专利名称：小鼠巨细胞病毒实时荧光定量pcr检测方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种病毒检测方法，具体的地说是一种小鼠巨细 胞病毒实时荧光定量PCR检测方法。
背景技术：
小鼠巨细胞病毒(Murine Cytomegalovirus, MCMV)属疱疹病毒科，是一种可引起 持续性感染的病毒。机体抵抗力低时可引起急性发病死亡，导致实验失败。目前，检测各种病毒的方法很多，如血清学试验、组织块培养和共培技术、核酸杂 交和常规PCR检测技术等，其中常规PCR检测技术敏感性、特异性、稳定性和可操作性都比 较好，但常规PCR反应后的处理存在交叉污染，也比较容易出现假阳性结果，并且实验时间 也相对较长。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述不足，提供一种小鼠巨细胞病毒实 时荧光定量PCR检测方法，该检测方法的检测灵敏度可达到1. 0 X IO4个拷贝的病毒分子， 对于单个样本检测时间为2个小时，可同时进行大批量的样本分析，具有良好的特异性、敏 感性、重复性和稳定性，适用于病毒感染的前期诊断。实时荧光定量PCR检测技术就填补了现有技术的缺陷，无论是在研究中还是在临 床样品的检测上，实时荧光定量PCR快速、敏感的特性使它成为应用于检测微生物的有效 方法。实时荧光定量PCR技术具有以下优点=(I)PCR的高灵敏性、DNA杂交的高特异性和光 谱技术的高精确性；(2)仪器自动分析，效率高、无后续处理；(3)独特的定量原理，即时反 映扩增过程，摒弃终点数据，更适用于定量，结果重现性好；(4)采用dUTP-UNG酶的防污染 系统，所有试剂均是一次扩增，毋须开盖，不产生污染。按照本发明提供的技术方案，所述小鼠巨细胞病毒实时荧光定量PCR方法包括步 骤如下1、标准质粒的构建在美国国立生物信息中心NCBI基因库(Genbank)中检索获 得小鼠巨细胞病毒的保守基因，利用基因克隆技术构建含有该保守基因序列的标准质粒分 子；2、特异性引物及荧光探针的设计以步骤1中选取的高度保守序列为基准，设计 一对特异性引物及一条荧光探针；设计原则为每条引物的长度为18 25个碱基，荧光探 针长度为20 30个碱基；特异性引物和荧光探针中GC含量要求在40 60%，理论Tm > 500C ；特异性引物和荧光探针自身以及特异性引物和荧光探针之间的3’端避免碱基配对； 选用的特异性引物和荧光探针要设计在小鼠巨细胞病毒基因中的保守区，只对小鼠巨细胞 病毒特异，和其他物种无交叉反应；荧光探针应位于一对特异性引物之间的区域；所述特异性引物包含有正向引物(PrimerF)、反向引物(PrimerR)，其中正向引物的序列为5，-AGCGTCGATGCAGGGGCTTT-3，，
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反向引物的序列为5，-CGGCGGAACGGGGGCTGGTA-3，；所述荧光探针的序列为5，-CGGGGGCGTTCCGAAAACGA-3，；3、实时荧光定量PCR扩增及建立检测标准曲线，包括步骤(1)模板的制备将步骤1中构建的标准质粒作10倍系列稀释，以稀释液为模板；具体如下定量 标准质粒为3. OlXlO9拷贝/ μ 1，用稀释液将标准质粒按10倍稀释，即稀释成浓度分别为 1.0Χ ΙΟ8、1.0Χ ΙΟ7、1.0Χ IO6、1.0Χ ΙΟ5、1.0Χ IO4 的稀释液，稀释液在-20°C条件下保存备 用；(2)实时荧光定量PCR反应体系25μ 1 的 PCR 反应体系含有成分如下DEPC 水，15. 75μ 1 ； 10XPCR buffer, 2. 5μ 1 ； IOmM dNTPs，0. 5μ 1 ；1. 25U Tag DNA 聚合酶，0· 25 μ 1 ；300ηΜ 正向引物(PrimerF)， 2. 5μ 1 ；300ηΜ 反向引物(PrimerR), 2. 5 μ 1 ；模板，1 μ 1 ；(3)循环反应根据步骤⑵中的PCR反应体系加样，将加好样的PCR试剂管放入荧光PCR仪中， 设置相应的荧光采集条件后进行扩增，反应循环程序为(a)、95°C预变性5min，1个循环； (b)、95°C变性20sec，55°C退火30sec，72°C延伸30sec，40个循环后反应结束，得到反应产 物；(4)建立检测标准曲线荧光PCR仪采集荧光信号，经计算机软件自动生成以起始 模板数对数为X轴，Ct值为y轴的标准曲线；4、感染病毒样本的DNA提取及检测(1)采用酚-氯仿法提取感染病毒样本的DNA (2)采用分光光度计和凝胶电泳检测提取的DNA ；5、有效性验证及结果检测判定(1)利用未感染小鼠巨细胞病毒小鼠的DNA配制阴性对照PCR反应体系25μ 1的 阴性对照PCR反应体系为含有成分如下:DEPC水，15. 75 μ 1 ； 10 XPCRbuffer, 2. 5 μ 1 ； IOmM dNTPs，0. 5μ 1 ；1. 25U Tag DNA聚合酶，0. 25 μ 1 ；300ηΜ正向引物(PrimerF), 2. 5 μ 1 ；300ηΜ 反向引物(PrimerR)，2. 5 μ 1 ；未感染MCMV小鼠的DNA，1 μ 1 ；利用感染小鼠巨细胞病毒小鼠的DNA制备阳性对照PCR反应体系25μ 1的阳 性对照PCR反应体系为含有成分如下:DEPC水，15. 75μ 1 ； 10 X PCR buffer，2. 5μ 1 ； IOmM dNTPs，0. 5μ 1 ；1. 25U Tag DNA 聚合酶，0. 25 μ 1 ；300ηΜ 正向引物(PrimerF), 2. 5 μ 1 ； 300ηΜ 反向引物(PrimerR)，2. 5 μ 1 ；感染 MCMV 小鼠的 DNA，1 μ 1 ；(2)循环反应按照步骤(1)中的PCR反应体系加样，将加好样的PCR试剂管放入荧光PCR仪中， 设置相应的荧光采集条件后进行扩增，反应循环程序为(a)、95°C预变性5min，1个循环； (b)、95°C变性20sec，55°C退火30sec，72°C延伸30sec，40个循环后反应结束，得到反应产 物；(3)有效性验证荧光PCR仪采集荧光信号，经计算机软件生成阴性对照点和阳性对照点；阴性对 照应无Ct值并且无扩增曲线，阳性对照点应位于标准曲线上，并且其Ct值应< 30，否则重做。本发明采用实时定量荧光PCR进行小鼠巨细胞病毒的特异性检测，具有以下优点。(1)、特异性好由于TagMan荧光探针定量使用杂交对定量分子进行甄别，具有很 高的准确性，同时，靶序列由引物和荧光探针双重控制，特异性好，假阳性低。(2)、灵敏度高荧光检测技术是一个很灵敏的检测技术，因此TagMan检测的灵敏 度很高。(3)、线性关系好由于荧光信号的产生和每次扩增产物成一一对应的关系，通过 荧光信号的检测可以直接对产物进行定量。(4)、操作简单，自动化程度高、防污染；使用TagMan荧光探针定量扩增和检测可 以在同一管内检测，不需要开盖，不易污染；同时扩增和检测一步完成，操作简单，易于实现 自动化。
图1为小鼠巨细胞病毒(MCMV)的检测标准曲线。图2为小鼠巨细胞病毒(MCMV) PCR电泳图谱。
具体实施例方式一、实验材料1、阳性样本取自感染小鼠巨细胞病毒小鼠(来自无锡市血防所动物实验室)的 脾脏组织。2、实验试剂蛋白酶K、TaqDNA聚合酶及引物(购于美国Promega公司)，STE缓 冲液、TE缓冲液、DNA裂解液、饱和酚、氯仿、异丙醇、75%乙醇、DEPC处理水、dNTPs、DL2000 Marker (其余试剂均购自美国Sigma公司)。实验仪器超细勻浆器(F6/10，上海fluko公司)、离心机(CT15RT，上海天美电化仪器设备 工程有限公司)、实时荧光定量PCR仪(FQD-48A，杭州博日科技有限公司)、普通PCR仪 (TC-96/G/H(b)A杭州博日科技有限公司)、紫外分光光度仪(ND-1000，美国Thermo Fisher Scientific公司)、扫描仪(YLN-26、北京市朝阳区京南机电综合服务部)、数码照相机(索 尼WXl)、冰箱(MDF-382E (N)，三洋电机国贸公司)。二、实验方法1、标准质粒的构建在美国国立生物信息中心NCBI基因库(Genbank)中检索获 得小鼠巨细胞病毒的保守基因，该保守基因序列的NC号为004065. 1，基因片段从30391 30721 ；利用基因克隆技术构建含有该保守序列的标准质粒分子，所用的质粒为PUC57(由 金斯瑞公司提供)，由金斯瑞公司提供合成。2、特异性引物及荧光探针的设计以步骤1中选取的高度保守序列为基准，按照 发明内容部分的设计原则设计一对包含有正向引物(PrimerF)、反向引物(PrimerR)的特 异性引物及一条荧光探针其中正向引物的序列(SEQ ID NO. 1)为
5，-AGCGTCGATGCAGGGGCTTT-3，，反向引物的序列(SEQ ID NO. 2)为5' -CGGCGGAACGGGGGCTGGTA-3‘；荧光探针的序列(SEQ ID NO. 3)为5’ -CGGGGGCGTTCCGAAAACGA-3’ ；3、实时荧光定量PCR扩增及建立检测标准曲线(1)模板的制备将步骤1中构建的标准质粒作10倍系列稀释，以稀释液为模板；具体如下定量 标准质粒为3. OlXlO9拷贝/ μ 1，用稀释液将标准质粒按10倍稀释，即稀释成浓度分别为 1.0Χ ΙΟ8、1.0Χ ΙΟ7、1.0Χ IO6、1.0Χ ΙΟ5、1.0Χ IO4 的稀释液，稀释液在-20°C条件下保存备 用；(2)实时荧光定量PCR反应体系25 μ 1 的 PCR 反应体系含有成分如下DEPC 水，15. 75 μ 1 ； 10 XPCRbuffer, 2. 5μ 1 ； IOmM dNTPs，0. 5μ 1 ；1. 25U Tag DNA 聚合酶，0· 25 μ 1 ；300ηΜ 正向引物(PrimerF)， 2. 5μ 1 ；300ηΜ 反向引物(PrimerR), 2. 5 μ 1 ；模板，1 μ 1 ；(3)循环反应根据步骤(2)中的PCR反应体系加样，将加好样的PCR试剂管放入荧光PCR仪中， 设置相应的荧光采集条件后进行扩增，反应循环程序为(a)、95°C预变性5min，1个循环； (b)、95°C变性20sec，55°C退火30sec，72°C延伸30sec，40个循环后反应结束，得到反应产 物；(4)建立检测标准曲线荧光PCR仪采集荧光信号，经计算机软件自动生成以起始 模板数对数为X轴，Ct值为y轴的标准曲线(如图2所示)；对图1所示的检测标准曲线进行分析可见，模板的5个稀释点均在同一条直线上， 表明当基因拷贝数在1.0X108 1.0X IO4范围内时，检测域值与拷贝数之间均呈良好的线 性关系；回归分析显示，R2 = 0. 9966 ；可见本发明设计的引物及荧光探针的特异且工作性 能良好。4、感染病毒样本的DNA提取及检测(1)采用酚-氯仿法提取感染病毒样本的DNA ；具体步骤为(a)、取感染小鼠巨细胞病毒的小鼠脾脏IOOmg左右，同时放入ImlDNA裂解液，在 超细勻浆器中生成研磨液，然后转入微量离心管中；向微量离心管加入500 μ 1 STE缓冲 液，25μ 1 蛋白酶!((Proteinase K, 10mg/ml), 75 μ 1 10% SDS，充分混勻，在 56°C 下消化 2 小时以上(每隔10 20min混勻一次)；(b)、向微量离心管中加入等体积的酚氯仿异戊醇(25 24 1)混合液，轻 轻颠倒混合5分钟以上，7000r/min离心5min ；(c)、小心将上层清液移至另一干净的微量离心管中，加入等体积的氯仿异戊醇 (24 1)混合液，振荡混勻，7000r/min离心5min ；(d)小心将上层清液移至另一干净的微量离心管中，加入1/10体积的3mol/L的 NaAc或5mol/L的NH 4Ac和2倍体积的冷无水乙醇或1倍体积的异丙醇，置于_70°C下沉 淀2小时或置于_20°C下过夜，以沉淀DNA，然后7000r/min离心10分钟；
(e)小心倒掉上层水相，再用70%冷乙醇洗涤DNA沉淀一次，然后置于真空干燥器 或37°C温箱中干燥，以适量的TE缓冲液(200 500 μ 1)溶解DNA样品，_20°C下保存备用；(2)感染病毒样本的DNA的检测采用分光光度计测定上述提取的DNA的浓度(260nm)，260/280nm的光密度比值应 在1. 8以上，否则可能有蛋白质或苯酚的污染；以TE缓冲液将DNA样品稀释成所需的工作 液的浓度，取2 μ 1左右的样品进行电泳检测，判断DNA是否有降解以及是否需要消除RNA ；5、有效性验证及结果检测判定(1)利用未感染小鼠巨细胞病毒小鼠的DNA配制阴性对照PCR反应体系25μ 1的 阴性对照PCR反应体系为含有成分如下:DEPC水，15. 75 μ 1 ； 10 XPCRbuffer, 2. 5 μ 1 ； IOmM dNTPs，0. 5μ 1 ；1. 25U Tag DNA 聚合酶，0. 25 μ 1 ；300ηΜ 正向引物(PrimerF), 2. 5 μ 1 ； 300ηΜ 反向引物(PrimerR)，2. 5 μ 1 ；未感染MCMV小鼠的DNA，1 μ 1 ；利用步骤4中制备的感染小鼠巨细胞病毒小鼠的DNA制备阳性对照PCR反应体 系25μ 1的阳性对照PCR反应体系为含有成分如下:DEPC水，15. 75 μ 1 ； 10XPCRbuffer, 2. 5μ 1 ； IOmM dNTPs，0. 5μ 1 ；1. 25U Tag DNA 聚合酶，0· 25 μ 1 ；300ηΜ 正向引物(PrimerF)， 2. 5μ 1 ；300ηΜ 反向引物(PrimerR), 2. 5 μ 1 ；感染 MCMV 小鼠的 DNA，1 μ 1 ；(2)循环反应按照步骤(1)中的PCR反应体系加样，将加好样的PCR试剂管放入荧光PCR仪中， 设置相应的荧光采集条件后进行扩增，反应循环程序为(a)、95°C预变性5min，1个循环； (b)、95°C变性20seC，55°C退火30seC，72°C延伸30seC，40个循环后反应结束，得到反应产 物；(3)有效性验证荧光PCR仪采集荧光信号，经计算机软件生成阴性对照点和阳性对照点(如图2 所示)；阴性对照在本检测试验中无Ct值并且无扩增曲线，表明该反应体系中无小鼠巨细 胞病毒；图中的阳性对照点位于标准曲线上，并且其(^值< 32，实验有效，可见，本发明的 检测方法能够准确有效地检测出小鼠巨细胞病毒。三、常规PCR检测(1)以DL2000 Marker作为参照，采用步骤1中构建的标准质粒作为模板，以未感 染MCMV小鼠的DNA作为样本DNA，进行PCR电泳检测，分为参照组、阴性对照组、阳性对照组 和样本组a、b、c，各组的反应体系成分如表1所示
权利要求
小鼠巨细胞病毒实时荧光定量PCR检测方法，包括有标准质粒的构建、特异性引物及荧光探针的设计、实时荧光定量PCR扩增及建立检测标准曲线、感染病毒样本的RNA提取及DNA的制备、有效性验证及结果检测判定，其特征在于，所述特异性引物包含有正向引物(PrimerF)、反向引物(PrimerR)，其中正向引物的序列为5’ AGCGTCGATGCAGGGGCTTT 3’，反向引物的序列为5’ CGGCGGAACGGGGGCTGGTA 3’；所述荧光探针的序列为5’ CGGGGGCGTTCCGAAAACGA 3’。
2.如权利要求1所述的小鼠巨细胞病毒实时荧光定量PCR检测方法，其特征还在于，所 述实时荧光定量PCR扩增及建立检测标准曲线的步骤为(1)模板的制备将构建的标准质粒作10倍系列稀释，以稀释液为模板；具体如下定量标准质粒为 3. OlXlO9拷贝/μ 1，用稀释液将标准质粒按10倍稀释，即稀释成浓度分别为1. OX 108、 1.0Χ ΙΟ7、1.0Χ IO6、1.0Χ ΙΟ5、1.0Χ IO4的稀释液，稀释液在_20°C条件下保存备用；(2)实时荧光定量PCR反应体系25 μ 1 的 PCR 反应体系含有成分如下DEPC 水，15. 75 μ 1 ； 10 X PCRbuffer，2. 5 μ 1 ； IOmM dNTPs，0. 5μ 1 ；1. 25U Tag DNA聚合酶，0· 25 μ 1 ；300ηΜ 正向引物(PrimerF)，2. 5 μ 1 ； 300ηΜ 反向引物(PrimerR)，2. 5 μ 1 ；模板，1 μ 1 ；(3)循环反应根据步骤(2)中的PCR反应体系加样，将加好样的PCR试剂管放入荧光PCR仪中，设置 相应的荧光采集条件后进行扩增，反应循环程序为(a)、95°C预变性5min，1个循环；(b)、 95°C变性20sec，55°C退火30sec，72°C延伸30sec，40个循环后反应结束，得到反应产物；(4)建立检测标准曲线荧光PCR仪采集荧光信号，经计算机软件自动生成以起始模板 数对数为χ轴，Ct值为y轴的标准曲线。
3.如权利要求1所述的小鼠巨细胞病毒实时荧光定量PCR检测方法，其特征还在于，所 述有效性验证及结果检测判定的步骤为(1)利用未感染小鼠巨细胞病毒小鼠的DNA配制阴性对照PCR反应体系25μ1的阴 性对照PCR反应体系为含有成分如下DEPC水，15. 75 μ 1 ； 10XPCRbuffer, 2. 5 μ 1 ；IOmM dNTPs，0. 5μ 1 ；1. 25U Tag DNA聚合酶，0. 25 μ 1 ；300ηΜ正向引物(PrimerF), 2. 5 μ 1 ；300ηΜ 反向引物(PrimerR)，2. 5 μ 1 ；未感染MCMV小鼠的DNA，1 μ 1 ；利用感染小鼠巨细胞病毒小鼠的DNA制备阳性对照PCR反应体系25μ 1的阳性对照 PCR 反应体系为含有成分如下:DEPC 水，15. 75 μ 1 ； 10XPCRbuffer，2. 5 μ 1 ；IOmM dNTPs, 0. 5μ 1 ；1. 25U Tag DNA 聚合酶，0. 25 μ 1 ； 300ηΜ 正向引物(PrimerF), 2. 5 μ 1 ； 300ηΜ 反向 引物(PrimerR)，2. 5 μ 1 ；感染 MCMV 小鼠的 DNA，1 μ 1 ；(2)循环反应按照步骤(1)中的PCR反应体系加样，将加好样的PCR试剂管放入荧光PCR仪中，设置 相应的荧光采集条件后进行扩增，反应循环程序为(a)、95°C预变性5min，1个循环；(b)、 95°C变性20sec，55°C退火30sec，72°C延伸30sec，40个循环后反应结束，得到反应产物；(3)有效性验证荧光PCR仪采集荧光信号，经计算机软件生成阴性对照点和阳性对照点；阴性对照应无Ct值并且无扩增曲线，阳性对照点应位于标准曲线上，并且其Ct值应< 30，否则重做。
全文摘要
本发明涉及一种小鼠巨细胞病毒实时荧光定量PCR检测方法。该方法包括标准质粒的构建、特异性引物及荧光探针的设计、实时荧光定量PCR扩增及建立检测标准曲线、感染病毒样本的RNA提取及cDNA的制备以及有效性验证及结果检测判定步骤；其中特异性引物的正向引物的序列为5’-AGCGTCGATGCAGGGGCTTT-3’，反向引物的序列为5’-CGGCGGAACGGGGGCTGGTA-3’；所述荧光探针的序列为5’-CGGGGGCGTTCCGAAAACGA-3’。本发明检测灵敏度高，检测时间短，可同时进行大批量的样本分析，具有良好的特异性、敏感性、重复性和稳定性，适用于病毒感染的前期诊断。
文档编号C12Q1/68GK101935712SQ20101011026
公开日2011年1月5日 申请日期2010年2月3日 优先权日2010年2月3日
发明者张红, 潘振华, 盛青松, 陈林凤 申请人:无锡奥瑞生物医药科技有限公司