pcDNA3. Ι/Flu质粒与海肾萤光素酶内参质粒pRL_CMV (购自Promega公司)(O. 4 μ g)共转染入HEK293细胞,每个质粒转染两组细胞，每组3个重 复，转染4小时后更换新的培养基，并于其中一组细胞中加入强力霉素，使其终浓度为2 μ g/ml ο 48小时后收集细胞,使用双萤光素酶测定试剂盒Dual-Luciferase Reporter AssaySystem(购自Promega公司)提供的方法裂解细胞，并进行标准萤光素酶活力测定。测定方法如下(I)将24孔板中的细胞培养基吸掉，每孔加入试剂盒中提供的IXlysis Buffer200mL，摇床IOOrpm下裂解10分钟。(2)收集每空裂解产物入Eppendorf管中，4°C下16000g离心10分钟，收集上清入新的预冷的Eppendorf管中。(3)使用白色96孔板，每孔加入裂解液20 μ L,每孔加入萤火虫荧光素酶底物50 μ L，进行第一次萤光素酶活力测定。(4)每孔加入lXStop&Glo反应液,终止萤火虫萤光素酶活力，并提供海肾萤光素酶反应底物，进行第二次萤光素酶活力测定。(5)得出标准突光素酶活力=萤火虫突光素酶活力值(relative light unit,RLU)/海肾萤光素酶活力值(RLU)。通过对比3种载体诱导前后的标准荧光素酶活力值，来定量反映携带单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统的载体pEl-K-Bi-Tet-on的诱导强度，本底渗漏程度，诱导倍数，结果见图7，图中6为pEl-K-Bi-Tet-on-Flu组，此组表现出明显的诱导差异，及高的诱导倍数(137倍)，而本底渗漏很小，未诱导时，表达量接近阴性对照水平，7为阳性对照，8为阴性对照组，此两组均无明显的诱导差异。说明pEl-K-Bi-Tet-on载体具有良好的诱导能力。7、测定表达Flu基因的单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统时间诱导曲线接种CH0-K1细胞到24孔板，待细胞密度达到70%时，使用Lipofectamine 2000脂质体转染试剂盒分转染细胞，实验共分12组，每组3个平行样，将载体pEl-K-Bi-Tet-on-Flu与pRL_CMV共转染入细胞，4小时后更换含有10%新生牛血清的DMEM继续培养；在每孔细胞中加入强力霉素，使其终浓度为2 μ g/ml，每4小时收集一组细胞测定标准荧光素酶活力值，将数值绘制成关于时间的曲线图，从而得到表达Flu基因的单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统的时间诱导曲线，见图8。结果可以看出40小时后系统的诱导强度达到最大，证明该系统诱导速度较快。8、测定表达Flu基因的单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统的药物剂量依赖曲线接种CHO-Kl细胞到24孔板，待细胞密度达到70%时，使用Lipofectamine 2000脂质体转染试剂盒分转染细胞，实验共分6组每组两个平行样，转染质粒pEl-K-Bi-Tet-on-Flu与pRL-CMV入HEK293细胞，4小时后更换含有10%新生牛血清的DMEM继续培养；每组分别加入强力霉素，使终浓度分别为10ng/ml，100ng/ml, 1000ng/ml,2000ng/ml,4000ng/ml,8000ng/ml,48小时后收集细胞，测定标准荧光素酶活力值，而得到表达Flu基因的单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统的药物剂量曲线，见图9。由图可以确定，该系统在2 μ g/ml的强力霉素浓度下有最大诱导强度。9、测定表达Flu基因的单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统去除诱导剂后关闭曲线
接种CH0-K1细胞到24孔板，待细胞密度达到70%时，使用Lipofectamine 2000脂质体转染试剂盒分转染细胞，实验共分6组每组三个平行样，均转染pEl-K-Bi-Tet-on-Flu与pRL_CMV入HEK293细胞，4小时后更换含有10%新生牛血清的DMEM继续培养；每组均加入强力霉素，使终浓度为2000ng/ml，72小时后更换含有10%新生牛血清的DMEM继续培养，并不再添加强力霉素，每天收集一组样品，测定标准荧光素酶活力值，从而得到表达Flu基因的单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统的去药后关闭曲线，结果见图10。图中可以看到去除诱导药物后，诱导表达系统24小时后表达量就下降为最高表达量的10%以下，证明单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统具有快速关闭的特性。实施例4本实施例的表达融合蛋白FAM76B_Flag的单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统，元件的连接顺序为 5_’ CMV-TetR-KRAB-SV40polyA-rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB-TRE-Tight-PminCMV-EcoR I -Xho I -FAM76B-Flag-SV40polyA_3’，两个酶切位点 EcoR I 和Spe I 中先后插入了 DNA linker (EcoR I -Xho I -Spe I )和报告基因 FAM76B_Flag。其构建方法步骤如下该实施例1-4步骤与实施例I完全相同。5、构建表达融合蛋白FAM76B_Flag的单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统以人cDNA文库为模板，聚合酶链式反应扩增FAM76B_Flag融合蛋白基因，并在5’端引入经Xho I位点，3’端引入Xba I位点。引物P15-P16为一对扩增引物，P15 :CTCGAGATGGCGGCCTCGGCCCTG，P16 TCTAGATTATTTGTCATCGTCATCTTTGTAATCAGGAGATGTTAGTATGCT。基因连接到pGEMT easy载体上获得的阳性克隆称为pGEMT/FAM76B-Flag，经Xho I与Xba I双酶切后纯化回收获得片段FAM76B-Flag。两条合成的DNA单链，LI: AATTCCTCGAGA，L2:CTAGTCTCGAGG，两条单链稀释成20μΜ浓度，各取20 μ I混合，室温退火两个小时，则形成 DNA linker (EcoR I -Xho I -Spe I )。载体 pEl-K-Bi-Tet-on 经 EcoR I 与Spe I双酶切后与DNA IinkeHEcoR I -Xho I -Spe I )连接，获得的阳性克隆称为pEl-K-Bi-Tet-on-ESLo 载体 pEl-K-Bi-Tet-on-ESL 经过 Xho I 与 Spe I 双酶切获得载体，与片段FAM76B-Flag连接转化后获得阳性克隆，命名为pEl-K-Bi-Tet-on-FAM76B_Flag，此载体上的 5-’CMV-TetR-KRAB-SV40polyA-rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB-TRE-Tight-PminCMV-EcoR I -Xho I -FAM76B-Flag-SV40polyA-3’的结构即为表达 FAM76B-Flag 基因的单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统。将片段FAM76B-Flag连接入经Xho I与Xba I双酶切的载体pcDNA3. I中，获得的载体称为pcDNA3. l/FAM76B_Flag。6、测定表达融合蛋白FAM76B_Flag的单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统的本底渗漏情况培养HEK293细胞于4 个60mm平板中，待细胞覆盖率达到50%时，使用磷酸钙法分别转染在实施例3步骤5中获得的质粒pEl-K-Bi-Tet-on-FAM76B-Flag、阳性对照质粒pcDNA3. 1/FAM76B-Flag以及阴性对照pcDNA3. I入HEK293细胞；每组质粒转染2盘。置3 7 °C细胞培养箱中，4小时后换含有IO %新生牛血清的DMEM继续培养；并于每组其中一盘细胞中加入强力霉素，使其终浓度为2 μ g/ml ο 48小时后收获细胞,裂解并收获蛋白，之后将6种蛋白各取适量体积的样品上样，进行SDS-PAGE电泳。半干法从凝胶中电转移蛋白样至PVDF膜上。一抗为小鼠抗Flag标签单克隆抗体，二抗为稀释辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)标记的山羊抗小鼠IgG, ECL发光检测结果见图11,图中
9、10为阴性对照pcDNA3. I组，11、12为携带单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统载体pEI-K-Bi-Tet-on-FAM76B-Flag 组，13、14 为阳性对照 pcDNA3. l/FAM76B_Flag 组，结果可以看出，在加入强力霉素时可以诱导表达载体pEl-K-Bi-Tet-on-FAM76B-Flag可以检测到FAM76B-Flag的表达，强度与阳性对照组一致，不加入强力霉素时检测不到FAM76B_Flag的表达，与阴性对照一致。Western Blot检测不到本底渗漏，果证明了该系统在非诱导时具有严密性。实施例5本实施例的表达TRAIL的单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统，元件的连接顺序为 5-，CMV-TetR-KRAB-SV40polyA-rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB-TRE-Tight-PminCMV-EcoRI -Xho I -TRAIL-Spe I -SV40polyA_3’，两个酶切位点 EcoR I 和 Spe I 之间先后插入DNAlinkerCEcoR I -Xho I -Spe I )和治疗基因TRAIL，并将表达TRAIL的单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统重组到腺病毒骨架载体上，获得带有单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统并调控表达治疗基因TRAIL的重组腺病毒。步骤1-4同实施例I。5、构建表达治疗基因TRAIL的单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统以人cDNA文库为模板，通过设计引物聚合酶链式反应扩增人Trail基因胞外段，即氨基酸序列114-281，P17-P18为一对扩增引物，P17 ACTCGAGATGGTGAGAGAAAGAGGTCCTCAG, P18 :ATCTAGATTAGCCAACTAAAAAGGCC。产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳纯化回收后，将此片段亚克隆到pGEMT easy载体中，经过酶切及测序鉴定后，将阳性克隆经Xho I和Xba I酶切消化后并纯化回收后获得的TRAIL基因片段与经Xho I和Spe I酶切的载体pEl-K-Bi-Tet-on-ESL (实施例4，步骤5中获得)进行连接，连接条件是4 μ I酶切纯化片段，5μ I 2ΧΤ4连接酶缓冲液，O. 5μ I酶切载体，O. 5μ IΤ4连接酶，25° C连接I小时。随后经过转化、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆就是携带单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统并诱导表达TRAIL的腺病毒El区穿梭载体，命名为pEl-K-Bi-Tet-on-Trail。同法将TRAIL基因片段与经Xho I和Spe I酶切的载体pShuttle-CMV-SV40polyA (实施例1，步骤4中获得)进行连接，获得的阳性克隆称为pEl-CMV-TRAIL，此载体为非诱导表达TRAIL基因的腺病毒El区穿梭载体。另外将EcoR I与Xba I酶切获得的eGFP基因片段与经EcoR I与Spe I双酶切的载体pShuttle-CMV-SV40polyA进行连接，获得的阳性克隆称为pEl-CMV_eGFP，此载体为表达eGFP的腺病毒El区穿梭载体。6、构建El区携带单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统并调控表达目的基因TRAIL的腺病毒载体采用磷酸I丐法将Pac I线性化的携带单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统调控表达目的基因TRAIL的El区穿梭载体pEl-K-Bi-Tet-on-Trail与经Pac I线性化的腺病毒骨架PAdEasy-I (购自addgene公司)按摩尔比3:1共转染HEK 293细胞系。经过7 10天后,可见明显的细胞病变(cytopathic effect, CPE),然后经过离心收获病毒原液,经过2 3轮的病毒扩增后，进一步将所获得的病毒原液感染10个150cm的细胞培养平皿，从而扩增获得足够量的病毒原液用于后续的进一步纯化。感染的病毒的细胞经过反复冻融3次(37° C水浴锅和酒精干冰中返去切换)后经3500rpm离心15分钟，通过两次氯化铯密度梯度超速离心获得纯化的El区携带单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统并调控表达 目的基因TRAIL的腺病毒载体，命名为Ad-K-Bi-Tet-on-Trail。同法将pEl-CMV-TRAIL和pEl-CMV-eGFP分别与pAdEasy-Ι重组包装获得的病毒称为Ad-CMV-TRAIL和Ad-CMV_eGFP。用微量分光光度计(Nanodrop),测样品260nm吸光值，再根据公式病毒滴度(vp/mL)=A260nmX I. I X IO120 24孔板培养HEK293至每孔细胞数约2 X IO4个，用质量分数为2%DMEM培养基将病毒液稀释成7个浓度(10' 10_4、10_5、10_6、10' 10_8、10_9)，每个浓度重复3个，每孔加入病毒稀释液400 μ L。另留不加病毒液的孔作为阴性对照。37°C下，培养箱培养5-7天，每天观察细胞，记数每孔出现CPE的个数。在病毒液稀释梯度为1X10—9条件下，计算病毒活力(IU/mL)=CPE个数X2.5X109。计算病毒的滴度/活力。在同一次测试中，病毒Ad-K-Bi-Tet-on-Trail的滴度/活力值为76vp/IU，而病毒Ad-CMV-TRAIL的滴度/活力值为220vp/IU。可以看出，在病毒载体上的Tet-on诱导表达系统可有效调控TRAIL基因表达，减少包装过程中因TRAIL基因的细胞毒性而造成的病毒活力下降。实施例6单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统在制备治疗结肠癌药物中的用途，制备El区携带单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统并调控表达目的基因TRAIL的腺病毒载体，制备治疗结肠癌药物以注射液来使用，制备该药物1000支用原料及其配比如下El区携带单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统并调控表达目的基因TRAIL的腺病毒载体2 X IO15Vp注射用水加至2000mL制备方法按药剂学注射剂的常规方法进行。每支2mL，每mL含活性成分El区携带单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统并调控表达目的基因TRAIL的腺病毒载体I X IO12Vp。使用时每日I次注射,按瘤体积计算,瘤体<3cm3，用量为2X IO12Vp病毒即I支；3cm3<瘤体<5cm3，用量为3X 1012vp病毒即I. 5支；瘤体>5cm3，用量为4X IO12Vp病毒即2支，每次多点瘤内注射。治疗一个疗程用药连续5天。用药期间同时按常规抗生素用量口服强力霉素。
为了验证本发明应用于腺病毒载体，作为治疗结肠癌药物的有益效果，发明人采用本发明实施例5中El区携带单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统并调控表达目的基因 TRAIL 的腺病毒载体 Ad-K-Bi-Tet-on-Trail (以下 Ad-K-Bi-Tet-on-Trail)，来进行体外结肠癌细胞SW480的生长抑制实验，实验情况如下取对数生长期的人结肠癌细胞SW480，O. 1%胰酶消化后接种于96孔板，每孔细胞数为2X104，每孔中分别加入5X106vp的腺病毒Ad-CMV-eGFP (阴性对照)，腺病毒Ad-CMV-TRAIL (阳性对照)，腺病毒Ad-K-Bi-Tet-on-Trail，以及PBS (空白对照)。此4组中，每组都分为两小组，其中一小组中，要加入终浓度为2μ g/ml的强力霉素，72小时后使用MTT法测定570nm处吸光值，反映各组腺病毒对人结肠癌细胞SW480的生长抑制作用，实验结果见图12。图12中15为PBS组，16为Ad-CMV-eGFP组，17为Ad-CMV-TRAIL组，18为Ad-K-Bi-Tet-on-Trail组，结果显不Ad-K-Bi-Tet-on-Trail即El区携带单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统并调控表达目的基因TRAIL的腺病毒载体，在不加入强力霉素的情况下，与空白对照和阴性对照组基本一致，没有细胞生长抑制作用，而加入强力霉素后，表现出明显的生长抑制作用，与阳性对照组接近。说明该单载体双向启动的Tet-on诱导表达 系统能成功应用于腺病毒载体，并能调控抗肿瘤基因TRAIL的表达。核苷酸或氨基酸序列表〈110〉陕西师范大学<120>单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统及其构建方法和应用<160>13<210>1<211>420<212>DNA〈213〉人工合成〈220〉<221>PolyA_signal<400>1tctagacaca gcggggagat ccagacatga taagatacat tgatgagttt ggacaaacca 60caactagaat gcagtgaaaa aaatgcttta tttgtgaaat ttgtgatgct attgctttat 120ttgtaaccat tataagctgc aataaacaag ttaacaacaa caattgcatt cattttatgt 180ttcaggttca gggggaggtg tgggaggttt tttaaagcaa gtaaaacctc tacaaatgtg 240gtatggctga ttatgatccg gctgcctcgc gcgtttcggt gatgacggtg aaaacctctg 300acacatgcag ctcccggaga cggtcacagc ttgtctgtaa gcggatgccg ggagcagaca 360agcccgtcag ggcgcgtcag cgggtgttgg cgggtgtcgg ggcgcagcca tgagagatct 420<210>2<211>44<212>DNA〈213〉人工合成〈220〉<221>mi sc_recomb
<400>2ggtaccatcg atgcggccgc ctcgaggaat tcactagtac tagt44<210>3<211>603<212>DNA〈213〉人巨细胞病毒〈220〉<221>Promoter <400>3ggtaccaata gttattaata gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag cccatatatg 60gagttccgcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc 120cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat 180tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat 240catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattat 300gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctacgt attagtcatc 360gctattacca tggtgatgcg gttttggcag tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac 420tcacggggat ttccaagtct ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt ttggcaccaa 480aatcaacggg actttccaaa atgtcgtaac aactccgccc cattgacgca aatgggcggt 540aggcgtgtac ggtgggaggt ctatataagc agagctggtt tagtgaaccg tcagatcatc 600gat603<210>4<211>1022<212>DNA〈213〉人工合成〈220〉<221>CDS<400>4atcgatatgg ctagattaga taaaagtaaa gtgattaaca gcgcattaga gctgcttaat 60gaggtcggaa tcgaaggttt aacaacccgt aaactcgccc agaagctagg tgtagagcag 120cctacattgt attggcatgt aaaaaataag cgggctttgc tcgacgcctt agccattgag 180atgttagata ggcaccatac tcacttttgc cctttagaag gggaaagctg gcaagatttt 240ttacgtaata acgctaaaag ttttagatgt gctttactaa gtcatcgcga tggagcaaaa 300gtacatttag gtacacggcc tacagaaaaa cagtatgaaa ctctcgaaaa tcaattagcc 360tttttatgcc aacaaggttt ttcactagag aatgcattat atgcactcag cgctgtgggg 420cattttactt taggttgcgt attggaagat caagagcatc aagtcgctaa agaagaaagg 480gaaacaccta ctactgatag tatgccgcca ttattacgac aagctatcga attatttgat 540caccaaggtg cagagccagc cttcttattc ggccttgaat tgatcatatg cggattagaa 600aaacaactta aatgtgaaag tgggtcgcca aaaaagaaga gaaaggtcga cggcggtggt 660gctttgtctc ctcagcactc tgctgtcact caaggaagta tcatcaagaa caaggagggc 720
权利要求
1. 一种单载体 双向启动的Tet-οη诱导表达系统,其特征在于其元件的连接顺序为5-,CMV-TetR-KRAB-SV40polyA-rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB-TRE-Tight-PminCMV-EcoR I -Spe I -SV40polyA-3’，Tight-PminCMV左侧的复合元件rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB_TRE 的连接方式为 3’ -rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB-TRE-5’ -5’ -Tight-PminCMV-3’，其余元件均按与该系统相同方向5’-3’顺序连接；两个酶切位点EcoR I和Spe I位于元件Tight-PminCMV和元件SV40polyA之间，该系统序列如下 ggtaccaata gttattaata gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag cccatatatg60gagttccgcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc120cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat180tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat240catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattat300gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctacgt attagtcatc360gctattacca tggtgatgcg gttttggcag tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac420tcacggggat ttccaagtct ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt ttggcaccaa480aatcaacggg actttccaaa atgtcgtaac aactccgccc cattgacgca aatgggcggt540aggcgtgtac ggtgggaggt ctatataagc agagctggtt tagtgaaccg tcagatcatc600gatatggcta gattagataa aagtaaagtg attaacagcg cattagagct gcttaatgag660gtcggaatcg aaggtttaac aacccgtaaa ctcgcccaga agctaggtgt agagcagcct720acattgtatt ggcatgtaaa aaataagcgg gctttgctcg acgccttagc cattgagatg780ttagataggc accatactca cttttgccct ttagaagggg aaagctggca agatttttta840cgtaataacg ctaaaagttt tagatgtgct ttactaagtc atcgcgatgg agcaaaagta900catttaggta cacggcctac agaaaaacag tatgaaactc tcgaaaatca attagccttt960ttatgccaac aaggtttttc actagagaat gcattatatg cactcagcgc tgtggggcat1020tttactttag gttgcgtatt ggaagatcaa gagcatcaag tcgctaaaga agaaagggaa1080acacctacta ctgatagtat gccgccatta ttacgacaag ctatcgaatt atttgatcac1140caaggtgcag agccagcctt cttattcggc cttgaattga tcatatgcgg attagaaaaa1200caacttaaat gtgaaagtgg gtcgccaaaa aagaagagaa aggtcgacgg cggtggtgct1260ttgtctcctc agcactctgc tgtcactcaa ggaagtatca tcaagaacaa ggagggcatg1320gatgctaagt cactaactgc ctggtcccgg acactggtga ccttcaagga tgtatttgtg1380gacttcacca gggaggagtg gaagctgctg gacactgctc agcagatcgt gtacagaaat1440gtgatgctgg agaactataa gaacctggtt tccttgggtt atcagcttac taagccagat1500gtgatcctcc ggttggagaa gggagaagag ccctggctgg tggagagaga aattcaccaa1560gagacccatc ctgattcaga gactgcattt gaaatcaaat catcagttta agcggccgcc1620acagcgggga gatccagaca tgataagata cattgatgag tttggacaaa ccacaactag1680aatgcagtga aaaaaatgct ttatttgtga aatttgtgat gctattgctt tatttgtaac1740cattataagc tgcaataaac aagttaacaa caacaattgc attcatttta tgtttcaggt1800tcagggggag gtgtgggagg ttttttaaag caagtaaaac ctctacaaat gtggtatggc1860tgattatgat ccggctgcct cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg1920cagctcccgg agacggtcac agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt1980
2.按照权利要求I所述的单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统，其特征在于所述的TRE元件左侧的PminCMV元件的方向与右侧的Tight-PminCMV启动方向相反，均与TRE元件相邻。
3.按照权利要求I所述的单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统，其特征在于在EcoR I与Spe I位点间连入的目的基因是报告基因或肿瘤治疗基因。
4.一种单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统的构建方法,其特征在于它包括下述步骤 (I)构建含有Kpn I -Cla I -Not I -Xho I -EcoR I -Spe I限制性内切酶位点的腺病毒El区穿梭载体 使用酶切连接法将 DNA IinkerCKpn I -Cla I -Not I -Xho I -EcoR I -SpeI -SpeI )连接入腺病毒El区穿梭载体，获得所需要的载体；(2)扩增构建单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统所需的元件 通过聚合酶链式反应扩增构建单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统所需的元件，元件包括 CMV、TetR-KRAB, SV40polyA、Tight-PminCMV, rtTA2S_M2 ； (3)构建带有复合元件TRE-KB-PminCMV-EB-rtTA2S-M2的中间载体 通过酶切连接,将 TRE-PminCMV 连接至 pShuttle-KSL-SV40polyA_KB，并使用 Kpn I酶切后，T4DNA聚合酶补平末端，再用T4DNA连接酶进行平末端连接，使TRE-PminCMV序列中304位的Kpn I位点消失，获得TRE-KB-PminCMV元件；再将rtTA2S_M2连接到TRE-KB-PminCMV 的 3’ 端，同样方法使 TRE-KB-PminCMV 与 rtTA2S_M2 间的 EcoR I 位点消失，得到带有复合元件 TRE-KB-PminCMV-EB-rtTA2S-M2 的中间载体 pShuttIe-TRE-KB-PminCMV-EB-rtTA2S-M2-SV40polyA ； (4)构建单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统 使用连接酶连接法，将元件5’ -CMV-3’，5’ -TetR-KRAB-3’先后连接到pShuttle-KSL-SV40polyA 上，5’ -SV40polyA_3’ 与 3’ -rtTA2S-M2-TRE-PminCMV_5’ 连接为5’ -SV40polyA-3’ -3’ -rtTA2S-M2-TRE-PminCMV_5’，并一起连接到元件 TetR-KRAB 的 3’端，再将 5’ -Tight-PminCMV-3 连接到 3’ -rtTA2S-M2-TRE-PminCMV_5’ 的 5’ 端，得单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统。
5.权利要求I单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统在制备治疗结肠癌药物中的用途。
6.按照权利要求5所述的单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统在制备治疗结肠癌药物中的用途，其特征在于单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统在制备治疗结肠癌药物中使用，有效成分制备El区携带单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统并调控表达目的基因TRAIL的腺病毒载体，制备治疗肿瘤药物用常规注射液的形式来使用。
全文摘要
一种单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统，元件的连接顺序为5-’CMV-TetR-KRAB-SV40polyA-rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB-TRE-Tight-PminCMV-EcoR Ⅰ-Spe Ⅰ-SV40polyA-3’，Tight-PminCMV左侧的复合元件rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB-TRE的连接方式为3’-rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB-TRE-5’-5’-Tight-PminCMV-3’，其余元件均按与该系统相同方向5’-3’顺序连接；两个酶切位点EcoR Ⅰ和Spe Ⅰ位于元件Tight-PminCMV和元件SV40polyA之间。
文档编号C12N15/64GK102816793SQ20121030057
公开日2012年12月12日 申请日期2012年8月22日 优先权日2012年8月22日
发明者夏海滨, 陈皓 申请人:陕西师范大学