专利名称：一种阿拉伯糖诱导的表达载体及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种阿拉伯糖诱导的表达载体及其构建方法和应用。
背景技术：
谷氨酸棒杆菌属于高GC含量的革兰氏阳性菌，具有较强的氨基酸和有机酸的合成能力，可以生产多种化学物质，是一种重要的工业微生物。通过基因工程改造的方法调节谷氨酸棒杆菌胞内的代谢网络或者通过代谢工程方法为谷氨酸棒杆菌构建新的代谢途径，可以获得具有高生产强度菌株，其可以生产各种生物物质，如泛酸，木糖醇，海藻糖和聚羟基丁酸脂等。基因工程或代谢工程的基本方法是在加强表达途径中的关键酶基因或者诱导表达新的代谢途径基因。这些基因都是在启动子的调控下表达，其表达强度和调控严 谨性依赖于启动子的元件。到目前为止，乳糖诱导表达的启动子及其衍生启动子被广泛应用于谷氨酸棒杆菌。这些启动子在诱导物存在的条件下可以迅速激活启动子的转录，然而它们在谷氨酸棒杆菌中的表达强度低于其在大肠杆菌中的表达强度，而且还有较高水平的本底表达，不能够提供严紧性的调节。研究人员已经通过突变Pt a。启动子-10区的核甘酸序列和利用强组成型表达的启动子调节阻遏蛋白的表达的方法，来提高启动子的Pta。表达水平和调节的严紧性(Journal of Microbiologly Methods, 2010,80,86-92 ;Plasmid,2010，2，85-91)。但是，由于谷氨酸棒杆菌对诱导剂的渗透能力较低，使得这些启动子的表达水平仍然相对较低。作为诱导剂的异丙基-P-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)由于价格较高而且对细胞有潜在的毒性，使其不能够被广泛的应用于工业大规模的蛋白表达或者生物材料的生产。尽管谷氨酸棒杆菌中许多的启动子的调节机制被广泛研究(Journal ofBiotechnology, 2003,104, 287-99 ；Journal of Biotechnology,2011，90，1641-1654),到目前为止，在谷氨酸棒杆菌中仍缺乏一种可以严谨性调节，高效表达，而且满足工业生产需要的表达载体。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种DNA片段。本发明提供的DNA片段，依次包括谷氨酸棒杆菌的组成型启动子Phrail、阿拉伯糖转运蛋白基因araE、调控蛋白基因araC、调控蛋白基因启动子P。、阿拉伯糖启动子PBAD。上述的DNA片段中，所述谷氨酸棒杆菌的组成型启动子P-为序列表中序列I自5’末端第5239-5369位核苷酸所示的双链DNA片段；所述阿拉伯糖转运蛋白基因araE为序列表中序列I自5’末端第5382-6800位核苷酸所示的双链DNA片段；所述调控蛋白基因araC为序列表中序列I自5’末端第6821-7699位核苷酸所示的双链DNA片段；所述调控蛋白基因启动子P。为序列表中序列I自5’末端第7850-7878位核苷酸所示的双链DNA片段；所述阿拉伯糖启动子Pbad为序列表中序列I自5’末端第7975-8002位核苷酸所示的双链DNA片段。上述的DNA片段中，所述DNA片段的核苷酸序列为序列表中的序列I自5’末端第5239-8046 位。本发明的另一个目的是提供一种表达载体。本发明提供的表达载体，为环状双链DNA分子，自5’末端至3’末端依次包括大肠杆菌ori pUC、谷氨酸棒杆菌的复制起点ori pBLl、氯霉素抗性基因cat、权利要求I或2所述的DNA片段和转录终止子rrnB。上述表达载体具体为自5’末端至3’末端依次包括大肠杆菌oripUC、谷氨酸棒杆菌的复制起点ori pBLl、氯霉素抗性基因cat、谷氨酸棒杆菌的组成型启动子Ptal、阿拉伯糖转运蛋白基因araE、调控蛋白基因araC、调控蛋白基因启动子P。、阿拉伯糖启动子Pbad和转 录终止子rrnB。上述的表达载体中，所述大肠杆菌ori pUC的核苷酸序列为序列表中序列I自5’末端第967-1539位核苷酸所示的双链DNA片段；所述谷氨酸棒杆菌的复制起点ori pBLl为序列表中序列I自5’末端第1724-4278位核苷酸所示的双链DNA片段；所述氯霉素抗性基因cat为序列表中序列I自5’末端第4410-5069位核苷酸所示的双链DNA片段；所述转录终止子rrnB为序列表中序列I自5’末端第67_492位核苷酸所示的双链DNA片段。上述的表达载体中，在所述阿拉伯糖启动子Pbad和所述转录终止子rrnB之间还包括多克隆位点，所述多克隆位点自5’末端至3’末端依次为HindIII、PstI、SalI、XbaI、BamHI、Aval、XmaI、SmaI、EcoRI。上述的表达载体的核苷酸序列为序列表中的序列I。本发明的第三个目的是提供一种制备上述表达载体的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤将序列I自5’末端第5239-8046位核苷酸插A PXMJ19的NarI和PstI酶切位点间中得到的载体。上述的表达载体在表达外源基因中的应用也是本发明保护的范围。上述应用中，所述外源基因为￠-半乳糖苷酶基因、Upp基因、绿色荧光蛋白编码基因、odhl基因；所述P -半乳糖苷酶基因的核苷酸序列为序列表中的序列2 ；所述upp基因的核苷酸序列为序列表中的序列3自5’末端第727-1362位核苷酸；所述绿色荧光蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列4 ；所述odhl基因的核苷酸序列为序列表中的序列5。upp基因编码尿嘧啶磷酸核糖转移酶，能够将5-FU转化为5-f Iuoro-UMP，5-fluoro-UMP最终被代谢为有毒的化合物5-fluoro-dUMP，5-fluoro-dUMP是胸苷酸合成酶的强烈抑制剂，因此能够产生细胞毒性，而5-FU却不会对upp基因缺失的菌株产生毒性。UPP基因在菌种遗传改造中被用为一种筛选标记。OdhI基因编码产物是酮戊二酸脱氢酶复合物的抑制蛋白，通过该蛋白抑制酮戊二酸的活性，减少酮戊二酸向三羧酸循环的流量，为谷氨酸的合成提供更多的前体物质。本发明的第四个目的是提供一种重组载体。本发明提供的重组载体，为将序列表中的序列5插入上述的表达载体的HindIII和EcoRI酶切位点间得到的载体。含有上述重组载体的重组菌也是本发明保护的范围。上述重组菌为将上述的重组载体导入谷氨酸棒杆菌ATCC13032中得到。上述重组菌在制备谷氨酸中的应用也是本发明保护的范围。
本发明的实验证明，与现有的IPTG诱导的表达载体PXMJ19相比，本发明的阿拉伯糖诱导表达载体的优点在于如下几点I、本发明中的表达载体在不添加诱导剂阿拉伯糖条件下，能够完全抑制目的基因的表达，没有渗漏或本底表达，利于有毒蛋白在谷氨酸棒杆菌中的表达；2、本发明中的表达载体对目的基因的表达水平的调控依赖于阿拉伯糖的诱导浓度，可以在0. 001% -0.4%的阿拉伯糖浓度范围内实现有效的诱导表达；3、本发明中的表达载体在谷氨酸棒杆菌中可以提供较高的目标蛋白表达，其表达水平高于目前广泛使用的Pta。启动子2倍，而且该启动子的诱导表达不受其它碳源的代谢抑制调节，因此，在以糖质为原料的发酵工程中具有很好的应用前景；4、本发明中的表达载体即使在亚饱和的阿拉伯糖诱导浓度条件下，启动子可以调节目的基因在细胞群体中的每一个细胞中进行均一性表达，不存在诱导和非诱导的混合细胞亚群体的现象。
图I为araC_PBAD基因的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳2为Ptal基因的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳3为araE基因的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳4为表达载体pWYE1088的质粒电泳5为表达载体pWYE1088的构建方法流程示意6为表达载体pWYE1088表达半乳糖苷酶活性分析7为表达载体pWYE1088与表达载体pXMJ19表达半乳糖苷酶活性的比较8为upp基因在抑制和诱导表达条件下谷氨酸棒杆菌在含有5-氟尿嘧啶平板上的生长情况图9为绿色荧光蛋白在阿拉伯糖诱导条件下细胞群体中的表达情况图10为OdhI基因在阿拉伯糖和IPTG诱导条件下谷氨酸棒杆菌产谷氨酸的发酵图
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例I、阿拉伯糖诱导表达载体pWYE1088的构建I、阿拉伯糖启动子和调控基因(araC_PBAD)的PCR扩增根据已知araC_PBAD的序列(GenBank登陆号AY048746),分别设计针对该序列片段的上游引物WZ279和下游引物WZ280，同时在引物两端引入NarI和PstI的酶切位点(其中划线部分为酶切位点)。以质粒 P KD46 (Datsenko K A, Wanner B L. One-step inactivation ofchromosomal genes in Escherichia coli K12 using PCR products. Proceedings ofthe National Academy of Sciences USA. 2000, 97:6640-6645.公众可从中国科学院微生物研究所获得)为模板，上述WZ279和WZ280为引物，扩增araC基因序列和启动子P。以及启动子Pbad序列。PCR反应体系组成如下模板I U L, IOXbuffer 10 U L, dNTP8 U L,引物 WZ2791 u L,引物 WZ280 I u L, Pyrobest Taq I y L, H2O 补至 100 y L。PCR 反应程序94°C预变性 3min, I 个循环；94°C 40s, 55°C 40s, 72°C lmin,30 个循环；72°C延伸 IOmin0 PCR 产物在1%琼脂糖凝胶电泳检测时可观察到1230bp左右的特异性条带，见图1，经过测序，该片段具有序列表中序列I自5’末端第6821-8046位核苷酸，命名为araC-PBAD序列的PCR产物。表I本发明所使用的引物
..............Si...................Si_引__翅—SMMCTCgs—(5_:—=3_:—)_
「 I WZ279 A(；TCAT(；(；C(；CCCATCOATTTATTATGACAAC (Xnrl)-
WZ280 C(；AACT(iCA(；(；CAT(；CAA(；CTTTTATAACX1'CCTTA(；{Hindi I 丨、Rsi\)
WZ291 CCATCX；ATCC；(；TT(iAAAACTAAAAACCTC.C, (( 7" I)
WZ292TTTCCTGCCATACTTTGTTTCGGCCACCC
WZ293AAACAAAGTAT(；(；CA(；GAAAAAAT(；GT
WZ294CCATCGATGGCCCGTGAAATCAGA (L'LA)
WZ231GCCCTGC/\GATG/\CCATGATT/\CG(；A (Pstl)
WlZYI(；C；( AirCC(；(；(；( AAATAC(；(；(CA(；ACA (BnA 11, SmuI)WZ739CCCAA(；CTTAT(；(iACATCACCATC(；TCAACC (Hindi 11)
WZ740COi(；A/\TTCCC(iTA/\T(；CCCTTA(；AAAC1' (HaAl I)
WZ7-11CCCAACCTTI'AAKiACiCCiACAACAACC (/"m/I I I)
WZ7-.12CC(；C；A/\TTCCT(；CA/\A(；AACTTTCCTA(； (R‘f+M I)
VZ743CCCMOgjATGAGTAAAGGAGAAGAACn (J/lm/l I i)
warn CC(；(；A/VrTCTT/VrTT(；TATA(；TTC/Vr (haMI)_2、表达载体pWYE1067的构建将araC_PBAD序列的PCR产物用酶NarI和PstI进行酶切消化，同时将pXMJ19质粒(Jakoby, M.，Ngouoto-Nkili, C.，Burkovski, A. Construction and applicationof new Corynebacterium glutamicum vectors.Biotechnology Techniques 1999，13(6) :437-441.公众可从中国科学院微生物研究所获得)同样用内切酶NarI和PstI进行酶切消化，37°C作用3h，两个反应的反应体系如下10 Xbuffer 10 u L, NarI5u L, PstI5u L, PCR产物(或pXMJ19质粒)30-50ii L，H2O补至100 yL。在T4连接酶的作用下连接消化的araC-PBAD序列的PCR产物和酶切处理的pXMJ19质粒，4°C连接过夜，反应体系如下IOX连接buffer I u L，PCR酶切回收产物5 y L，pXMJ19质粒回收产物I U L，T4DNA连接酶Iii L，H2O补至IOii L。将连接产物转化DH5a感受态细胞，挑取阳性克隆，将阳性克隆用3ml的LB液体培养基在37°C继续培养，然后提取质粒。将质粒用NarI和PstI进行酶切消化，得到1230bp左右的特异性条带的为阳性重组质粒，将该重组质粒送去测序，结果为该重组质粒为将序列表中序列I自5’末端第6821-8046位核苷酸插入PXMJ19质粒的NarI和PstI酶切位点间得到的载体，将该重组质粒命名为pWYE1067质粒。3、Phom启动子和araE基因的扩增根据已知谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组的序列(GenBank登陆号NC_003450)，分别设计针对Ptall启动子序列设计上游引物WZ291，在其5-端引入ClaI酶切位点；下游引 物 WZ292。上述WZ291和WZ292为引物，以谷氨酸棒杆菌ATCC13032(ATCC购买，ATCC Number 13032)基因组为模板扩增，得到Ptal启动子PCR产物。Ptal启动子PCR产物在I. 3%琼脂糖凝胶电泳检测时可观察到130bp左右的特异性条带，见图2。根据已知大肠杆菌W3110基因组的序列(GenBank登陆号AP009048. 1)，分别设计针对araE基因的上游引物WZ293，下游引物WZ294，在该引物5-端引入ClaI酶切位点。上述WZ293和WZ294为引物，以大肠杆菌W3110 (DSM购买，DSM No. 5911)为模板扩增，得到araE基因PCR产物。araE基因PCR产物在I %琼脂糖凝胶电泳检测时可观察到1440bp左右的特异性条带，见图3。将Pta启动子PCR产物和araE基因PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，将目的条件切下后回收。以Ptom启动子PCR产物和araE基因PCR产物的回收产物为模板，以WZ291和WZ294为扩增引物，进行重叠延伸PCR，获得1560bp左右的PhM1: :araE的融合片断，该片段为序列表中序列I自5’末端第5239-6800位核苷酸。4、表达载体pWYE1088的构建将Ptall: :araE融合片断用酶ClaI进行酶切消化，同时将pWYE1067质粒同样用内 切酶ClaI进行酶切消化，37°C作用3h，两个反应的反应体系如下10Xbuffer IOu L,ClaI5u L, Ptal: :araE 融合片断(或 pWYE1067) 30-50ii L，H2O 补至 IOOy L。线性化的 pWYE1067用碱性磷酸酶进行去磷酸化处理，反应体系为线性化的PWYE1067片段40 u L，IOXbuffer10 u L，碱性磷酸酶2U, H2O补至100 u L, 37°C处理2h。在T4连接酶的作用下连接消化的Ptal: :araE融合片断和磷酸化处理的pWYE1067质粒，4°C连接过夜，反应体系如下10X连接buffer IuL, Phom: :araE融合片断5 y L,PWYE1067质粒回收产物I U L，T4DNA连接酶I y L，H2O补至10 u L。将连接产物转化DH5 a感受态细胞，挑取阳性克隆，将阳性克隆用3ml的LB液体培养基在37°C继续培养，然后提取质粒，进行琼脂糖凝胶电泳检测(图4)。将上述质粒送去测序，该质粒为将该片段为序列表中序列I自5’末端第5239-8046位核苷酸插入pXMJ19的NarI和PstI酶切位点间得到的载体，命名为pWYE1088，即为阿拉伯糖诱导表达载体。
pffYE1088的核苷酸序列为序列表中的序列1，pffYE1088为环状双链DNA分子，自5’末端至3’末端依次包括大肠杆菌ori pUC、谷氨酸棒杆菌的复制起点ori pBLl、氯霉素抗性基因cat、谷氨酸棒杆菌的组成型启动子Ptal、阿拉伯糖转运蛋白基因araE、调控蛋白基因araC、调控蛋白基因启动子P。、阿拉伯糖启动子Pbad、多克隆位点和转录终止子rrnB ；上述大肠杆菌ori pUC的核苷酸序列为序列表中序列I自5’末端第967-1539位核苷酸所示的双链DNA片段；上述谷氨酸棒杆菌的复制起点ori pBLl为序列表中序列I自5’末端第1724-4278位核苷酸所示的双链DNA片段；上述氯霉素抗性基因cat为序列表中序列I自5’末端第4410-5069位核苷酸所示的双链DNA片段；其表达与质粒5’ -3’顺序相反；上述谷氨酸棒杆菌的组成型启动子Phran为序列表中序列I自5’末端第5239-5369 位核苷酸所示的双链DNA片段；上述阿拉伯糖转运蛋白基因araE为序列表中序列I自5’末端第5382-6800位核苷酸所示的双链DNA片段；上述调控蛋白基因araC为序列表中序列I自5’末端第6821-7699位核苷酸所示的双链DNA片段；其蛋白的表达与质粒5’ -3’顺序相反；上述调控蛋白基因启动子P。为序列表中序列I自5’末端第7850-7878位核苷酸所示的双链DNA片段；其表达与质粒5’ -3’顺序相反；上述阿拉伯糖启动子Pbad为序列表中序列I自5’末端第7975-8002位核苷酸所示的双链DNA片段；上述多克隆位点自5，末端至3，末端依次为HindIII, PstI, Sail、XbaI, BamHI、Aval、XmaI、SmaI、EcoRI的识别位点，为序列表中序列I自5’末端第6_57位核苷酸所示的双链DNA片段；上述转录终止子rrnB为序列表中序列I自5’末端第67_492位核苷酸所示的双链DNA片段。阿拉伯糖诱导表达载体pWYE1088的构建流程见图5。实施例2、阿拉伯糖诱导表达载体pWYE1088应用一、利用阿拉伯糖诱导表达载体pWYE1088表达P -半乳糖苷酶基因I、含有0 -半乳糖苷酶基因的重组质粒构建根据已知大肠杆菌的序列(GenBank登陆号AP009048. I)分别设计针对IacZ基因的上游引物WZ231和下游引物WZ232，同时在引物两端引入PstI和SmaI的酶切位点。以大肠杆菌W3110 (DSM购买，DSM No. 5911)的染色体为模板，上游引物WZ231和下游引物WZ232为引物，扩增得到3075bp的IacZ基因(P -半乳糖苷酶基因)序列，经过测序为序列2。将IacZ基因的PCR产物用PstI和SmaI酶进行酶切处理pWYE1088载体用同样的酶进行酶切处理，酶切反应体系为10 X buffer IOu L, PstI 5 u L, SmaI 5 u L, IacZ基因的PCR产物(pWYE1088载体)30-50 u L，H2O补至100 u L0在T4连接酶的作用下连接消化的IacZ基因序列的PCR产物和酶切处理的pWYE1088质粒，4°C连接过夜，反应体系如下IOX连接buffer I u L，IacZ基因的PCR酶切回收产物5 y L，pWYE1088质粒回收产物I y L,T4DNA连接酶I y L，H2O补至10 u L。将连接产物转化ATCC13032感受态细胞，鉴定阳性克隆，提取质粒，将该质粒送去测序，该质粒为将序列2插入pWYE1088载体的PstI和SmaI酶切位点得到的载体，命名为pWYE1088-lacZ ;将含有pffYE1088-lacZ 的谷氨酸棒杆菌 ATCC13032 命名为 ATCC13032/pWYE1088_lacZ。采用同样的方法将序列2插入pXMJ19的PstI和SmaI酶切位点得到的载体pXMJ19-lacZ，将含有pXMJ19-lacZ的谷氨酸棒杆菌ATCC13032命名为ATCC13032/pXMJ19-lacZ。2、P -半乳糖苷酶活性的测定P -半乳糖苷酶活性用ONPG法进行检测，具体方法如下将ATCC13032/pWYE1088_lacZ培养至OD6tltl光密度达到0. 4，加入不同浓度的阿拉伯糖进行诱导表达，诱导表达4h后收集菌体I. 5mL,然后取出0. 5mL菌液稀释10倍测定OD6tltl的光密度值。将剩余的Iml菌液10，000 Xg离心5min,弃上清,用50mMPBS buffer (pH7. 2)缓冲液洗两遍，再用 Z-buffer(40mM NaH2PO4,60mM Na2HPO4, IOmM KCl, ImM MgSO4,50mM ^ -mercaptoethanol, pH 7.0)悬浮至1ml,在冰上超声破碎,离心去除细胞碎片。取50 u L的样品加入0. 2mL的ONPG和0. 8mL的Z_buffer混匀，置于37°C反应并记录反应起始时间。待样品呈现淡黄色时，再加入ImL的IM的Na2CO3终止反应，记录反应终止时间，样品放置于，用紫外分光光度计测定OD■值，根据公式酶活Miller Unit=IOOOXOD420mi/(OD600nmXtXV) (t，反应时间；V，反应中菌液体积)，计算￠-半乳糖苷酶的活性。^ -半乳糖苷酶活的定义为每个细胞每分钟分解I U molONPG所需要的酶量。以ATCC13032/pXMJ19_lacZ菌体为对照，不同的是用浓度为摩尔浓度为0. 1,1. O、
2.0 m M的IPTG诱导，计算酶活。ATCC13032/pWYE1088-lacZ 经浓度为 2%、1%、0. 8%、0. 4%、0. 2%、0. 1%、0. 05%、0. 02%,0. 01%,0. 005%,0. 002%,0. 001% (质量百分含量)的阿拉伯糖诱导后的￠-半乳糖苷酶的活性结果如图 6 所示，浓度为 2%、1%、0. 8%、0. 4%、0. 2%、0. 1%、0. 05%,0. 02%,0. 005%、
0.002%,0. 001%的阿拉伯糖诱导后的^ -半乳糖苷酶的活性分别为651. 2,664. 2,645. 7、660. 1,449. 3,392. 3,405. 8,307. 6,263. 8,109. 3,30. 3,9. 3Miller Unit ;可以看出，IacZ基因的表达水平的调控依赖于阿拉伯糖的诱导浓度，可以在0. 001% -0. 4%的阿拉伯糖浓度范围内实现有效的诱导表达(图6)。ATCC13032/pXMJ19_lacZ菌体诱导的酶活如图7所示，用摩尔浓度为0. I、I. 0,2. 0m M 的 IPTG 诱导 ATCC13032/pXMJ19-lacZ 菌体的酶活分别为 38. 8,175. 3,204. 7MillerUnit，用摩尔浓度 0. I m M、I. 0 m M、2. 0 m M 的阿拉伯糖诱导 ATCC13032/pWYE1088_lacZ 菌体的酶活分别为 74. 6,382. 6,421. 5Miller Unit，可以看出，ATCC13032/pffYE1088-lacZ 的^ -半乳糖苷酶表达水平高于目前广泛使用的Pta。启动子(ATCC13032/pXMJ19-lacZ菌体)2倍。将ATCC13032/pWYE1088-lacZ菌分别在含有200mM葡萄糖、蔗糖、果糖、葡萄糖酸、核糖为碳源的无机盐培养基 CGX (20g(NH4)2SO4jO. 5g KH2PO4,0. 5g K2HPO4,0. 25gMgSO4 7H20，IOmg FeSO4 7H20，0mg MnSO4 H2O, Img ZnSO4 7H20，0. 2mg CuSO4, 0. 02mgNiCl2,0. 2mg生物素)中进行培养，用质量百分比浓度为0. 1%和0. 2%的阿拉伯糖诱导ATCC13032/pffYE1088-lacZ菌体的酶活结果如表2所示，可以看出，该启动子的诱导表达不、受其它碳源的抑制调节。表2不同碳源对阿拉伯糖启动子表达的影响
权利要求
1.一种DNA片段，依次包括谷氨酸棒杆菌的组成型启动子Phran、阿拉伯糖转运蛋白基因araE、调控蛋白基因araC、调控蛋白基因启动子P。、阿拉伯糖启动子PBAD。
2.根据权利要求I所述的DNA片段，其特征在于 所述谷氨酸棒杆菌的组成型启动子Ptall为序列表中序列I自5’末端第5239-5369位核苷酸所示的双链DNA片段； 所述阿拉伯糖转运蛋白基因araE为序列表中序列I自5’末端第5382-6800位核苷酸所示的双链DNA片段； 所述调控蛋白基因araC为序列表中序列I自5’末端第6821-7699位核苷酸所示的双链DNA片段； 所述调控蛋白基因启动子P。为序列表中序列I自5’末端第7850-7878位核苷酸所示的双链DNA片段； 所述阿拉伯糖启动子Pbad为序列表中序列I自5’末端第7975-8002位核苷酸所示的双链DNA片段。
3.根据权利要求I或2所述的DNA片段，其特征在于 所述DNA片段的核苷酸序列为序列表中的序列I自5’末端第5239-8046位。
4.一种表达载体，为环状双链DNA分子，自5’末端至3’末端依次包括大肠杆菌oripUC、谷氨酸棒杆菌的复制起点ori pBLl、氯霉素抗性基因cat、权利要求1_3中任一所述的DNA片段和转录终止子rrnB。
5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于 所述大肠杆菌ori pUC的核苷酸序列为序列表中序列I自5’末端第967-1539位核苷酸所示的双链DNA片段； 所述谷氨酸棒杆菌的复制起点ori pBLl为序列表中序列I自5’末端第1724-4278位核苷酸所示的双链DNA片段； 所述氯霉素抗性基因cat为序列表中序列I自5’末端第4410-5069位核苷酸所示的双链DNA片段； 所述转录终止子rrnB为序列表中序列I自5’末端第67-492位核苷酸所示的双链DNA片段。
6.根据权利要求4或5所述的表达载体,其特征在于 在所述DNA片段的阿拉伯糖启动子Pbad和所述转录终止子rrnB之间还包括多克隆位点，所述多克隆位点自5，末端至3’末端依次为HindIII、PstI、Sail、XbaI、BamHI、Aval、XmaI、SmaI、EcoRI。
7.根据权利要求4-6中任一所述的表达载体,其特征在于所述表达载体的核苷酸序列为序列表中的序列I。
8.一种制备权利要求4-7任一所述表达载体的方法，包括如下步骤将序列I自5’末端第5239-8046位核苷酸插入pXMJ19中得到的载体。
9.权利要求4-6任一所述的表达载体在表达外源基因中的应用； 所述外源基因具体为P -半乳糖苷酶基因、upp基因、绿色荧光蛋白编码基因、OdhI基因； 所述P-半乳糖苷酶基因的核苷酸序列具体为序列表中的序列2 ；所述UPP基因的核苷酸序列具体为序列表中的序列3自5’末端第727-1362位核苷酸； 所述绿色荧光蛋白编码基因的核苷酸序列具体为序列表中的序列4 ； 所述odhl基因的核苷酸序列具体为序列表中的序列5。
10.一种重组载体,为将序列表中的序列5插入权利要求4-6任一所述的表达载体中得到的载体； 或含有所述重组载体的重组菌； 或所述的重组菌在制备谷氨酸中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种阿拉伯糖诱导的表达载体及其构建方法和应用。本发明提供的一种DNA片段，依次包括谷氨酸棒杆菌的组成型启动子Phom、阿拉伯糖转运蛋白基因araE、调控蛋白基因araC、调控蛋白基因启动子Pc、阿拉伯糖启动子PBAD。本发明的实验证明，本发明的阿拉伯糖诱导表达载体可以表达外源基因，且在以糖质为原料的发酵工程中具有很好的应用前景。
文档编号C12P13/14GK102676509SQ20121013935
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月7日 优先权日2012年5月7日
发明者商秀玲, 张芸, 来书娟, 温廷益 申请人:中国科学院微生物研究所