专利名称：具有高产d-塔格糖能力的l-阿拉伯糖异构酶的突变体酶l20a及其突变方法
技术领域：
本发明涉及一种具有高产D-塔格糖能力的L-阿拉伯糖异构酶的突变体酶及其突 变方法，以及利用该突变体酶生产D-塔格糖的技术，属于生物工程、基因工程和酶工程技 术领域。
背景技术：
D-塔格糖是近年发现的一种具有特殊保健功能的功能性甜味剂。D-塔格糖属于
天然稀有糖的一种，在许多食品中都发现少量存在，如高温灭菌牛奶、奶酪、酸奶及其它奶 制品等。2000年美国食品与药物管理局(FDA)确定D-塔格糖为普遍公认安全食品(GRAS)， 并正式批准作为甜味剂用于食品饮料业以及医药制剂中；随后联合国粮农组织和世界卫生 组织的联合食品添加剂委员会第57次会议批准D-塔格糖作为食品添加剂；欧盟也于2003 年批准D-塔格糖在欧洲上市。 目前，国内对于D-塔格糖生产的研究还处于起步阶段，国外对其研究已较为深 入，方法主要有两种化学法和生物法。但目前市售的D-塔格糖都是由化学法生产的。由于 一方面化学法生产存在许多不利因素，如化学污染物多，碱性条件下异构化反应副产物多， 分离困难等；另一方面由于消费者消费观念的转变，天然食品的需求日益增长，因此近年来 对D-塔格糖生产的研究集中在生物法上。 研究发现L-阿拉伯糖异构酶(EC 5.3. 1.4，縮写为L-AI)可以催化D-半乳糖 转化为D-塔格糖，是目前生物法生产D-塔格糖最为有效的途径。但是L-AI是一种非专 一性酶，它可以分别催化L-阿拉伯糖和D-半乳糖为L-核酮糖和D-塔格糖。研究表明 L-AI催化L-阿拉伯糖的效率明显高于D-半乳糖。本发明所使用的来源于(Acidothermus cellulolytics)ATCC 43068的L_AI酶是一种高耐热性酶，具有工业应用前景。因此，进一 步提高该酶催化D-半乳糖转化生产D-塔格糖的能力将赋予其更好的应用潜能。
发明内容
本发明的 一 个目的是提供提高来源于解纤维热酸菌
(Acidothermuscellipolytics) ATCC 43068的L-AI酶产D_塔格糖能力的方案。 本发明的另一个目的是提出具有更高生产D-塔格糖能力的单突变体酶L20A，及
其构建方法。 同时本发明还提供了一种利用该单突变体酶L20A生产D-塔格糖的方法。
本发明的技术方案一种L-可拉伯糖异构酶的单突变体酶L20A，将来源于解纤维 热酸菌(Acidothe丽s eel lipolytics) ATCC 43068的L_阿拉伯糖异构酶L-AI酶(其基 因序列详见Appl Microbiol Biotechnol D0I10. 1007/s00253-009-2322-z)，进行突变所 得的单突变体酶L20A ;其为L-AI酶基因中第20位的亮氨酸Leu突变成了丙氨酸Ala，命名 为L20A ;它相比于野生型L-AI酶具有更高的产D-塔格糖的能力。
下游外侧引物
正向突变引物
反向突变引物 所述的L-阿拉伯糖异构酶的单突变体酶L20A的制备方法，根据ATCC43068的 L-AI酶基因序列，设计突变引物，对L-AI酶进行定点突变，测定DNA序列，鉴定出第20位 Leu密码子突变成Ala密码子，并将其表达于大肠杆菌中，经诱导即得L-阿拉伯糖异构酶的 单突变体酶L20A;步骤为
(1)定点突变利用重叠延伸PCR技术，以表达载体pET-22b(+)-araA为原始模版，经PCR1，PCR2 及PCR3，引入L20A突变点，定点突变的引物为
上游外侧引物5' -TATATAAGCTTTCACCACGGCCGCGATGC-3'，
:5， -TTATCCATATGACCGACCTGCCCTATCCG-3，， :5' -CAGCATGCGTACGGCGAGGACGT-3，,下划线为突变碱基， :5' -CGCCGTACGCATGCTGACTGC-3，,下划线为突变碱基，
PCR1反应体系为10XPCR buffer 5iiL，2mM dNTP 4 ii L， 10 ii M上游外侧引物 liiL，10iiM反向突变引物liiL，模版DNA liiL，5U/mL taq plus 0. 5 y L，加入双蒸水至 50ii L。 PCR2反应体系为IOXPCR buffer 5iiL，2mM dNTP 4 ii L， 10 ii M下游外侧引物 lyL，lOiiM正向突变引物liiL，模版DNA liiL，5U/mL taq plus 0. 5 y L，加入双蒸水至 50ii L。PCR1、 PCR2扩增条件为94t:预变性4min ;随后进行94。C变性lmin，56t:退火
lmin，72。C延伸lmin的35个循环；最后72。C保温10min ;PCR1、 PCR2扩增产物经琼脂糖电泳检测，割胶回收纯化； PCR3反应体系为10XPCR buffer 10iiL，2mM dNTP 8 ii L， 10 ii M上游外侧引物 1 ii L， 10 ii L下游外侧引物1 y L， PCR1纯化产物10 ii L， PCR2纯化产物10 ii L， 5U/mL taq plus lyL，加入双蒸水至100iiL;PCR3扩增条件为94t:变性lmin，56t:退火lmin，72t:延伸5min ;随后进行94°C 变性lmin，56。C退火lmin，72。C延伸lmin的35个循环；最后72。C保温10min。
(2)突变体载体质粒的构建 经琼脂糖电泳胶回收纯化后的PCR3扩增产物经限制性内切酶Ndel和HindIII消 化后连接至载体pET-22b (+)，并转化至大肠杆菌DH5 a感受态细胞中，在含50 y g/mL氨苄 青霉素的LB固体培养基培养过夜后，挑单克隆于含50 ii g/mL氨苄青霉素的LB液体培养基 培养，后提取突变质粒，将突变质粒转化至表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，突 变质粒经测序鉴定为正确的突变；
(3)突变体的表达 挑取转入表达宿主大肠杆菌BL21 (DE3)的单克隆于含50 y g/mL氨苄青霉素的LB 液体培养基中，37t:振荡培养过夜，按2%接种量接种至含50 ii g/mL氨苄青霉素的LB液体 培养基中；37t:振荡培养至0D6。。为0. 6-0. 8时，加入0. 4mM终浓度的异丙基_ P _D_硫代半 乳糖苷(IPTG)进行诱导表达，并在3(TC继续振荡培养12h后，将发酵液于4t:、1000rpm离 心10min收集菌体；
(4)单突变体酶的纯化 将步骤(3)收集的突变体菌体重悬于Tris-HCl缓冲液中，经超声波破碎后，于4t:、1000rpm离心20min去除细胞碎片，收集上清，经强阴离子交换柱Q-S印harose进行初 步纯化，随后收集活性部分再经分子筛S印hodex S200纯化，得到单突变体酶L20A的纯酶 制品。 本发明的有益效果本发明构建了一个有工业经济价值的单突变体酶L20A，实现 了 L-AI酶活力的提高，比野生型L-AI酶更有利于D-塔格糖的工业化生产。
图1野生型L-AI酶和单突变体酶L20A的D-塔格糖转化图。A表示野生型L-AI 酶；B表示单突变体酶L20A。 下游外侧引物
正向突变引物
反向突变引物
具体实施例方式
实施例1 :本例说明单突变体酶L20A的制备。
(1)定点突变 利用重叠延伸PCR技术，以表达载体pET-22b(+)-araA为原始模版，经PCR1，PCR2 及PCR3，引入L20A突变点，定点突变的引物为
上游外侧引物5' -TATATAAGCTTTCACCACGGCCGCGATGC-3'，
:5， -TTATCCATATGACCGACCTGCCCTATCCG-3，， :5' -CAGCATGCGTACGGCGAGGACGT-3，(下划线为突变碱基) :5' -CGCCGTACGCATGCTGACTGC-3，(下划线为突变碱基)
PCR1反应体系为10XPCR buffer 5iiL，2mM dNTP 4 ii L， 10 ii M上游外侧引物 liiL，10iiM反向突变引物liiL，模版DNA liiL，5U/mL taq plus 0. 5 y L，加入双蒸水至 50ii L。 PCR2反应体系为10XPCR buffer 5iiL，2mM dNTP 4 ii L， 10 ii M下游外侧引物 lyL，lOiiM正向突变引物liiL，模版DNA liiL，5U/mL taq plus 0. 5 y L，加入双蒸水至 50ii L。PCR1、 PCR2扩增条件为:94"C预变性4min ;随后进行94。C变性lmin，56。C退火
lmin，72。C延伸lmin的35个循环；最后72。C保温10min。 PCR1、 PCR2扩增产物经琼脂糖电泳检测，并通过胶回收纯化。PCR3反应体系为10XPCR buffer 10iiL，2mM dNTP 8 ii L， 10 ii M上游外侧引物
1 ii L， 10 ii L下游外侧引物1 y L， PCR1纯化产物10 ii L， PCR2纯化产物10 ii L， 5U/mL taq
plus lyL，加入双蒸水至100iiL。PCR3扩增条件为94t:变性lmin，56t:退火lmin，72t:延伸5min ;随后进行94°C 变性lmin，56。C退火lmin，72。C延伸lmin的35个循环；最后72。C保温10min。
(2)突变体载体质粒的构建 经琼脂糖电泳胶回收纯化后的PCR3扩增产物经限制性内切酶Ndel和HindIII消 化后连接至载体pET-22b (+)，并转化至大肠杆菌DH5 a感受态细胞中，在含50 y g/mL氨苄 青霉素的LB固体培养基培养过夜后，挑单克隆于含50 ii g/mL氨苄青霉素的LB液体培养基 培养，后提取突变质粒，将突变质粒转化至表达宿主大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞中，突 变质粒经测序鉴定为正确的突变。
(3)突变体的表达 挑取转入表达宿主大肠杆菌BL21 (DE3)的单克隆于含50 y g/mL氨苄青霉素的LB 液体培养基中，37t:振荡培养过夜，按2%接种量接种至含50 ii g/mL氨苄青霉素的LB液体 培养基中；37t:振荡培养至0D6。。为0. 6-0. 8时，加入0. 4mM终浓度的IPTG进行诱导表达， 并在3(TC继续振荡培养12小时后，将发酵液于4t:、1000rpm离心10min收集菌体。
(4)突变体酶的纯化 将表达的突变体菌体重悬于Tris-HCl缓冲液中，经超声波破碎后，于4 °C 、 1000rpm离心20min去除细胞碎片，收集上清，经强阴离子交换柱Q-S印harose进行初步纯 化，随后收集并浓縮活性部分再经分子筛S印hodex S200纯化，得到单突变体酶L20A的纯 酶制品，经SDS-PAGE检测为单一条带。
实施例2 :本例说明酶活分析。 1)酶活的测定方法半胱氨酸-咔唑法测定L-AI的活力取适当稀释的酶液 20iiL，加入装有980iiL预先用50mM Tris-HCL(p朋.0)配置的50mM D-半乳糖溶液中，在 75t:水浴中反应10min后，于冰上终止反应。取适当稀释的反应液50 y L，加入950 y L去 离子水，加入200iiL 1.5X的盐酸-半胱氨酸溶液，再加入6mL 75%的硫酸，混匀，然后加 入200 ii L 0. 12%的咔唑酒精溶液，立即混匀并于6(TC水浴保温10min后冰浴终止反应，在 560nm处测定吸光度。 一个酶活单位的定义为在该条件下每分钟生成1 P mol D-塔格糖所 需的酶量。 2)酶活的比较将突变体酶L20A的纯酶制品与野生型L-AI纯酶制品相比，可以 发现突变体酶L20A的产D-塔格糖的能力明显上升，其酶活为野生型的2. 2倍；而其产 L-核酮糖的能力，与野生型相比基本保持不变，说明该突变体酶L20A对催化生产D-塔格糖 的底物专一性有明显改善作用。 实施例3 :利用突变体酶L20A转化生产D-塔格糖。 在两份50mM Tris-HCl配置的终浓度为50mM的D-半乳糖溶液中，每份中分别加 入一定量的野生型L-AI酶或突变体酶L20A，使反应体系中酶活为0. 1U/mL，75t:水浴条件 下进行转化反应，分别在1、2、4、6、8、10、12、24小时取样，煮沸10min灭酶，1000rpm离心 10min，取上清后利用高效液相色谱(HPLC)测定生成的D-塔格糖含量。
HPLC进行产物分析的色谱条件为Agilent 1200 HPLC色谱仪，色谱柱Shodex NH2P-504E，Shodex RI-101示差折光检测器，流动相为65% (V/V)乙腈水溶液，柱温35°C ， 流速lmlVmin。 结果列于图1 ，突变体酶L20A与野生型L-AI相比，其催化速度显著提高，转化率提 高了8%。突变体酶L20A反应lh，其转化率达50X ;反应处，转化率即达到最高61% ;而 野生型L-AI酶反应lh，其转化率只有20%;10h以后反应才达到平衡，最高转化率为53%。
权利要求
一种L-阿拉伯糖异构酶的单突变体酶L20A，其特征在于将来源于解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolytics)ATCC 43068的L-阿拉伯糖异构酶L-AI酶，进行突变所得的单突变体酶L20A；其为L-AI酶基因中第20位的亮氨酸Leu突变成了丙氨酸Ala，命名为L20A；它相比于野生型L-AI酶具有更高的产D-塔格糖的能力。
2. 权利要求1所述的L-阿拉伯糖异构酶的单突变体酶L20A的制备方法，其特征在于 根据ATCC 43068的L_AI酶基因序列，设计突变引物，对L_AI酶进行定点突变，测定DNA序 列，鉴定出第20位Leu密码子突变成Ala密码子，并将其表达于大肠杆菌中，经诱导即得 L-阿拉伯糖异构酶的单突变体酶L20A ;步骤为(1) 定点突变利用重叠延伸PCR技术，以表达载体pET-22b(+)-araA为原始模版，经PCR1， PCR2及PCR3，引入L20A突变点，定点突变的引物为上游外侧引物5' -TATATAAGCTTTCACCACGGCCGCGATGC-3'，下游外侧引物5' -TTATCCATATGACCGACCTGCCCTATCCG-3'，正向突变引物5' -CAGCATOeeTACGGCGAGGACGT-3'，下划线为突变碱基，反向突变引物5' -CGCCGTAeeeATGCTGACTGC-3'，下划线为突变碱基，PCR1反应体系为10XPCR buffer 5iiL，2mM dNTP 4 ii L， 10 ii M上游外侧引物1 ii L，10iiM反向突变引物liiL，模版DNA liiL，5U/mL taq plus 0. 5 y L，加入双蒸水至50 y L ; PCR2反应体系为10XPCR buffer 5iiL，2mM dNTP 4 ii L， 10 ii M下游外侧引物1 ii L，10iiM正向突变引物liiL，模版DNA liiL，5U/mL taq plus 0. 5 y L，加入双蒸水至50 y L ; PCR1、PCR2扩增条件为94t:预变性4min ;随后进行94。C变性lmin， 56"退火lmin，72t:延伸lmin的35个循环；最后72"保温10min ; PCR1、PCR2扩增产物经琼脂糖电泳检测，割胶回收纯化；PCR3反应体系为:10XPCR buffer 10iiL，2mM dNTP 8 ii L， 10 ii M上游外侧引物1 ii L， 10 ii M下游外侧引物1 y L， PCR1纯化产物10 ii L， PCR2纯化产物10 ii L， 5U/mL taq plus liiL，加入双蒸水至100iiL ;PCR3扩增条件为94t:变性lmin，56t:退火lmin，72t:延伸5min ;随后进行94"C变性 lmin，56t:退火lmin，72t:延伸lmin的35个循环；最后72"C保温10min ;(2) 突变体载体质粒的构建经琼脂糖电泳胶回收纯化后的PCR3扩增产物经限制性内切酶Ndel和HindiII消化 后连接至载体pET-22b (+)，并转化至大肠杆菌DH5 a感受态细胞中，在含50 y g/mL氨苄青 霉素的LB固体培养基培养过夜后，挑单克隆于含50 ii g/mL氨苄青霉素的LB液体培养基培 养，后提取突变质粒，将突变质粒转化至表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，突变 质粒经测序鉴定为正确的突变；(3) 突变体的表达挑取转入表达宿主大肠杆菌BL21 (DE3)的单克隆于含50 y g/mL氨苄青霉素的LB液体 培养基中，37t:振荡培养过夜，按2%接种量接种至含50 ii g/mL氨苄青霉素的LB液体培养 基中；37t:振荡培养至0D6。。为0. 6-0. 8时，加入0. 4mM终浓度的异丙基_ P _D_硫代半乳糖 苷IPTG进行诱导表达，并在3(TC继续振荡培养12h后，将发酵液于4°C 、 1000rpm离心10min收集菌体；(4)单突变体酶的纯化将步骤(3)收集的突变体菌体重悬于Tris-HCl缓冲液中，经超声波破碎后，于4t:、 lOOOrpm离心20min去除细胞碎片，收集上清，经强阴离子交换柱Q-S印harose进行初步纯 化，随后收集活性部分再经分子筛S印hodex S200纯化，得到单突变体酶L20A的纯酶制品。
全文摘要
具有高产D-塔格糖能力的L-阿拉伯糖异构酶的突变体酶L20A及其突变方法，属于生物工程、基因工程和酶工程技术领域。本发明通过基因突变，将来源于解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolytics)ATCC 43068的L-阿拉伯糖异构酶(简称L-AI酶)的20位氨基酸Leu替换为Ala，获得单突变体酶L20A，它的D-塔格糖的生产能力较野生型L-AI酶有显著提高。
文档编号C12P19/02GK101768581SQ20101011233
公开日2010年7月7日 申请日期2010年2月20日 优先权日2010年2月20日
发明者江波, 沐万孟, 程丽芳 申请人:江南大学