专利名称：一种检测基因断裂融合的方法
技术领域：
本发明涉及一种基因发生断裂融合的检测方法，具体地，是涉及到急性髓系白血 病相关基因AMLl、RARa、MLL等断裂融合的检测方法。
背景技术：
白血病是源于造血干细胞的恶性克隆性疾病，染色体异常是白血病发生的常见原 因。染色体导致的分子事件是两个基因的断裂融合，如t (15 ；17)形成PML/RARa融合基因， t(8 ；21)导致AML1/ET0的形成。融合基因的发现有助于研究白血病发生的分子机制并寻找 特定的靶向药物。如PML/RARa导致AML-M3分子机制的阐明，使全反式维甲酸(ATRA)成 为治疗AML-M3的成功药物。其它一些染色体异常，尽管其致病机制尚未阐明，但临床实践 发现其已成为很好的独立预后指标。例如一些染色体异常如inv(16),t(16 ；16)，t(8 ；21) 的白血病患者预后较好，另一些染色体异常，包括〖(6;9)4(9;22)，如1(5(1)和del(7q)则 预后较差，而其它染色体异常(如+8、+6、-Y)和无明显遗传学异常的病例预后中等。可见 基因断裂融合是白血病发生的主要原因，特定融合基因异常在白血病的分型诊断、治疗及 预后判断方面有重要意义。但是在急性髓系白血病中，常见融合基因断裂位点存在着复杂 性及不同基因间断裂融合的多样性，而目前的多种检测手段均存在着明显的不足之处。基 因融合事件的发生通常在两个层面进行检测，一是细胞遗传学检测，即以染色体为主体的 显带技术及荧光原位杂交技术(Fluorescence In-Situ Hybridization，FISH)，国外常采 用FISH方法进行鉴定，但其对于未知染色体异常病例，常需多种探针进行筛选，成本高，周 期长，不适合常规检测。另外一个是以mRNA为主体的RT-PCR检测技术，灵敏度较好，是目前 融合基因检测的主要方法，但由于融合基因断裂位点的多样性以及“伙伴”基因的复杂性， 使得常规RT-PCR方法无法检测到全部的易位类型。如欲覆盖所有融合基因类型，又需设计 许多对引物进行多重PCR反应，这样既浪费时间又增加成本，而且难以检测到新的未知基 因的断裂融合。
发明内容
本发明旨在克服上述已有技术的不足，提供一种快速、有效的检测基因断裂融合 的方法。鉴于融合基因的多样性和复杂性以及现有检测手段的不足，经分析比较了大量已 报道的融合基因断裂位点，发现虽然AMLl、RARa和MLL等基因可以与不同的“伙伴”基因 及相同“伙伴”基因的不同断裂位点形成许多种不同的融合基因，但是它们自身的断裂位点 却是相对恒定的。例如，与AMLl相关的染色体易位AMLl基因断裂点恒定地发生在第5、6 内含子，与RARa相关的染色体易位RARa基因断裂点恒定地发生在第2内含子，与MLL相 关的染色体易位MLL基因断裂点恒定地发生在第5-9内含子之间。本发明即将这一发现作 为基础进行基因断裂融合事件的检测。本发明以AMLl基因为例介绍相关的发明内容。本发明方法是
(1)基因的恒定断裂位区域设为Breakpiont区，简称B区；恒定表达区设为 Control区，简称C区。两区相对表达量之比称为B/C比值。(2)使用引物设计软件primer5. O在AMLl基因的mRNA上的恒定断裂位点B区与 恒定表达区C区设计引物及探针。AMLl断裂融合发生在eXon5或eXon6之后，故B区引物 需分别设计在exon5和exon7内。C区应在断裂区5’侧选择，故在跨exon3和exon4区域 设计。B区和C区片段大小接近、退火温度一致，使其可在同一条件下扩增，扩增效率尽可能一致。(3)荧光定量PCR方法检测AMLl基因B区与C区扩增产物量，由两区相对表达量 之比(即B/C比值)判断是否发生融合事件。理论上，对于二倍体细胞来讲，B/C比值>0.5 且< 1. 0，认为AMLl基因发生了断裂融合，但实际上由于初发白血病细胞数量、实验操作手 法、PCR的敏感性等问题的影响，B/C比值会和理论上有所区别。经大样本统计分析，正常对 照组B/C比值位于0. 7260-1. 51之间，因此我们设B/C比值低于0. 60作为筛选标准，即B/ C比值低于0. 60视为AMLl基因发生了断裂融合。以0. 60作为筛选标准，可能会漏选一些 可疑病例，但可以优先筛选出最可疑AMLl基因发生断裂融合的病例。(4)采用 RACE (Rapid amplification of cDNA ends)方法结合克隆测序进行新的 融合基因断裂位点的鉴定。对于筛选出的可疑的基因发生断裂融合的病例，采用RACE方法结合克隆测序进 行新的融合基因断裂位点的鉴定，可寻找到新的“伙伴”基因。本发明方法适用于以AMLl基因为代表的自身断裂位点恒定于某一区域，但可以 和不同基因发生融合的这类基因的断裂融合检测。本发明采用新的引物设计思路建立一种 更加快速、有效的检测基因断裂融合的方法，克服了现有基因融合事件检测手段的缺陷，可 以最大限度地检出与此类基因相关的各种融合事件，更客观准确地服务于急性髓性白血病 的诊断、治疗及预后判断。通过本方法有望寻找到新的断裂位点及“伙伴”基因，新的断裂 位点的发现有助于阐明基因断裂融合发生的分子机制，新的“伙伴”基因的发现有助于解释 白血病发生的异质性，并筛选出新的白血病发生相关基因，进而为寻找靶向药物及实现个 体化治疗奠定理论基础。
图1为正常二倍体细胞中B区与C区表达量。图2为发生断裂融合的二倍体细胞中B区与C区表达量。图3荧光定量PCR标准曲线图。图4为荧光定量PCR检测正常对照标本的B/C比值的结果图。图5为荧光定量PCR检测AML1/ET0融合基因阳性标本的B/C比值结果图。图6为RACE实验电泳结果图。图7为目的产物克隆测序图。图1所示由于B区未发生断裂，两区表达量相同，故B区与C区拷贝数之比为 2 2，B/C比值为1。图2所示一条染色体上B区发生了断裂融合，断裂位点处无法形成扩增产物，则 故B区与C区拷贝数之比为1 2，B/C比值为0.5。
图4所示三次重复B区和C区的CT值均相近，其B/C比值平均值为1. 17，说明B 区未发生断裂融合事件。图5所示，三次重复B区明显低于C区约1个CT值，其B/C比值平均值为0. 33，比 值明显降低，说明B区发生了断裂融合事件。图6所示测序结果经Blast分析为1号染色体Ip33_p32. 1区域的PRP38A基因， 为AMLl基因的一种新的断裂融合伙伴基因。
具体实施例方式AMLl基因断裂融合的检测(1)引物和探针的设计与合成在基因文库中检索AMLl基因cDNA序列(序列号为NM_001001890)，AMLl基因有 AMLla, AMLlb, AMLlc三种mRNA，又因exon6是否缺失分为6种不同的转录本，但统计发现， 缺失eXOn6所占比例恒定约为20%，所以只针对不缺失eX0n6的转录本在断裂点即第五 内含子两端设计B区引物Bi、B2，非断裂位点即跨三、四外显子设计C区引物Cl、C2，这样 可以满足荧光定量PCR产物片段小于150bp的限制。引物及探针由上海基康生物公司合 成，去离子水溶解，浓度ΙΟμπιοΙ/L，-20°C保存。引物和探针序列及产物大小如下AML1B 区引物，正向 Bl:5' -ATGGGCCCCGAGAACCT-3 ‘，反向 B2 5 ‘ -GTGGGCTGACCCTCATGG-3 ‘， 探针5 ‘ -FCCTTTTCCGAGCGGCTCAGTGAACTP-3 ‘，AMLlC 区弓丨物，正向 Cl 5' -TTGTGAAGACAGTGATGGTCAGAGT-3‘，反向 C2:5' -GCTACCGCAGCCATGAAGAA-3‘，探针 5 ‘-FAGCTTTTCCCTCTTCCACTTCGACCGP-3‘。(2) RQ-RT-PCR 检测 B/C 比值1)总RNA的提取骨髓标本2ml，EDTA抗凝，按试剂盒Triszol说明书提取白细胞总RNA，紫外分光 光度计检测其浓度和纯度，为符合要求(A260/A280彡1.7)的标本。2)逆转录反应反应体系20 μ 1，取样品总RNAl μ g，随机引物250ng，加DEPC水至11 μ 1， 70°C 5min后立即冰浴，然后依次加入5 X逆转录反应缓冲液2. 5 μ 1，10mmol/LdNTP2. 5 μ 1， RNAsin20U，加 DEPC 水至 19 μ 1，25°C 5min 后立即冰浴，M-Mulv 逆转录酶 200U，25°C IOmin, 42°C 60min,70°C lOmin，立即将反应管冰浴，反应产物于_20°C冰箱保存，用于PCR扩增。3)标准品的制备及标准曲线的建立在AMLl基因B区、C区外侧设计一对引物，扩增1例正常对照标本的AMLl基因。将 其扩增产物克隆入PMD18-T载体，经重组质粒的转化、含重组质粒菌株的筛选和扩增、重组 质粒提取、鉴定、纯化、测序鉴定，并将其定量，根据分子量及阿佛加德罗常数(6. 023X IO23 分子数/mol)换算为分子拷贝数，最后从IOki拷贝/ μ 1开始行10倍稀释建立阳性模板梯 度。取稀释为IO6-IOltl拷贝/μ 1的AMLl正常表达阳性模板各3μ1进行荧光定量PCR反 应。为了纠正mRNA定量、RT以及PCR扩增效率差异对结果的影响，AMLlB区和C区的绝对 拷贝数之比，作为AMLl基因的相对表达量。4) PCR 反应为提高扩增产物B、C片段的可比性，反应体系除引物、探针外均混勻后对等分配，每个标本做三次重复实验。取模板cDNA9 μ 1，加入9份TaqMan Core Regeantsl2. 5 μ 1， CDNA5y 1，去离子水7. 5μ 1充分混勻后，取4份即100 μ 1分至两管中。再在这两个管中分 别加入4份B区、C区IOyM引物各0. 5μ 1，10μΜ探针1μ 1，充分混勻后平分至三个管中。 反应条件为95°C IOS ；95°C 15S，60°C 20S，扩增45个循环。5)B/C比值检测结果由于正常对照组B/C比值位于0. 7260-1. 51之间，我们设B/C比值低于0. 60作为 筛选标准，即B/C比值低于0. 60视为B区表达降低。本例B/C比值为0. 41，可认为B区发 生了新的断裂融合事件。本例临床诊断为AML-M4，AMLl-ETO融合基因为阴性，由此结果分 析该患者AMLl基因可能与ETO基因外的其它伙伴基因发生了断裂融合。(3) RACE鉴定AMLl伙伴基因1)引物设计和合成使用Primer5. 0软件在AMLl基因的mRNA序列上分别设计巢式PCR外侧及内侧引 物。RACE 鉴定实验弓 I物，外侧弓丨物 Exo3-F 5 ‘ -CAACAAGACCCTGCCCATCGCTTTC-3 ‘，内侧引 物 Ex。5-F 5 ‘ -CTGTCTTCACAAACCCACCGCAAGT-3‘。2)逆转录反应使用SMARTer RACE cDNA Amplification Kit 合成 cDNA。为保证实验的可靠性，同时设立contro 1对照与RTase-对照对照(即不添加 ReverseTranscriptase,用于检测 DNA 污染)。反应总体积为10 μ 1，首先取样品总 RNA200ng，12 μ M 3，RACE CDS Primer 1μ 1，72°C 2min，42°C 3min 反应，然后依次加入 5XFirst-Strand Buffer 2 μ 1,40U/ μ 1 RNaseInhibitor 0.25 μ 1, DTT (20mM)1 μ 1,100U/μ 1 SMARTScribe Reverse Transcriptasely l(RTase-对照用 1μ 1 Sterile H2O 替代)，加 Sterile H2O 至 10 μ 1，于 42°C 90min, 70°C IOmin 条件下反应，向上述 RT 产物中各加 20 μ 1 Tricine-EDTA Buffer, 稀释后用于PCR扩增。3) PCR 反应使用Advantage-GC 2PCR Kit，进行巢式 PCR 扩增。首轮PCR扩增用外侧引物，二次PCR扩增用外侧引物。两次扩增反应体系及条件 均相同。反应总体积为50μ 1，包括上述稀释后的RT产物2. 5μ 1，5XGC 2PCR Buffer 10 μ 1,5Μ GC Melt 5μ 1，20μΜ F primer 0· 5 μ 1，20 μ M R primer 0. 5 μ 1，50 XdNTP Mix 1 μ 1，Advantage-GC 2Polymerase Mix 1 μ 1，加去离子水至 50 μ 1。扩增条件为 94°C预变 性3分钟，94°C变性30秒，68°C退火30秒，共35个循环，最后68°C延伸6分钟。将首轮PCR 产物稀释50倍Tricine-EDTA Buffer，稀释后取5 μ 1产物用于第二次PCR扩增。扩增产物 分别取5μ 1经琼脂糖凝胶电泳分析。目的产物纯化并进行克隆测序分析。4)克隆测序分析将上述目的基因切胶、回收并纯化后进行克隆测序，测序结果经Blast分析为1号 染色体Ip33-p32. 1区域的PRP38A基因。本实施方式仅用于举例说明本发明，并不构成对本发明保护内容的限制。
权利要求
一种检测基因断裂融合的方法，其特征是(1)基因的恒定断裂位区域设为Breakpiont区，简称B区；恒定表达区设为Control区，简称C区；两区相对表达量之比称为B/C比值；(2)使用引物设计软件primer5.0在AML1基因的mRNA上的恒定断裂位点B区与恒定表达区C区设计引物及探针；AML1断裂融合发生在exon5或exon6之后，故B区引物需分别设计在exon5和exon7内；C区应在断裂区5’侧选择，故在跨exon3和exon4区域设计；B区和C区片段大小接近、退火温度一致，使其可在同一条件下扩增，扩增效率尽可能一致；(3)荧光定量PCR方法检测AML1基因B区与C区扩增产物量，由B/C比值来判断是否发生融合事件；经大样本统计分析，正常对照组B/C比值位于0.7260-1.51之间，因此设B/C比值低于0.60作为筛选标准，即B/C比值低于0.60视为AML1基因发生了断裂融合；(4)采用RACE(Rapid amplification of cDNA ends)方法结合克隆测序进行新的融合基因断裂位点的鉴定。
2.如权利要求1所述的检测基因断裂融合的方法，其特征是对于筛选出的可疑的基因 发生断裂融合的病例，采用RACE方法结合克隆测序进行新的融合基因断裂位点的鉴定，寻 找到新的“伙伴”基因。
3.如权利要求1所述的检测基因断裂融合的方法，其特征是检测对象是以AMLl基因 为代表的自身断裂位点恒定于某一区域，但可以和不同基因发生融合的这类基因的断裂融合 O
全文摘要
一种检测基因断裂融合的方法，目的是快速、有效；本发明将基因的恒定断裂位区域设为Breakpiont区，简称B区；恒定表达区设为Control区，简称C区；两区相对表达量之比称为B/C比值；使用引物设计软件primer5.0在AML1基因的mRNA上的恒定断裂位点B区与恒定表达区C区设计引物及探针；B区引物分别设计在exon5和exon7内；C区在跨exon3和exon4区域设计；采用荧光定量PCR方法检测AML1基因B区与C区扩增产物量，由B/C比值来判断是否发生融合事件；设B/C比值低于0.60作为筛选标准；采用RACE方法结合克隆测序进行新的融合基因断裂位点的鉴定。
文档编号C12Q1/68GK101886119SQ20101011136
公开日2010年11月17日 申请日期2010年2月11日 优先权日2010年2月11日
发明者徐智芳, 王宏伟, 覃艳红, 陈秀花, 齐喜玲 申请人:王宏伟