通路克隆入门载体pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*及其构建方法和应用的制作方法

专利名称：：通路克隆入门载体pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于分子生物学领域，涉及一种通路克隆(Gateway)技术的入门载体，特别是含有通路克隆技术LR重组反应所需的L4和L3序列、光诱导型启动子(PrbcS)和叶绿体基质定位序列(T*)及报告基因GFP的Gateway入门载体，本发明还涉及该入门载体的构建及应用。
背景技术：
：在农杆菌介导的遗传转化试验中使用的经典双元载体虽然也有不少含有叶绿体转移肽序列，但是由于这类载体的分子量都很大(大于IOkb)，因此通过经典的限制性酶切/连接方法把目标基因亚克隆到这些双元载体上的分子操作难度都相当大。此外还可能遇到的一些情况是双元载体上有限的多克隆酶切位点在某些目的基因中都有，因此不能直接用酶切和连接的方法构建表达载体，这样就需要用平末端连接策略，这些过程又会加大载体构建的难度和步骤，因此有时即使花了很多时间和经费也无法成功构建出目的基因的植物表达载体。Invitrogen公司根据λ噬菌体基因组和大肠杆菌基因组之间的位点专一性重组分子机制开发了一套分子克隆新技术，即通路克隆(Gateway)技术，Gateway技术的LR反应体系是根据λ噬菌体基因组从大肠杆菌的基因组中切离的机制设计出来的，利用Gateway的LR反应可以构建目的基因的表达载体。禾_限制性内切酶和连接酶构建质粒载体时需要对DNA进行切割并回收目标片断，然后用连接酶连接，这是一种费时间又费钱的工作。用Gateway技术构建质粒载体时不需要利用限制性内切酶和连接酶，它只需要把两种质粒DNA混合并加入DNA整合或切离所需要的蛋白质就能完成新质粒的构建，因此可以节省很多时间。叶片是植物的光合作用器官，在叶绿体中有很多的代谢途径，如果要对这些途径进行改造，就需要使目的蛋白表达后定位到叶绿体中，但是目前Irwitrogen公司开发的Gateway技术体系中没有植物表达载体，而比利时的VIB/Gent公司开发的所有Gateway植物表达载体都没有叶绿体的转移肽序列，因此利用这些表达载体表达的目的蛋白只能定位在细胞质中，这就极大地限制了Gateway技术在植物基因工程操作中的应用。叶绿体转基因技术也是最近发展起来的一种转基因技术，使用这种技术可以通过叶绿体的蛋白质表达体系使目的蛋白直接在叶绿体中合成，但是这种技术只在少数几种植物中获得成功，目前还不能普遍使用。1，5二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)是植物中表达量最大的蛋白质，这种蛋白质的含量占植物细胞中可溶性蛋白的40-50%。Rubisco的小亚基(rbcS)由细胞核基因编码，控制rbcS基因表达的启动子为光诱导型启动子(PrbcS)，在PrbcS的下游有将rbcS定位到叶绿体基质的信号肽序列(T)，PrbcS的表达有很强的组织特异性，需要光信号的诱导，在叶片中的表达最强(Sugitaetal.，1987，MGG，209:247-256)。在科研工作中PrbcS常被用来实现目的基因在叶片中的高水平表达和目的蛋白在叶绿体中的定位(Jangetal.，1999MolBreed5:453_461；Wongetal.，PlantMolBiol20:80_93)。在过去十年中，通过遗传工程对单个基因进行操作已经变得相当容易，然而许多重要性状及代谢途径涉及多个基因的相互作用，所以遗传工程操作技术需要从单基因发展到操作多基因。目前使用的介导多个基因进入植物基因组的方法有单基因转化株的有性杂交，连续转化，多质粒共转化，但这些方法有些成功率高的耗时很长，有些耗时短的成功率低。因此在基础和应用研究中，用现有技术导入并表达多个基因的分子操作非常困难。华南农业大学刘耀光课题组2003年开发一个能够有效进行多基因组装和转化的载体系统(Linetal.,2003,ProcNatlAcadSciUSAlOO(IO):5962_7·)，这个系统使用的植物表达载体是一个具有转化能力的人工染色体(TAC)，它由一个受体载体和两个供体载体构成。该系统用Cre-IoxP重组技术和归巢内切酶技术，通过交替使用供体载体，进行多回合的基因组装循环，最后将多个基因依次导入TAC载体。通过这种技术他们构建出一个含有十个目的基因的植物表达载体，通过农杆菌介导将这个含有多个抗性基因的载体转化进入水稻基因组。这个系统能够同时对多个基因进行操作，因而扩展了分子遗传学研究的范围及生物技术的应用。Cre-IoxP是噬菌体Pl的定位整合重组系统，Cre是一个重组酶，它专一地识别一小段含有34个碱基对的特异核苷酸序列(即IoxP位点)，并在此位点催化重组反应。无论是在原核细胞中，还是在真核细胞中，只要有IoxP位点和Cre重组酶的存在，重组反应就能发生，并且此重组反应是可逆的，既可以整合又可以切除。归巢内切酶是一类双链DNA内切酶，其识别序列较长(12-40bp)，且不对称，可能是由内含子编码。归巢内切酶的识别位点非常稀少，但它不像普通限制性内切酶那样对识别位点有严格要求，个别碱基的变化不会导致酶功能丧失，但会影响其酶切效率。但是在该系统的供体载体中没有目的基因表达所需的启动子和终止子序列，因此无法直接把目的基因插入它的供体载体中，这给它的应用造成很大的不便。Goderis等(PlantMolBiol，2002，50:17_27)用6种归巢内切酶构建了一系列(6种)的附属载体(pAUX)，利用这6种归巢内切酶在一个双元载体中构建一个多克隆位点，利用6种归巢内切酶和pAUX附属载体可以将6个目的基因的表达盒组装到一个双元载体中。后来他们又将这6种附属载体pAUX改造成一种新的模块载体(pSAT)系统，pSAT载体含有启动子和终止子及亚克隆所需的多克隆位点，因此可以直接把目的基因亚克隆于其中，并很容易实现启动子和终止子的替换。最后用6种归巢内切酶就能把6种目的基因表达盒组装到农杆菌的双元载体pPZP-RCSl或pPZP-RCS2(Tzfiraetal.2005，PlantMolBiol57:503-516)中。在pSAT载体系统中有两种载体pSAT6和PSAT6A虽然含有rbcS启动子但却没有叶绿体的转移肽序列(Chungetal.2005,TrendsPlantSci，10:357-361).。pSAT载体的分子量不大，把目的基因亚克隆于其中也不难，但是用该系统构建表达载体时最后仍然是用酶切/连接方法把PSAT中的表达盒逐个组装进双元载体pPZP-RCSl或pPZP-RCS2中，这还是个繁琐和费时的过程。基于位点特异性重组的多位点Gateway克隆系统，可以使多个DNA片段按预定的顺序，方向和框架域同时进行组装。最近，多位点Gateway技术已经在用一个通用的模式同时克隆多个DNA片段方面得到发展，在植物中，为了使得用于功能分析的目的基因表达载体的构建流程化，比利时的VIB/Gent公司开发了36个Gateway入门克隆载体的集合(Karimi等，PlantPhysiology,2007，1451183-1191)。这些Gateway入门克隆载体携带有启动子、终止子和报告基因，这种集合遵循简单的基因工程原则，遗传元件按标准的格式来设计。他们可以完全按文献的要求相互交换，并且可以根据所期望的结果随意的组合。他们还利用多个Gateway重组位点构建植物的目的表达载体，在这类载体中，两个或三个目的基因可以同时亚克隆在不同的表达盒中。携带独立Gateway表达盒的目的载体，可用于在不同的植物强启动子控制下表达两个或三个目的基因。在PK7m34G2-8m21GW3的T-DNA中，在ROLD启动子和OCS终止子之间含attRl-ccdB-attR2盒，在CaMV35S启动子和终止子之间含有attR4-ccdB-attR3盒。含有attLl_genel_attL2禾口attL4_gene2_attL3入门克隆的DNA序列可以同时被整合到这种双元载体中(Karimi等，PlantPhysiology,2007,1451183-1191)。但是在含有attL4-gene2-attL3片段的所有入门克隆载体中attL4后合适基因亚克隆的酶切位点很少，CaMV35S启动子后面也没有叶绿体的转移肽序列，所以目前还不能直接使用现有技术利用这类入门克隆载体和目的载体PK7m34G2-8m21GW3构建合适叶绿体基因工程同时又能表达两个目的基因的植物表达载体。
发明内容本发明的目的是提供一种通路克隆(Gateway)技术入门质粒载体(pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*)，该载体含有通路克隆技术LR重组反应所需的L4和L3序列、1，5二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)小亚基基因的光诱导型启动子(PrbcS)和叶绿体基质定位序列(T*)及绿色荧光蛋白(GFP)报告基因，同时提供本发明载体的构建方法和利用通路克隆技术的LR反应快速构建一个串联两个目的基因结构单元的植物表达载体，从而实现通过一次转化事件完成2个目的基因的转化操作，利用该载体中的PrbcS启动子控制目的基因的表达还可以实现目的基因在植物叶片中的高水平表达，如果在表达载体中保留叶绿体基质定位序列(T*)，所表达的目的蛋白可以定位到叶绿体基质中，如果在表达载体中去掉叶绿体基质定位序列(T*)，所表达的目的蛋白可以定位到细胞质中。为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案通路克隆入门质粒载体pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*，含有1，5二磷酸核酮糖羧化酶Rubisco小亚基基因的光诱导型启动子PrbcS和叶绿体基质定位序列T*及绿色荧光蛋白GFP报告基因。通路克隆入门质粒载体pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*，采用Gateway的入门载体PEN-L4-2-L3为基本骨架构建，用一对互补引物HindIII5和HindIII3，通过点突变技术在PEN-L4-2-L3的attL4位点下游引入HindIII位点产生入门载体pEN-L4*-2_L3；再利用另一对互补引物XhoI5和XhoI3，通过点突变技术把pEN-L4*-2-L3中attL3位点下游的多克隆位点中的PstI位点改为XhoI产生入门载体pEN-L4*-2-L3*；最后用HindIII和XhoI切开pEN-L4*-2-L3*和pENTR*-PrbcS-*T_GFP，回收pEN_L4*_2_L3*被切割后产生的载体片断pEN-L4*-L3*及pENTR*-PrbcS-*T-GFP被切割产生的PrbcS-^T-GFPDNA片段，用连接酶把pEN-L4*-L3*和PrbcS-^T-GFP连接起来产生入门质粒载pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP_L3*。通路克隆入门质粒载体pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*，由下述方法构建而成(1)利用一对互补引物HindIII5和HindIII3，通过点突变技术在入门载体PEN-L4-2-L3的attL4重组位点下游处引入HindIII产生入门载体pEN_L4*-2_L3；(2)利用一对互补引物Xho15和Xho13，通过点突变技术把入门载体pEN_L4*-2_L3中attL3重组位点下游多克隆位点中的PstI位点改为XhoI产生入门载体pEN_L4*-2_L3*；(3)用HindIII禾ΠXhoI切开pEN_L4*-2_L3*禾ΠpENTR*-PrbcS-*T_GFP，回收pEN-L4*-2-L3*被切割后产生的载体片断pEN_L4*_L3*及pENTR*-PrbcS-*T_GFP被切割产生的PrbcS-*T-GFPDNA片段，用连接酶把pEN_L4*_L3*和PrbcS_*T_GFP连接起来入门质粒载pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*。在上述通路克隆入门质粒载体pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*中，其中光诱导型启动子PrbcS是从番茄的基因组中分离出来的rbcS-3C的启动子，是一个由HindIII切割产生的1.7kb的DNA片断。上述通路克隆入门质粒载体pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*中，其中报告基因GFP来自Invitrogen公司的pGFP中的GFP。通路克隆入门质粒载体pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*的构建方法，包括下述步骤(1)利用一对互补引物HindIII5和HindIII3，通过点突变技术在入门载体PEN-L4-2-L3的attL4重组位点下游处引入HindIII产生入门载体pEN_L4*-2_L3；(2)利用一对互补引物Xho15和Xho13，通过点突变技术把入门载体pEN_L4*-2_L3中attL3重组位点下游多克隆位点中的PstI位点改为XhoI产生入门载体pEN_L4*-2_L3*；(3)用HindIII禾ΠXhoI切开pEN_L4*-2_L3*禾ΠpENTR*-PrbcS-*T_GFP，回收pEN-L4*-2-L3*被切割后产生的载体片断pEN_L4*_L3*及pENTR*-PrbcS-*T_GFP被切割产生PrbcS-*T-GFPDNA片段，用连接酶把pEN_L4*_L3*和PrbcS_*T_GFP连接起来获得入门载体pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*。本发明的通路克隆入门载体pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*在实现目的基因在转基因植物叶片中的表达的遗传工程中的应用。本发明的的通路克隆入门载体pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*在制备串联两个目的基因表达盒的植物表达载体中的应用。本发明使用的光诱导型启动子(PrbcS)是从番茄的基因组中分离出来的rbcS_3C的启动子，是一个由HindIII切割产生的1.7kb的DNA片断(Sugitaetal.,1987,MGG,209247-256)。本发明采用Gateway的入门载体pEN-L4-2_L3(图1)为基本骨架构建一个含有光诱导型启动子(PrbcS)序列的Gateway入门载体。本发明使用的报告基因GFP来自Invitrogen公司的pGFP中的GFP。为了能够把pENTR*-PrbcS-*T-GFP中的PrbcS_*T_GFP片段亚克隆于入门载体pEN-L4-2-L3的attL4和attL3位点之间，本发明利用一对互补引物HindII15和HindIII3(图1)，通过点突变技术在PEN-L4-2-L3的attL4位点下游引入HindIII位点产生入门载体pEN-L4*-2-L3。之后又利用另一对互补引物XhoI5和XhoI3(图3)，通过点突变技术把pEN-L4*-2-L3中attL3位点下游的多克隆位点中的PstI位点改为XhoI产生入门载体pEN-L4*-2-L3*；最后用HindIII和XhoI切开pEN_L4*-2_L3*和pENTR*-PrbcS-^T-GFP(pENTR*-PrbcS-*T_GFP的构建方法见本申请人的另一项专利申请，申请号为200710066422.9)，回收pEN_L4*-2_L3*被切割后产生的载体片断pEN_L4*_L3*及pENTR*-PrbcS-*T-GFP被切割产生的PrbcS-^T-GFPDNA片段，用连接酶把pEN_L4*_L3*和PrbcS-^T-GFP连接起来获得入门载体pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP_L3*。在pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP_L3*中，还含有Gateway的LR反应所需的attL3禾口attL4序列。GFP基因起始密码处有SphI酶切位点，叶绿体基质转移肽序列(*T)的起始密码处有NcoI酶切位点，因此该载体中GFP基因可以用其他目的基因替换，用目的基因替换该载体中的GFP基因，用PrbcS启动子控制目的基因在植物叶片中的高水平表达，如果在表达载体中保留叶绿体基质定位序列(Τ*)，所表达的目的蛋白可以定位到叶绿体基质中，如果在表达载体中去掉叶绿体基质定位序列(Τ*)，所表达的目的蛋白可以定位到细胞质中。图1、利用点突变技术在Gateway的入门载体pEN-L4-2_L3.O中引入HindIII位占.图2。突变质粒pEN-L4*-2-L3的检测。A电泳检测pEN_L4-2_L3.O的PCR扩增产物。1,DNAMarkerIII；2-5，pEN_L4-2_L3.O的PCR扩增产物。B突变质粒pEN_L4*-2_L3.O的电泳检测。LDNAMarkerIII;24，突变质粒pEN-L4*-2_L3·O质粒；5，正对照(未突变的pEN-L4-2-L3.O质粒)；C突变质粒pEN_L4*-2_L3.O的酶切检测。1_3，用BamHI酶切突变质粒pEN-L4*-2-L3.O；4,DNAMarkerIII；图3、利用点突变技术在突变的入门载体pEN-L4*-2_L3.O中把PstI位点改为XhoI位点；图4、突变质粒pEN-L4*-2-L3*的检测。A电泳检测pEN_L4*-2_L3.O的PCR扩增产物。1，DNAMarkerIII；2-4，pEN_L4*-2_L3.O的PCR扩增产物。B突变质粒pEN_L4*-2_L3*的电泳检测。1-4，突变质粒pEN-L4*-2-L3*质粒；5，正对照(未突变的pEN_L4*-2_L3.O质粒)；C用XhoI和HindIII双酶切检测突变质粒pEN_L4*-2_L3*。1，DNAMarkerIII；2，未突变的pEN-L4*-2-L3.O质粒；3_6，突变质粒pEN_L4*-2_L3*；图5、重组质粒pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*的构建策略；图6、重组质粒pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*的检测。A:pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*的电泳检测。1，负对照(5.8kb的质粒)；2，正对照质粒(4.7kb的质粒)；3-5，pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*质粒DNA。B用SphI和EcoRI双酶切检测重组质粒pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*。1，DNAMarkerIII；2,ADNA/HindlllDNAMarker；3-5,pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP_L3*。C用SphI和XhoI双酶切检测重组质粒pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*。1,DNAMarkerIII;2_4，pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP_L3*；图7、植物表达载体pK-35S-PrbcS-*T-GFP-PR0LD-GUS的构建策略；图8、植物表达载体pK-35S-PrbcS-*T-GFP-PR0LD-GUS的检测。A植物表达载体pK-35S-PrbcS-*T-GFP-PR0LD-GUS的电泳检测。1，正对照质粒(14.2kb的质粒)；3-4，pK-35S-PrbcS-*T-GFP-PR0LD-GUS质粒DNA;5，负对照(5.Okb的质粒)。B用NcoI酶切检测重组质粒pK-35S-PrbcS-*T-GFP-PR0LD-GUS中的GFP基因片段。1，ADNA/HindlllDNAMarker；2,DL2000DNAMarker;3，pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP_L3*;4，pK7m34GW2-8m21GW3,C用PCR扩增检测重组质粒pK-35S-PrbcS-*T-GFP-PR0LD_GUS中的⑶S基因片段。1，DL2000DNAMarker;2，正对照(以pENTR-GUS为模板的扩增产物)；3_7，以pK-35S-PrbcS-*T-GFP-PR0LD-GUS为模板的扩增产物；图9、PCR检测含有植物表达载体pK-35S-PrbcS-*T-GFP-PR0LD-GUS的农杆菌菌落中的GFP和GUS基因片段。1，DL2000DNAMarker；2-5，用pK-35S-PrbcS-*T-GFP-PR0LD_GUS转化农杆菌获得的转化子菌落。6，GFP的正对照(以pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*为模板的扩增产物)；7-10，用pK-35S-PrbcS-*T-GFP-PR0LD-GUS转化农杆菌获得的转化子菌落；11，⑶S的正对照(以pENTR*-GUS为模板的扩增产物)；图10、转基因烟草愈伤组织GFP组织的荧光观察。A野生型(WT)烟草植株；B含有pK-35S-PrbcS-*T-GFP-PR0LD-GUS的农杆菌转化烟草叶盘后产生的愈伤组织；C未转化的WT烟草叶盘产生的愈伤组织；D用pK-35S-PrbcS-*T-GFP-PR0LD-GUS转化烟草叶盘产生的愈伤组织的GFP荧光；图11、PCR检测转pK-35S-PrbcS-*T-GFP-PR0LD-GUS烟草基因组中GUS和GFP插入情况。A:转基因烟草植株中⑶S基因的检测。1，WT(负对照)；2-5，转化pK-35S-PrbcS-*T-GFP-PR0LD-GUS的4个植株系。6，⑶S的正对照(以pENTR*-⑶S为模板的扩增产物)。B转基因烟草植株中GFP基因的检测。1，GFP的正对照(以pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*为模板的扩增产物)。2,WT(负对照)；3_6，转化pK-35S-PrbcS-*T-GFP-PR0LD-GUS的4个植株；图12、RT-PCR检测转pK-35S-PrbcS-*T-GFP-PR0LD_GUS烟草GUS禾ΠGFP转录水平。A转基因烟草植株中GUS基因转录水平的检测。1，WT(负对照)；2-5，转化pK-35S-PrbcS-*T-GFP-PR0LD-GUS的4个植株系。6，GUS的正对照(以pENTR*_GUS为模板的扩增产物)。B:转基因烟草植株中GFP基因转录水平的检测。1，DNAMarkerIIIl；2,GFP的正对照(以pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*为模板的扩增产物)。3，WT(负对照)；4_7，转化pK-35S-PrbcS-*T-GFP-PR0LD-GUS的4个植株；图13、转pK-35S-PrbcS-*T-GFP-PR0LD-GUS烟草叶片的GUS染色。A:WT(负对照)叶片的GUS染色；B转化pK-35S-PrbcS-*T-GFP-PR0LD-GUS烟草叶片的GUS染色；图14、转pK-35S-PrbcS-*T-GFP-PR0LD-GUS基因烟草叶片叶绿体GFP荧光观察.A:WT(负对照)叶绿体中叶绿素的红色荧光；B，转化pK-35S-PrbcS-*T-GFP-PR0LD-GUS的叶片叶绿体中的GFP荧光。具体实施例方式下面结合附图用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明。本发明下述实施例中所用到的试剂与仪器为试剂主要为分子生物学实验试剂，其余试剂均为国产分析纯。仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器。本发明实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例1利用点突变技术在入门载体pEN-L4-2-L3中引入HindIII位点以纯化质粒pEN-L4-2-L3(购自比利时VIB/Gent公司)为模板，根据该载体中attL4位点下游的序列设计一对用于点突变的互补引物HindIII5和HindIII3(图1)，在点突变反应混合液中加入25ng的纯化质粒pEN-L4-2-L3作为模板，同时加入50ng的点突变引物HindIII5和HindIII3、lμ1dNTP(IOmM),5μ1的10XLongTaq反应Buffer和1μ1的LongTaq聚合酶(天根生化科技)，加双蒸水使反应终体积为50μ1。在PCR仪上于94°C加热3分，然后按照94°C、30秒，50°C、30秒，72°C、3分钟40秒的程序进行18个循环的反应，最后在72°C延长反应10分钟，合成含突变位点的子链(图2A)。反应完成后把反应混合液置于冰上冷却2分钟，向反应混合液加入1μ1的限制性内切酶DpnI(10U/μ1)和8μ1的DpnI反应缓冲液，于37°C保温2小时，降解不含突变位点的母链。用反应混合液转化高效率(108)的大肠杆菌感受态细胞(DH5α，天根生化科技)，把转化好的大肠杆菌涂于加有卡那霉素(Km，50yg/ml)的平板上，筛选Km抗性重组子菌落，从Km抗性重组子菌落中提取质粒(图2B)，用HindIII(Fermentas)进行酶切检测，突变成功的质粒可被HindIII切开并在琼脂糖凝胶电泳图上产生一条3.7kb的条带(图2C)，选出突变成功的质粒载体pEN-L4*-2-L3，重新转化大肠杆菌DH5α，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒。实施例2利用点突变技术把入门载体pEN-L4*-2_L3的attL3下游多克隆位点中的PstI改变为XhoI以质粒pEN-L4*-2_L3为模板，根据PstI位点附近的序列设计一对(Xho15和XhoI3)用于点突变的互补引物(图3)，委托上海生工合成。在点突变反应混合液中加入25ng的纯化质粒pEN-L4*-2-L3作为模板，同时加入50ng的点突变引物XhoI5和XhoI3、1μIdNTP(IOmM)，5μ1的10XLongTaq反应Buffer和1μ1的LongTaq聚合酶(天根生化科技)，加双蒸水使反应终体积为50μ1。在PCR仪上于94°C加热3分，然后按照94°C、30秒，60°C、30秒，72°C、4分钟的程序进行18个循环的反应，最后在72°C延长反应10分钟，合成含突变位点的子链(图4A)。反应完成后把反应混合液置于冰上冷却2分钟，向反应混合液加入1μ1的限制性内切酶DpnI(10U/μ1)和4μ1的DpnI反应缓冲液(Fermentas)，于37°C保温2小时，降解不含突变位点的母链。用反应混合液转化高效率(108)的大肠杆菌感受态细胞(DH5α，天根生化科技)，把转化好的大肠杆菌涂于加有卡那霉素(Km，50μg/ml)的平板上，筛选Km抗性重组子菌落，从Km抗性重组子菌落中提取质粒(图4B)，用HindIII和XhoI(Fermentas)进行双酶切检测，突变成功的质粒可被HindIII和XhoI切开并在琼脂糖凝胶电泳图上产生二条分子量分别为2.6kb和1.kb的条带(图4C)，选出突变成功的质粒载体突变质粒pEN-L4*-2-L3*，重新转化大肠杆菌DH5α，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒。实施例3入门载体pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*的构建用HindIII和XhoI切开pEN_L4*-2_L3*和pENTR*-PrbcS-*T_GFP(pENTR*_PrbcS-*T-GFP的构建方法见本申请人的另一项专利申请，申请号为200710066422.9)，通过琼脂糖凝胶电泳分离已切开的载体和插入片段，回收pEN-L4*-2-L3*被切割后产生的载体片断pEN-L4*-L3*(2.6kb)及pENTR*-PrbcS-*T_GFP被切割产生PrbcS-^T-GFPDNA片段(2.4kb)，然后用宝生物(TaKaRa)的连接酶试剂盒把pEN_L4*_L3*和PrbcS_*T_GFP连接起来获得入门载体pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*(图5)。用连接反应混合物转化高效率(108)的大肠杆菌感受态细胞(DH5α，天根生化科技)，把转化好的大肠杆菌涂于加有卡那霉素(Kan,50μg/ml)的平板上，于37°C过夜培养，筛选Km抗性重组子菌落，从Km抗性重组子菌落中提取质粒(图6A)，用SphI和EcoRI双酶切检测，连接成功的质粒在琼脂糖凝胶电泳图上产生两条带，一条为4.3kb的载体条带，另一条为0.7kb的GFP基因片段。之后又用SphI和XhoI双酶切检测，结果相似，连接成功的质粒在琼脂糖凝胶电泳图上也产生两条带，一条为4.3kb的载体条带，另一条为0.7kb的GFP基因片段。选出连接成功的质粒载体pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*，重新转化大肠杆菌DH5α，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒。实施例4=GFP和⑶S基因表达盒串联植物表达载体的构建通过Gateway的LR反应把入门载体pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP_L3*中PrbcS-^T-GFP片段和pENTR-GUS(购自Invitrogen)中的⑶S基因片段同时亚克隆到植物表达载体pK7m34GW2-8m21GW3(Gateway的目的载体，购自比利时VIB/Gent公司)中(图7)。具体的做法是用质粒抽提试剂盒纯化Gateway的目的载体pK7m34GW2-8m21GW3，在Gateway的LR反应体系中加pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*和pENTR-GUS及pK7m34GW2_8m21GW3各150ng，IulLRClonaseplusEnzymeMix(Invitrogen)，混均于25°C反应过夜，通过整合酶的作用把PrbcS-*T-GFP和GUS整合到pK7m34GW2-8m21GW3中获得串联GFP和GUS表达盒的植物表达载体质粒pK-35S-PrbcS-*T-GFP-PR0LD-GUS(图7)。用反应混合物转化高效率(108)的大肠杆菌感受态细胞(DH5α，天根生化科技)，把转化好的大肠杆菌涂于加有壮观霉素(Spe,50μg/ml)的平板上，于37°C过夜培养，筛选Spe抗性重组子菌落，从Spe抗性重组子菌落中提取质粒(图8A)，用NcoI(TaKaRa)酶切检测，同时以pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP_L3*为正对照，整合成功的质粒在琼脂糖凝胶电泳图上产生五条带(图8B)，第一条为11.68kb的载体带，第二条为2.4kb，第三条为0.84kb，第四条为0.4kb，第五条为GFP基因被切割后产生的片段为0.36kb,与pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*中的GFP被NcoI切割后产生的GFP片段分子量一致(图8B)。选出整合成功的质粒载体pK-35S-PrbcS-*T-GFP-PR0LD-GUS，用GUS基因的上下游特异性引物GUS5和GUS3进行PCR扩增检测GUS基因片段，以pK-35S-PrbcS-*T-GFP-PR0LD-GUS模板都能扩增出一条1.8kb的GUS条带，与用pENTR-GUS为模板扩增到的条带分子量一致(图8C)，确认是连接成功的质粒后，重新转化大肠杆菌DH5α，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒。pK-35S-PrbcS-*T-GFP-PR0LD-GUS携带的植物筛选标记基因为卡那霉素抗性基因(Km)，这样可用加有Km的平板筛选转基因植物。实施例5用GFP和⑶S基因表达盒串联的植物表达载体转化农杆菌制备农杆菌的感受态细胞，用电脉冲法将上述构建好的植物表达载体pK-35S-PrbcS-*T-GFP-PR0LD-GUS转入农杆菌(C58C1(pPMP90))中，在加有壮观霉素的平板上筛选转化子。取少量质粒加入农杆菌感受态细胞中，轻轻混勻；将混合物加入到预冷的电转化杯中，轻轻敲击杯身使混和液落至杯底；将电转化杯置于电转化仪(BIO-RAD)滑槽中，用Imm的电击杯和200欧姆，2.5kV/0.2cm的参数进行电击，电击后立即取出电转化杯，迅速加入0.5mlS0C培养基，混勻，转移到1.5ml的离心管中；28°C，200rpm摇床培养3_5h；室温下，7500rpm离心lmin，弃大部分上清，保留100μ1将细胞悬浮；把农杆菌涂布于有壮观霉素(Spe，50μg/ml)的LB固体培养基上，28°C培养2天获得单菌落；首先用牙签挑取农杆菌菌落放入20μIddH2O中，98°C处理15分钟后取出10μ1农杆菌裂解液作为PCR反应的模板。用GFP和GUS基因上下游特异性引物作PCR检测，转化成功的菌落均能扩增出0.7kb的GFP和1.Skb的GUS基因条带(图9)，经菌落PCR确认的转化子菌落用于转化植物。实施例6用含有GFP和⑶S基因表达载体的农杆菌转化烟草挑取携带有质粒pK-35S-PrbcS-*T-GFP-PR0LD-GUS的农杆菌单菌落接种于50ml的LB培养基中(含Spe,100μg/ml)，180rpm,28°C培养24h，待菌液OD600至1·0左右，离心10min(3000rpm)，沉淀菌体。再用IOml左右的MS液体培养基悬浮，离心IOmin(3000rpm)，沉淀菌体。重复以上操作23次。最后加入一定体积的MS液体培养基重悬浮，使菌体的0D_值为0.5。选取容易转化的植物烟草作转化试验，制备烟草(Nicotianatabacumcv.Xanth,图10A)的无菌苗，通过农杆菌介导，用叶盘法转化烟草，然后通过组织培养获得小苗，进一步筛选获得所需的转基因植物。把无菌烟草的叶片切成小片叶盘，在制备好的农杆菌菌液中浸染15-20min，用无菌吸水纸吸干后，平铺于愈伤组织诱导培养基MSl(MS+NAA02.1μg/ml+BAPO.02yg/ml)上黑暗共培养2天，将外植体转移至含卡那霉素(50μg/ml)的芽诱导培养基MS4(MS+NAA0.53μg/ml+BAPO.5μg/ml)上进行芽的诱导，约15天继代一次。待有芽生成后，转入含卡那霉素(50yg/ml)的MS培养基上进行根的诱导。实施例7转基因烟草叶盘愈伤组织GFP的荧光观察待烟草叶盘在MS4培养基上生长1-2周后，选取部分转化的烟草叶盘产生的愈伤组织(图10B)，放置于载玻片上，使用荧光显微镜(奥林巴斯)观察GFP的瞬时表达情况。先用显微镜普通光源观察愈伤组织(明场)的生长情况。然后关掉普通光源，使用紫外光源照射愈伤组织观察愈伤组织中的GFP亮点并拍照。结果观察到用本发明的方法构建的植物表达载体pK-35S-PrbcS-*T-GFP-PR0LD-GUS转化的烟草叶盘产生的愈伤组织中有GFP的荧光亮点(图10D)，未转化的烟草叶盘产生的愈伤组织在同样的条件下观察没有GFP的荧光亮点(图10C)。说明用pK-35S-PrbcS-*T-GFP-PR0LD-GUS载体转化植物组织后可以实现GFP基因的瞬时表达。实施例8=GFP和⑶S基因在转基因烟草中的插入情况的检测为了确认从转化的烟草叶盘产生的转基因烟草株系确实含有GFP基因和GUS基因，用PCR方法对筛选到的转基因烟草作进一步的鉴定。首先采用CTAB法提取植物基因组称取植物叶片IOOmg左右置于1.5ml离心管中，加液氮用特制研棒研磨至粉末状；加入900μ1预热至Ij650C的2XCTAB缓冲液(Tris-HClρΗ7.5100mM,EDTA20mM,NaCl1.4M,CTAB2%)，65°C度水浴加热20分钟后取出冷却；加入500μ1氯仿-异戊醇混合液(241)摇勻，4°C离心IOmin(7500rpm)后转移上清至1.5mlEP管；再次加入500μ1氯仿-异戊醇混合液(241)摇勻，4°C离心IOmin(7500rpm)；取出上清置于新的EP管中，加入1/10体积3MpH5.2醋酸钠和等体积异丙醇，摇勻后4°C离心20min(12000rpm)；弃上清，用75%乙醇清洗两次后，干燥，用含RNase的TE缓冲液溶解并降解RNA。设计一对GFP基因特异性引物(GFP-test5GGCCAACACTTGTCACTAC,GFP_test3CAAACTCAAGAAGGACCATG)和GUS基因特异性引物(GUS-test5:ATGTTACGTCCTGTAGAAACCCC,GUS_test3:ATATCGTCCACCCAGGTGTTCG)，委托上海生工合成。以烟草基因组DNA为模板，用GFP基因特异性引物(GFP-test5和GFP-test3)和GUS基因特异性引物(GUS_test5和GUS_test3)作PCR检测。在PCR反应混合液中加入50ng的基因组DNA作为模板，同时加入50ng⑶S基因的特异性引物、0.4μIdNTP(IOmM)，5μ1的10Xtaq反应Buffer禾口0.3μ1的taq(2.5U/μ1)聚合酶(天根)，加双蒸水使反应终体积为20μ1。在PCR仪上于94°C加热3分钟，然后按照94°C、45秒，60°C、45秒，72°C，40秒的程序进行35个循环的反应，最后在72°C延长反应10分钟，扩增GUS基因片段。反应完成后，通过琼脂糖凝胶电泳分离GUS基因的PCR扩增产物。在另一个PCR反应混合液中加入50ng的基因组DNA作为模板，同时加入50ngGFP基因的特异性引物、0.4μ1dNTP(IOmM)，5μ1的IOXTaq反应Buffer禾口0.3μ1的Taq(2.5U/μ1)聚合酶(天根生化科技)，加双蒸水使反应终体积为20μ1。在PCR仪上于94°C加热3分钟，然后按照94°C、45秒，55°C、45秒，72°C，40秒的程序进行35个循环的反应，最后在72°C延长反应10分钟，扩增GUS基因。反应完成后，通过琼脂糖凝胶电泳分离GFP基因的PCR扩增产物。转化成功的转基因植株均能扩增出0.5kb的GUS条带(图11A)和0.5kb的GFP条带(图11B)。经PCR确认的转基因植株用于RT-PCR分析。实施例9=GFP和⑶S基因在转基因烟草中转录水平的检测为了考察在含有GFP基因和GUS基因的转基因烟草株系中GFP基因和GUS基因的转录情况，从转基因植物中抽取总RNA，反转绿成cDNA后用于RT-PCR分析，检测GFP基因和⑶S基因在转基因植物中的转录水平。采用TRIzoLReagent(Invitrogen)提取RNA，取植物嫩叶约0.lg，加入Iml的TRIzoL提取液在研钵中研磨，室温静置5min后移入离心管，再加入0.2ml氯仿，振荡混勻，离心15min(12000rpm)，转移上清液至新管，加入0.5ml异丙醇，混勻室温放置10min，4°C离心IOmin(12000rpm)，弃上清，沉淀用75%乙醇Iml清洗，4°C离心5min(7500rpm)，弃乙醇真空干燥沉淀或自然晾干，用20μ1焦碳酸二乙酉旨(DEPC)处理水溶解RNA。使用ReverseTranscriptase(Promega)进行cDNA的合成，取植物总RNA约3μg-5yg，oligo(dT)2y1(5μΜ)，用DEPC处理水补足至12μ1，混勻后，短暂离心将之收集于管底，置于70°C加热5min，冰浴lOmin，加入反应混合物9μ1(5Xreactionbuffer5μ1(含MgCl2)，IOmMdNTPmix1·5μ1，RNA酶抑制剂1μ1，1μ1ReverseTranscriptase，将上述混合物混勻，短暂离心将之收集于管底，然后37°C保温60min，合成cDNA，72°C加热IOmin灭活酶。以cDNA为模板，用GFP基因特异性引物(GFP-test5和GFP-test3)和GUS基因特异性引物(GUS_test5和GUS_test3)作PCR，转化成功的转基因植株均都能扩增出0.5kb的⑶S条带(图12A)0.5kb的GFP条带(图12B)，证明GFP和GUS基因可以在转基因烟草中成功地转录。经RT-PCR确认的转基因植株用于叶绿体GFP的荧光观察和GUS的染色分析。实施例10⑶S的染色分析⑶S的染色分析按照(Zhao等，2OOl；Science,291=306-309)的方法进行，选取在无菌条件下于MS培养基上生长的烟草植株的第三张(自上往下数)叶片浸入GUS染色液(80mM磷酸钠盐缓冲液(pH7.0),0.4mM亚铁氰化钾，0.4mM铁氰化钾，8mMEDTA，0.05%Triton-100,0.8mg/mlX_Gluc，20%甲醇)中，抽真空30min，37°C保温过夜，去除GUS染色液，加入75%乙醇，37°C脱色3小时，重复23次。结果观察到用本发明的方法构建的植物表达载体pK-35S-PrbcS-*T-GFP-PR0LD-GUS转化烟草叶盘产生的转基因植株叶片上有深蓝色斑点(图13B)，没有转染的烟草叶片没有着色(图13A)。说明在用载体pK-35S-PrbcS-*T-GFP-PR0LD-GUS转化植物产生的转基因烟草叶片中⑶S基因可以正常表达。实施例11叶绿体中GFP的荧光观察选取在MS培养基上生长4周龄的烟草叶片，制备原生质体。原生质体的制备按如下方法进行(1)纤维素酶解液室温融解，融化后量取IOmL/皿或者6孔培养板的小穴内(2)剪取叶片(无菌苗、健康、未抽苔、伸展，去掉叶片顶端和叶柄部位，只选取中段叶片)，需要记录叶片片数或者称重，用解剖刀片仔细切成约Imm细条，用镊子轻夹入酶液中散开。(3)用镊子和解剖针分散细叶条，充分与酶液接触；(避免叶条漂浮在酶液表面，不利于酶解。)(4)在避光条件下，低速(50_100rpm)摇床培养，温度控制在25_28°C，酶解4h左右(依材料需要摸索最佳时间。(5)向培养皿中缓慢加入IOmLWashingI溶液，轻轻摇动混合均勻。用剪掉枪尖的ImL移液枪吸取酶解液，尼龙网过滤入15mL塑料离心管；(6)<IOOg离心3min，缓慢吸出上清，每管剩余少量上清液，轻轻晃动离心管，使protoplasts重悬；(用剪掉枪尖的移液枪将重悬液合二为一，离心尽量使用低速水平转子离心机。)(7)沿离心管壁加入IOmLWashingII，轻微颠倒混勻，<IOOg离心3min，缓慢吸出上清，剩余少量上清液，轻轻晃动离心管，使protoplasts重悬；(8)沿离心管壁加入IOmLWI溶液，轻微颠倒混勻，<IOOg离心3min，尽量吸出上清，加入适量WI溶液，轻轻晃动离心管，使protoplasts重悬，重悬后的protoplasts置于冰上暂时保存；(WI的加入量视收集到的protoplasts而定，在lml_3ml的范围之内，使重悬后的溶液浓度至少在IO6个/ml)；(9)吸取10ul_20ul均勻混合的protoplasts悬浮液，进行FDA染色制片，在蓝色荧光下观测细胞活性(染色后等待l-2min的反应时间，再观察细胞活性，活细胞呈绿色或黄色)。从原生质体悬浮液中吸取部分置于载玻片上，盖上盖玻片，使用荧光显微镜(奥林巴斯)观察原生质体的叶绿体中GFP的表达情况。先用显微镜普通光源(明场)找出结构完整的原生质体。然后关掉普通光源，使用紫外光源照射观察(暗场)原生质体的叶绿体中GFP荧光并拍照。结果观察到在用本发明的方法构建的植物表达载体pK-35S-PrbcS-*T-GFP-PR0LD-GUS转化植物产生的转基因烟草叶片原生质体的叶绿体中，除了有红色的叶绿素荧光外还有蓝色的GFP荧光亮点(图14B)，在未转化的烟草叶片原生质体的叶绿体中在同样的条件下观察只有红色的叶绿素荧光没有GFP蓝色荧光(图14A)，说明用pK-35S-PrbcS-*T-GFP-PR0LD-GUS载体转化植物组织后可以实现GFP基因在转基因植物叶片中的正常表达，表达的目的蛋白可以定位到叶绿体中。表1纤维素酶解液和Washingbuffer的配方1.纤维素酶解液<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>0.45uM摊滤，分装，_20°C保存备用。2.WashingbufferI^分子量(M)浓度50mL加入量mannitol182.2167mM1.521CaCl2110.9133mM0.738121°C高温灭菌，16min，4°C保存。3.WashingbufferII^I分子量(M)浓度50mL加入量mannitol182.2333mM3.033CaCl2110.967mM0.371121°C高温灭菌，16min，4°C保存。权利要求通路克隆入门载体pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*，含有1，5二磷酸核酮糖羧化酶Rubisco小亚基基因的光诱导型启动子PrbcS和叶绿体基质定位序列T*及绿色荧光蛋白GFP报告基因。2.通路克隆入门载体pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*，采用Gateway的入门载体PEN-L4-2-L3为基本骨架构建，用一对互补引物HindIII5和HindIII3，通过点突变技术在PEN-L4-2-L3的attL4位点下游引入Hindlll位点产生入门载体pEN_L4*-2_L3；再利用另一对互补引物XhoI5和XhoI3，通过点突变技术把pEN-L4*-2-L3中attL3位点下游的多克隆位点中的PstI位点改为Xhol产生入门载体pEN-L4*-2-L3*；最后用Hindlll和Xhol切开pEN-L4*-2-L3*和pENTR*-PrbcS-*T_GFP，回收pEN_L4*_2_L3*被切割后产生的载体片断pEN-L4*-L3*及pENTR*-PrbcS-*T-GFP被切割产生的PrbcS_*T_GFPDNA片段，用连接酶把pEN-L4*-L3*和PrbcS-*T-GFP连接起来产生入门载体pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP_L3*。3.通路克隆入门载体pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*，由下述方法构建而成(1)利用一对互补引物HindIII5和HindIII3，通过点突变技术在入门载体PEN-L4-2-L3的attL4重组位点下游处引入Hindlll产生入门载体pEN_L4*-2_L3；(2)利用一对互补引物XhoI5和XhoI3，通过点突变技术把入门载体pEN-L4*-2-L3中attL3重组位点下游多克隆位点中的PstI位点改为Xhol产生入门载体pEN-L4*-2-L3*；(3)用Hindlll禾PXhol切开pEN_L4*-2_L3*禾PpENTR*-PrbcS-*T_GFP，回收pEN-L4*-2-L3*被切割后产生的载体片断pEN_L4*_L3*及pENTR*-PrbcS-*T_GFP被切割产生的PrbcS-*T-GFPDNA片段，用连接酶把pEN_L4*_L3*和PrbcS_*T_GFP连接起来产生入门载pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*。4.如权利1-3的通路克隆入门载体pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*，其中光诱导型启动子PrbcS是从番茄的基因组中分离出来的rbcS-3C的启动子，是一个由Hindlll切割产生的1.7kb的DNA片断。5.如权利1-3的通路克隆入门载体pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*，其中报告基因GFP来自Invitrogen公司的pGFP中的GFP。6.权利要求1-3的通路克隆入门载体pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*的构建方法，包括下述步骤(1)利用一对互补引物HindIII5和HindIII3，通过点突变技术在入门载体PEN-L4-2-L3的attL4重组位点下游处引入Hindlll产生入门载体pEN_L4*-2_L3；(2)利用一对互补引物XhoI5和XhoI3，通过点突变技术把入门载体pEN-L4*-2-L3中attL3重组位点下游多克隆位点中的PstI位点改为Xhol产生入门载体pEN-L4*-2-L3*；(3)用Hindlll禾PXhol切开pEN_L4*-2_L3*禾PpENTR*-PrbcS-*T_GFP，回收pEN-L4*-2-L3*被切割后产生的载体片断pEN_L4*_L3*及pENTR*-PrbcS-*T_GFP被切割产生PrbcS-*T-GFPDNA片段，用连接酶把pEN_L4*_L3*和PrbcS_*T_GFP连接起来获得入门载体pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*。7.权利要求1-3的通路克隆入门载体pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*在制备串联两个目的基因表达盒的植物表达载体中的应用。8.权利要求1-3的通路克隆入门载体pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*在实现目的基因在转基因植物叶片中的表达的遗传工程中的应用。全文摘要本发明涉及一种通路克隆(Gateway)技术的入门载体，特别是通路克隆入门质粒载体(pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*)，该载体含有通路克隆技术LR重组反应所需的L4和L3序列、1，5二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)小亚基基因的光诱导型启动子(PrbcS)和叶绿体基质定位序列(T*)及绿色荧光蛋白(GFP)报告基因。上述载体的构建方法和应用，利用该载体和通路克隆的另一个含有L1和L2序列的入门载体，通过LR重组反应可以快速构建一个串联两个目的基因表达盒的植物表达载体，从而实现通过一次转化事件完成2个目的基因的转化操作。利用目的基因替换该载体中的GFP基因，则可用该载体中的PrbcS启动子控制目的基因的表达，并可以实现目的基因在植物叶片中的高水平表达。文档编号C12N15/65GK101831454SQ20101011094公开日2010年9月15日申请日期2010年2月21日优先权日2010年2月21日发明者严金平,孙振,李昆志,李莉,梁峰,王莎莎,肖素勤,陈丽梅申请人:昆明理工大学