酶解白果蛋白制备多肽类活性物质的方法

专利名称：酶解白果蛋白制备多肽类活性物质的方法
技术领域：
本发明涉及一种植物活性物提取分离技术，尤其涉及一种酶解白果蛋白制备多肽 类活性物质的方法。
背景技术：
近年，多肽蛋白质的研究进展迅速，尤其是具有生理和药物活性的天然多肽和蛋 白质，目前已有为数不少的新成分被发现，它们不仅在调节机体功能上发挥重要的作用，而 且在抗爱滋病、癌症、心脑血管等疾病上也具有活性。银杏白果不仅含有黄酮、萜内酯、多 糖、微量元素，油脂。而且含有10%以上的蛋白质。国外学者发现白果中有动力精样物质核 糖核酸酶，邓乾春等人从银杏白果中分离白果活性蛋白((Ginkgo Albumin Protein,GAP) 0 GAP是以清蛋白为主且具有显著生物活性的蛋白；谢笔钧研究了白果活性蛋白的酶法水解 及抗氧化活性、抑制肿瘤活性及其免疫功能调节作用。研究表明白果肽段较酶解前的活性 蛋白，其抗氧化活性有不同程度的提高，然而目前国内外的相关研究还极不深入，尤其是活 性蛋白的高效提取分离及其生物转化活性多肽的加工技术。植物蛋白质占世界蛋白供应总量的70%以上，其营养价值与动物蛋白质接近，且 胆固醇含量低，含有大量人体必需氨基酸，是人类食用蛋白质重要来源。但蛋白质以大分子 的形式存在，其氨基酸单体的数量大于100，其中不含各种分子量较少的小肽，因此不利于 人体吸收。植物蛋白资源扩大应用的出路在于利用生物方法或酸碱化学方法对植物蛋白进 行加工处理，以降低其分子量，同时去除抗营养因子及毒素，改善营养价值与功能特性，提 高溶解性能，使其生物效价接近动物蛋白质，代替部分动物蛋白质，达到充分利用植物蛋白 资源的目的。蛋白质水解可转化为多肽，目前主要采用酸法水解和酶法水解。酸法因水解程度 不易控制、生产条件苛刻、氨基酸受到损害而很少采用；酶法水解不损害氨基酸而大多被采 用，但酶的选择至关重要。因此，利用生物酶法降解活性蛋白，制备活性多肽及氨基酸等生 物活性物质，食入人体后，具有降低胆固醇作用，亦有利于肠道内的乳酸菌、双岐菌的生长， 具有很高营养价值与功能特性，该法被广泛运用且成为研究热点，尤其是多肽、蛋白类药物 脂质体产业化发展迅速，如Berna Biotech公司采用Virosome技术，在脂质体的磷脂双分 子层上嵌入病毒膜蛋白，制备脂质体疫苗。

发明内容
本发明提供一种高转化率的酶解白果蛋白制备多肽类活性物质的方法法，所得到 的多肽纯度高。本发明采用如下技术方案—种酶解白果蛋白制备多肽类活性物质的方法，由以下步骤组成第一步，制备脱脂白果粉将新鲜白果去壳，除衣皮，用打浆机在低于20°C的温度 下打浆成膏状，然后用非极性溶剂或超临界(X)2萃取油脂，再在-10°c --50°C冷冻干燥，得到水分的重量百分含量小于5%、破碎，过筛，得到粒度为100 200目的脱脂白果粉；第二步，酶水解脱脂白果粉将所述脱脂白果粉和去离子水按质量比为1 5 1 15混合，再向其中添加酶，酶的添加质量为所述脱脂白果粉的5% 20%，加热使混合 物温度处于30 60°C下，调节使其pH值处于7 10，搅拌反应3 48h，水解后离心分离， 收集上清液；第三步膜分离酶解液，截留分子量为3000-10000道尔顿多肽类活性物，在低于 30°C下真空浓缩得到浓缩酶解液；第四步多肽的纯化将质量百分数为50 90%的乙醇或丙酮溶液与所述浓缩酶 解液按体积比1-10 1混合搅拌，沉淀多糖类物质，离心过滤制得清液，再加入试剂，所述 试剂为三氯乙酸、丙酮、(NH4)2SO4中的任何一种或其混合物，所述试剂与所述清液体积比 1-10 1，并混合搅拌，沉淀得到多肽类活性物；第五步白果多肽粉的制备将第四步得到的所述多肽类活性物，依次用丙酮、乙 醇、甲醇洗涤得到沉淀，沉淀在-10°c --50°C冷冻干燥，得到白果多肽粉。上述技术方案中，多肽类活性物分子量为3000-10000道尔顿，多肽的质量百分含 量为50 80%，所含水分的质量百分含量低于5%，粒度100 200目；其中多肽中赖氨酸 含量大于7%，组氨酸大于8%，丝氨酸大于11%，天冬氨酸大于14%，谷氨酸大于16%。酶为活性大于80万u/g的木瓜蛋白酶，活性大于20万u/g的枯草杆菌碱性蛋白 酶，活性大于15万u/g的中性蛋白酶、活性大于100万u/g的纤维素酶、活性大于80万u/ g的果胶酶中的一种或一种以上的混合物。所述非极性溶剂为正己烷、乙醚、石油醚、6号溶剂油中任一种，与脱脂白果粉的 液固比为1-20 1，其中液体以毫升计量，固体以克计量。所述超临界CO2萃取压力为 10-30MPa,萃取温度为25-50°C，萃取时间为l_4h，所用(X)2流量为10_30L/h，并使用质量百 分比浓度为-15%石油醚作为夹带剂。本发明获得如下技术效果1.本发明采用冷冻干燥新鲜白果和超临界方法脱脂，保证白果的品质和蛋白质 及多肽不发生降解，与传统的真空热干燥、喷雾干燥相比，产品的蛋白质和多肽的含量提高 20%以上。本发明第一步打浆温度优选0-20摄氏度，过低的温度不利于提取，而过高的温 度容易导致副产物增多。第三步真空浓缩优选0-30摄氏度，过低的温度效率较低，而过高 的温度则容易导致产物不稳定。2.本发明第一步中采用CO2超临界萃取白果粉得到白果油的量和品质都比较高， 制备的白果油收率比现有技术提高20 % -35 %，尤其是白果油中不饱合脂肪酸提高到85 % 以上，其中 9，12-(18:2亚油酸占 31.876%，8-C1S:1 油酸占 20. 360%;9_C18:1 油酸占 19. 345%。3.采用不同的酶溶液低温降解、分级沉降、纳滤和冷冻干燥等工艺，白果多肽转化 率高于70%，富集多肽类活性物分子量为3000-10000道尔顿，多肽含量为50 80%，纯度 尚；4.建立白果蛋白质的酶解模型为 DH%= 599. 51725-2 . 33925XA+16. 46370XB -12. 04075XC+2. 509XAXB+6. 05250XAXC-0. 594XBXC+7. 12425XA2-0. 40213XB2-3. 35575XC2，为白果蛋白质最佳酶解工艺提供理论参数；5.本专利制备的脱脂白果多肽，不仅多肽含量为50 80%，水分< 5%，粒度100 200目，而且多肽含有17种氨基酸，包括8种人体必需的氨基酸，同时赖氨酸含量 > 7%，组氨酸> 8%，丝氨酸> 11%，天冬氨酸> 14%，谷氨酸> 16%。尤其是天冬氨酸、 谷氨酸、丝氨酸和赖氨酸的含量明显高于白果蛋白粉中氨基酸，食入人体后，更易为人体吸 收，表现为分子量为3000-10000道尔顿的小分子，而且氨基酸的组成全面，比例合理，营养
更丰富。


图1酶解PH值和温度的等高线图
图2图1对应的响应面图
图3酶解pH值和底物浓度的等高线图
图4图3对应的响应面图
图5酶解温度和底物浓度的等高线图
图6图5对应的响应面图
图717种氨基酸标准品HPLC
图8白果多肽粉氨基酸HPLC
图9超临界萃取白果油GC-MS
具体实施例方式以下实施例为本发明的一些举例，不应被看做是对本发明的限定。实施例1一种酶解白果蛋白制备多肽类活性物质的方法，由以下步骤组成第一步，制备脱脂白果粉将新鲜白果去壳，除衣皮，用打浆机在低于20°C 的温度下打浆成膏状，例如温度可以选取为19°C，18°C，14°C，10°C，8°C，6°C，5°C， 4°C，-2°C，-6°C，-8°C，然后用非极性溶剂或超临界(X)2萃取油脂，再在-10°C -50°C冷冻干 燥，例如冷冻干燥6-50小时，时间可以为20小时，40小时，红外线快速水分测定，得到水分 的重量百分含量小于5%、破碎，过筛，得到粒度为100 200目的脱脂白果粉；第二步，酶水解脱脂白果粉将所述脱脂白果粉和去离子水按质量比为1 5 1 15混合，例如可以选取为1 8，1 9,1 11,1 14，再向其中添加酶，酶的添加质 量为所述脱脂白果粉的5% 20%，例如可以选取为7%,9^,13%,15^,16%, 18%，加热 使混合物温度处于30 60°C下，例如温度可以选取为35°C，45°C，55°C，调节使其pH值处 于7 10，搅拌反应3 48h，例如可选为4小时，15小时，20小时，40小时，水解后离心分 离，收集上清液；第三步膜分离酶解液，截留分子量为3000-10000道尔顿多肽类活性物，在低于 30°C真空浓缩得到浓缩酶解液；如选为-5°C，-2°C，0°C，5°C，8°C，12°C，18°C，20°C，25°C，第四步多肽的纯化将质量百分数为50 90%的乙醇或丙酮溶液与所述浓缩酶 解液按体积比1-10 1混合搅拌，例如可以选取为2 1,4 1,7 1,9 1，沉淀多糖类 物质，离心过滤制得清液，再加入试剂，所述试剂为三氯乙酸、丙酮、(NH4)2SO4中的任何一种 或其混合物，所述试剂与所述清液体积比1-10 1，例如可以选取为2 1,4 1,8 1， 9 1，并混合搅拌，沉淀得到多肽类活性物；
第五步白果多肽粉的制备将第四步得到的所述多肽类活性物，依次 用丙酮、乙醇、甲醇洗涤得到沉淀，沉淀在-10°C --50°C冷冻干燥，例如可以选取 为-20°C，-40°C，-45°C，得到白果多肽粉。上述技术方案中，多肽类活性物分子量为3000-10000道尔顿，多肽的质量百分含 量为50 80%，所含水分的质量百分含量低于5 %，例如为3%，2%，粒度100 200目； 其中多肽中赖氨酸含量大于7%，组氨酸大于8%，丝氨酸大于11%，天冬氨酸大于14%，谷 氨酸大于16%。所述含量均为质量百分含量。上述技术方案中，酶为活性大于80万u/g的木瓜蛋白酶，例如活性为90万u/g，95 万u/g，活性大于20万u/g的枯草杆菌碱性蛋白酶，例如活性为35万u/g，例如活性为40 万u/g，活性大于15万u/g的中性蛋白酶、例如活性为20万u/g，例如活性为30万u/g，活 性大于100万u/g的纤维素酶、例如活性为120万u/g，例如活性为140万u/g，活性大于80 万u/g的果胶酶中，例如90万u/g，100万u/g，上述的一种或一种以上的混合物，如果是混 合物，可以是任意比例。所述非极性溶剂为正己烷、乙醚、石油醚、6号溶剂油中任一种，与脱脂白果粉的 液固比为1-20 1，其中液体以毫升计量，固体以克计量。所述超临界CO2萃取压力为 10-30MPa,萃取温度为25-50°C，例如35°C A0V,萃取时间为l_4h，例如选取为2小时，3小 时，所用CO2流量为10-30L/h，例如选取为20L/h，并使用质量百分比浓度为-15%石油 醚作为夹带剂，例如质量浓度为8%，12%。实施例2白果蛋白酶解制备多肽类活性物一种高效酶解白果蛋白制备多肽类活性物质的方法，包括以下步骤第一步制备 脱脂白果粉将新鲜白果100g-200g去壳，可选择100g, 120g, 150g, 180g, 200g,除衣皮，用 打浆机在于51，101，121，151，181，201下打浆成膏状，再用非极性溶剂或超临界0)2 萃取油脂、在-10°C —50°C冷冻干燥，优选-20°C —40°C，例如选取为-25°C，_30°C，_40°C， 制备脱脂白果粉，红外线快速水分测定，水分< 5% (质量百分比)，破碎，过筛，得到粒度 100 200目，蛋白质含量11. 3% (质量百分比)脱脂白果粉；第二步酶水解脱脂白果粉按脱脂白果粉和去离子水质量比为1 5 1 15混 合，酶添加量为脱脂白果粉原料的5% 20%，优选5% 8%，温度30 60°C，优选40V、 50°C，pH = 7 10，优选pH = 8和pH = 9，搅拌反应时间3 48h，优选4_8h，水解后离心 分离，收集上清液，水解度(DH% )大于70% ；第三步膜分离酶解液将第二步离心得到的酶解清液经过0. 45 μ m的纤维素膜过滤，选择分子量3，000 道尔顿、5，000道尔顿、10，000道尔顿、30，000道尔顿的聚砜膜分级分离纤维素膜的滤液， 截留分子量为3000-10000道尔顿多肽类活性物，在30°C以下真空浓缩，优选-5°C--40°C真 空冷冻至50ml-100ml ；第四步多肽的纯化将50 90%乙醇或丙酮与膜分离多肽浓缩液按体积比1-10 1混合搅拌，沉淀 多糖类物质，离心过滤，制得清液。选用TCA(三氯乙酸)、丙酮、(NH4)2SO4H种试剂任何一 种或以任意的组合方式按体积比1-10 1加入离心后的清液中混合搅拌，沉淀多肽类活性 物；
第五步白果多肽粉的制备将第四步沉淀的多肽类活性物，按固液比1 1-30 (g/ml)依次用丙酮、乙醇、甲醇 洗涤，沉淀物在-10°C --50°C冷冻干燥，得到白果多肽粉。本实施例中酶选择木瓜蛋白酶(>80万u/g)，枯草杆菌碱性蛋白酶(>20万u/ g)，中性蛋白酶(> 15万u/g)、纤维素酶(> 100万u/g)、果胶酶(>80万u/g)中的一种 或几种的任意混合物。非极性溶剂选择正己烷、乙醚、石油醚、6号溶剂油中任一种，与脱脂 白果粉的液固比(ml/g)为1-20 1。超临界CO2萃取压力10-30MPa，萃取温度25-50°C，萃 取时间l-4h，C02流量10-30L/h，l% -15%石油醚作为夹带剂，制备白果油脂中不饱合脂肪 酸> 85%。本实施例中制备多肽类活性物分子量为3000-10000道尔顿，多肽含量为75%， 水分< 5%，粒度100 200目。而且多肽含有17种氨基酸，其中天冬氨酸14. 26%，谷氨酸 16. 89%，丝氨酸11. 32%，组氨酸8. 02%，甘氨酸4. 56%，苏氨酸5. 96%，精氨酸6. 54%, 丙氨酸7. 41 %，酪氨酸2. 25 %，胱氨酸0. 21 %，缬氨酸4. 57 %，蛋氨酸1. 92 %，苯丙氨酸 1.97%，异亮氨酸2. 27%，亮氨酸3. 15%，赖氨酸7. 70%，脯氨酸1.01%。实施例3白果蛋白酶解制备多肽类活性物将IOOg白果去壳，除衣皮，用打浆机在15°C下打浆成膏状，再用正己烷等体积萃 取3-5次，除尽油脂，水层在_35°C冷冻干燥40h，干燥后破碎成粒度100 200目脱脂白果 粉，红外线快速测定，水分4. 45%，蛋白质含量11.8%。称取脱脂白果粉20g，加入去离子水100ml，添加酶活力40万u/g中性蛋白酶2g， 调节pH = 8，在温度50°C下水解证，水解后离心，收集上清液。上清液经过0. 45 μ m的纤 维素膜，滤液先经过10，000丽的聚砜膜，透过液经过3，000丽的聚砜膜，截留液-40°C冷 冻浓缩至50ml，加入250ml70%乙醇，沉淀粗多糖，离心，上清液浓缩至50ml加入体积比为 1 9的TCA(三氯乙酸)/丙酮混合液200ml中，沉淀多肽，离心，沉淀物再用丙酮洗尽水份 等杂质，不溶物在_25°C冷冻干燥制得多肽干粉。以四肽标准品为对照分析，多肽干粉中多 肽含量为70 %，其中天冬氨酸15. 6 %，谷氨酸17. 2 %，丝氨酸11.5%，组氨酸8. 7 %，甘氨 酸3. 7%，苏氨酸5. 9%，精氨酸7. 4%，丙氨酸7. 8%，酪氨酸1. 4%，缬氨酸6. 4%，异亮氨 酸2.8%，亮氨酸3.7%，赖氨酸7.8%。实施例4白果蛋白酶解制备多肽类活性物将200g白果去壳，除衣皮，用打浆机在15°C下打浆成膏状，再用乙醚等体积萃取 3-5次，除尽油脂，水层在_35°C冷冻干燥40h，干燥后破碎成粒度100 200目脱脂白果粉， 红外线快速测定，水分4. 45 %，蛋白质含量11.8%。称取脱脂白果粉30g，加入去离子水^Oml，添加酶活力120万u/g木瓜蛋白酶3g， 调节pH = 9，在温度45°C下水解6h，水解后离心，收集上清。上清液经过0. 45 μ m的纤维 素膜，滤液先经过10，000丽的聚砜膜，透过液经过3，000丽的聚砜膜，截留液-40°C冷冻 浓缩至50ml，加入250ml80%丙酮，沉淀粗多糖，离心，上清液浓缩至50ml，加入10% -15% TCA(三氯乙酸)沉淀多肽，离心，沉淀物再用丙酮洗尽水份等杂质，不溶物在_35°C冷冻干 燥制得多肽干粉。以四肽标准品为对照分析，多肽干粉中多肽含量为58%，其中天冬氨酸 15. 6%，谷氨酸17. 2%，丝氨酸11. 5%，组氨酸8. 7%，甘氨酸3. 7%，苏氨酸5. 9%，精氨酸 7. 4%，丙氨酸7. 8%，酪氨酸1. 4%，缬氨酸6. 4%，异亮氨酸2. 8%，亮氨酸3. 7%，赖氨酸 7. 8%。
实施例5白果蛋白酶解制备多肽类活性物将200g白果去壳，除衣皮，用打浆机在15°C下打浆成膏状，再用石油醚等体积萃 取3-5次，除尽油脂，水层在_35°C冷冻干燥40h，干燥后破碎成粒度100 200目白果粉， 红外线快速测定，水分4. 45%，蛋白质含量11.8%。称取脱脂白果粉30g，加入去离子水^Oml，添加酶活力25万u/g枯草杆菌碱性蛋 白酶lg，100万u/g纤维素酶lg，80万u/g果胶酶lg，调节pH = 9，在温度45°C下水解6h， 水解后离心，收集上清。上清液经过0. 45 μ m的纤维素膜，滤液先经过10，000MW的聚砜膜， 透过液经过3，000丽的聚砜膜，截留液-40°C冷冻浓缩至50ml，加入250ml80%丙酮，沉淀 粗多糖，离心，上清液浓缩至50ml，加入70 %硫酸铵溶液混合沉淀多肽，离心，沉淀物再用 丙酮洗尽水份等杂质，不溶物在_35°C冷冻干燥制得多肽干粉。以四肽标准品为对照分析， 多肽干粉中多肽含量为65 %，其中天冬氨酸15. 6 %，谷氨酸17. 2 %，丝氨酸11. 5 %，组氨 酸8. 7%，甘氨酸3. 7%，苏氨酸5. 9%，精氨酸7. 4%，丙氨酸7. 8%，酪氨酸1. 4%，缬氨酸 6. 4%，异亮氨酸2. 8%，亮氨酸3. 7%，赖氨酸7. 8%。实施例6超临界制备脱脂白果粉和白果油将300g白果去壳，除衣皮，用打浆机在15°C下打浆成膏状，在_35°C冷冻干燥40h， 干燥后破碎成粒度100目白果粉。称量白果粉100g，放入IL CO2超临界萃取罐中萃取，萃 取压力10-30MPa，萃取温度25-50°C，萃取时间l_4h，CO2流量10_30L/h，，最佳工艺条件为 温度40°C、压力20MPa、流速15L/h、时间3h，白果油得率可达7. 11%。(X)2超临界萃取后的 白果粉在_35°C冷冻干燥20h，干燥后破碎成粒度100 200目白果粉，红外线快速测定，水 分4. 45%，蛋白质含量11.8%。GC-MS分析(X)2超临界萃取的白果油化学成分表明白果油中不饱和脂肪酸总量 可达到85. 2%，其中9，12-C18:2亚油酸占32%,8-Clg:1油酸占21%;9-C18:1油酸占20%.白 果油具有以下物理特征折光指数(n40) :1. 460 1. 468 ；相对密度(d) :0. 922 0. 929 ； 碘值(I) (g/100g) 95 115 ；皂化值(KOH) (mg/g) :187 196 ；不皂化物(g/kg)彡 15。 色泽(罗维朋比色槽133. 4mm)彡黄70红4. 0 ；水分及挥发物/ )彡0. 2 ；不溶性杂质/
)彡 0. 2 ；酸值(KOH)/(mg/g) ( 4. 0 ；加热试验(280°C )。实施例7超临界制备脱脂白果粉和白果油本实施例目的是从白果粉中得到一种氨基酸组成丰富、合理的多肽，其中多肽类 活性物分子量为3000-10000道尔顿，多肽含量为50 80%，所含水分质量百分比小于 5 %，粒度100 200目。多肽含有人体8种必需氨基酸，同时赖氨酸含量> 7%，组氨酸> 8%，丝氨酸> 11%，天冬氨酸> 14%，谷氨酸> 16%。尤其是天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸和 赖氨酸的含量明显高于白果原料，为白果的深加工找到新的途径。采用的方法由以下步骤组成第一步制备脱脂白果粉将新鲜白果100g-200g去壳，除衣皮，用打浆机在低于20°C打浆成膏状，再用非极 性溶剂或超临界(X)2萃取油脂、在-10°C --50°c冷冻干燥，红外线快速测定，水分< 5%，，粒 度100 200目；第二步酶水解脱脂白果粉按脱脂白果粉和去离子水质量比为1 5 1 15混合，酶添加量为脱脂白果粉原料的5% 20%，温度30 60°C，pH = 7 10，搅拌反应时间3 48h，水解后离心分 离，收集上清液，水解度(DH% )大于70% ；第三步膜分离酶解液将第二步离心得到的酶解清液经过0. 45 μ m的纤维素膜过滤，选择分子量3，000 道尔顿、5，000道尔顿、10，000道尔顿、30，000道尔顿的聚砜膜分级分离纤维素膜的滤液， 截留分子量为3000-10000道尔顿多肽类活性物，在30°C以下真空浓缩至50ml_100ml ；第四步多肽的纯化将50 90%乙醇或丙酮与膜分离多肽浓缩液按体积比1-10 1混合搅拌，沉淀 多糖类物质，离心过滤，制得清液。选用TCA(三氯乙酸)、丙酮、(NH4)2SO4H种试剂任何一 种或以任意的组合方式按体积比1-10 1加入离心后的清液中混合搅拌，沉淀多肽类活性 物；第五步白果多肽粉的制备将第四步沉淀的多肽类活性物，按固液比1 1-30 (g/ml)依次用丙酮、乙醇、甲醇 洗涤，沉淀物在-10°c -50°c冷冻干燥，得到白果多肽粉。本发明为了保证白果的品质和蛋白质及多肽不发生降解，将含水量在50% -65% 新鲜白果脱壳和除衣皮后，采用低于20°C打浆和冷冻干燥的方法，在-10°C至一50°C冷冻 干燥，冷冻时间6-50小时，优选_15°C —40°C，冷冻时间10-40小时，含水量< 6%。如果不 采用本专利技术处理，由于新鲜白果的水份含量高于50%，在自身酶的作用下发生化学成 分的代谢，酶降解，容易发霉变质，蛋白质和油脂等营养成分破坏。白果蛋白易酶解，产生异 味，也容易霉变，影响到白果的风味。如果采用热干燥或日晒处理，白果原有的挥发性成分 容易损失，同时油脂容易产生酸败。若在190°C _220°C下喷雾干燥，得到含水量在10%左右 的粉体；由于经过高温处理，白果蛋白、多肽、酶等活性物已变性，不能保持原有蛋白和多肽 的结构。并且实验表明冷冻干燥白果粉末中蛋白质含量11.9%，大于喷雾干燥白果粉末中 蛋白质含量9.7%。由于白果内含有氰氢酸、白果酸、氢化白果酸和白果酚等脂溶性银杏毒素，容易引 起不良反应，影响人的神经系统、消化系统、皮肤系统和造血系统。因此，一些敏感体质的人 容易对银杏毒素发生过敏，食后出现各种类型的皮炎皮疹；还有人食用白果后可出现胃肠 道不适症状，如恶心、呕吐、腹痛、腹泻等情况。另外，白果含有4%-10%的油脂，其中主要 是不饱和脂肪酸，由于不饱和脂肪酸容易引起蚝败变质，同时油脂的存在影响蛋白质水解 成多肽。为了除去白果油脂，本专利在制备白果粉之前采用用非极性溶剂或超临界(X)2萃 取油脂，然后在-10°C至-50°C冷冻干燥成脱脂白果粉。本专利非极性溶剂选择正己烷、乙醚、石油醚、6号溶剂油中任一种，与脱脂白果粉 的液固比(ml/g)为1-20 1，优选10-15 1，连续萃取3_6次，剩余物在_10°C至_50°C冷 冻干燥成脱脂白果粉。本专利同时采用超临界CO2萃取油脂，超临界CO2萃取压力10-30MPa， 萃取温度25-50°C，萃取时间l_4h，CO2流量10-30L/h，1 % -15%石油醚作为夹带剂，制备白 果油脂不饱和脂肪酸含量提高到85%以上，其中9，12-(18:2亚油酸占31.876%，8-C18:1油酸 占 20. 360% ；9-C18:1 油酸占 19. 345%。如表 1。表1超临界萃取白果粉的化学组成
权利要求
1.一种酶解白果蛋白制备多肽类活性物质的方法，其特征在于由以下步骤组成第一步，制备脱脂白果粉将新鲜白果去壳，除衣皮，用打浆机在低于20°c的温度下打 浆成膏状，然后用非极性溶剂或超临界CO2萃取油脂，再在-10°C --50°C冷冻干燥，得到水 分的重量百分含量小于5%、破碎，过筛，得到粒度为100 200目的脱脂白果粉；第二步，酶水解脱脂白果粉将所述脱脂白果粉和去离子水按质量比为1 5 1 15 混合，再向其中添加酶，酶的添加质量为所述脱脂白果粉的5% 20%，加热使混合物温度 处于30 60°C下，调节使其pH值处于7 10，搅拌反应3 48h，水解后离心分离，收集上 清液；第三步膜分离酶解液，截留分子量为3000-10000道尔顿多肽类活性物，在低于30°C下 真空浓缩得到浓缩酶解液；第四步多肽的纯化将质量百分数为50 90%的乙醇或丙酮溶液与所述浓缩酶解 液按体积比1-10 1混合搅拌，沉淀多糖类物质，离心过滤制得清液，再加入试剂，所述 试剂为三氯乙酸、丙酮、(NH4)2SO4中的任何一种或其混合物，所述试剂与所述清液体积比 1-10 1，并混合搅拌，沉淀得到多肽类活性物；第五步白果多肽粉的制备将第四步得到的所述多肽类活性物，依次用丙酮、乙醇、甲 醇洗涤得到沉淀，沉淀在-10°C --50°C冷冻干燥，得到白果多肽粉。
2.根据权利要求1所述的酶解白果蛋白制备多肽类活性物质的方法，其特征在于，多 肽类活性物分子量为3000-10000道尔顿，多肽的质量百分含量为50 80%，所含水分的质 量百分含量低于5%，粒度100 200目；其中多肽中赖氨酸含量大于7%，组氨酸大于8%， 丝氨酸大于11%，天冬氨酸大于14%，谷氨酸大于16%。
3.根据权利要求1所述的酶解白果蛋白制备多肽类活性物质的方法，其特征在于，酶 为活性大于80万u/g的木瓜蛋白酶，活性大于20万u/g的枯草杆菌碱性蛋白酶，活性大于 15万u/g的中性蛋白酶、活性大于100万u/g的纤维素酶、活性大于80万u/g的果胶酶中 的一种或一种以上的混合物。
4.根据权利要求1所述的酶解白果蛋白制备多肽类活性物质的方法，其特征在 于，非极性溶剂为正己烷、乙醚、石油醚、6号溶剂油中任一种，与脱脂白果粉的液固比为 1-20 1，其中液体以毫升计量，固体以克计量。
5.根据权利要求1所述的酶解白果蛋白制备多肽类活性物质的方法，其特征在于，所 述超临界CO2萃取压力为10-30MPa，萃取温度为25_50°C，萃取时间为l_4h，所用(X)2流量 为10-30L/h，并使用质量百分比浓度为-15%石油醚作为夹带剂。
6.根据权利要求1所述的酶解白果蛋白制备多肽类活性物质的方法，其特征在于，所 述第一步打浆的温度为10°C -20°C .
7.根据权利要求1所述的酶解白果蛋白制备多肽类活性物质的方法，其特征在于，所 述第三步真空浓缩的温度为0°c -30°c。
全文摘要
本发明公开了一种白果多肽的制备方法，包括以下步骤原料去壳、去种皮后磨浆、干燥、去脂，去脂白果粉酶水解，酶解液进行膜分离，收集截留液浓缩，溶剂分级沉淀多糖和多肽，多肽沉淀物经过洗涤，冷冻干燥得到多肽干粉。多肽类活性物分子量为3000-10000道尔顿，多肽含量为50～80％，水分＜5％，粒度100～200目。多肽含有人体8种必需氨基酸，同时赖氨酸含量＞7％，组氨酸＞8％，丝氨酸＞11％，天冬氨酸＞14％，谷氨酸＞16％。尤其是天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸和赖氨酸的含量明显高于白果原料，为白果的深加工找到新的途径。此法工艺简单，环境友好，适合工业化生产。
文档编号C12P21/02GK102086465SQ20101011209
公开日2011年6月8日 申请日期2010年2月12日 优先权日2010年2月12日
发明者叶建中, 周彬, 王成章, 程耀波, 陈虹霞, 陈西娟, 马维新 申请人:中国林业科学研究院林产化学工业研究所, 邳州鑫源生物制品有限公司