专利名称：：克隆和/或表达的新载体其制备方法及应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及在革兰氏阴性细菌之广泛宿主中克隆和/或表达的新载体。本发明还涉及这些载体的应用，特别是这些载体在生产重组蛋白质或代谢产物中或生物转化反应中的应用，以及含有这些载体的宿主细胞。分子生物学的最新进展导致可用于遗传基因方法之具有广泛宿主之新载体的开发。这些载体与那些具有窄范围宿主特异性的载体(如ColE1)截然不同，特征在于这些载体可在分类学上普遍存在的宿主内复制。就可在几乎所有革兰氏阴性细菌内复制的某些质粒来说，这一特性是很明显的。这样的质粒具有特别适用于大肠杆菌等细菌，以进行必要的构建，然后直接引入所选择之革兰氏阴性宿主的特点。这些载体的另一个特点是它们具有由供体细菌向受体细菌接合转移的迁移或被迁移性质。这种转移一般可以很高频率进行(在1-10-2之间)，此大大高于已知的转化系统。文献中描述的在革兰氏细菌中有广泛宿主的质粒属于不相容性C、N、P、Q和W组群(incC、incN、incP、incQ和incW)。其中已对不相容性组群P和Q作了充分研究，并已构建了大量的衍生物(Schmidhauseretal.，1988)。这些组群也是几乎无例外地得到了应用。在这方面，还描述过这些质粒在除黄色粘球菌(Myxococcusxanthus)、Bradyrhizobiumjaponicum和拟杆菌属(Bacteroides)外之所有革兰氏阴性细菌中的复制情况(KüesandStahl，1989)。对不相容性W组群质粒的使用并不太重要，这一方面是因为它们的优点比不相容性P和Q组群质粒少，另外是对它们了解尚不多。不相容性P组群分两个亚群incPα和incPβ，其中研究最多的是质粒RK2、RP4(事实上它们是同种质粒的两个不同的分离物)和R751。这些质粒具有自动接合特性，即它们都具有接合功能(tra和mob)。此外，它们都是具有低拷贝数(RK2在大肠杆菌内的拷贝数为4-7)的大质粒(RK2有60Kb的尾部)。Kües和Stahl已详细研究了这些质粒的复制情况。另外，已经知道复制原点oriV由(ⅰ)8个17pb的片段、(ⅱ)大肠杆菌之DnaA蛋白质固定位点周围的推断的启动子和推断的大肠杆菌之IHF蛋白质固定位点、(ⅲ)富含AT的9bp序列及相接的DnaA蛋白质固定位点，以及(ⅳ)一个富含GC的区域组成。与trfA基因相关联的复制原点构成与RK2同样普遍存在的复制子，其中所说的trf基因转译成由相同相编码的两种蛋白质A1和A2，且该基因被赋予了不同的密码子。就这些宿主来说，A2，或者A1与A2两者对其复制似乎都是必不可少的(Thomas，1986)。这些质粒的复制受到Kil和Kor基因所介入的复合调节系统的控制。Kor基因(Kil-override)拮抗Kil基因(KilA、KilB、KilC和KilD)的致死性作用，并且对trfA的表达起付调节作用。已鉴定出五个Kor基因(KorA、KorB、KorC、KorE和KorF)。鉴于RK2复制子能适应于用来进行复制的宿主，故证实了存在这些基因及trf基因之调节网(KüesandStahl，1989)。Schmidhauser和Helinski(1985)也证明当在某些宿主中有较差的分离稳定性时，可造成其中某些基因的缺失。因此可见，这些基因对于所观察到的RK2或RP4衍生物的好的稳定性是不可缺少的。已构建了许多RK2的衍生物作为多宿主载体。这便是那些因离开复制原点(oriV)部位而保留了起始载体之四环素抗性基因的质粒。例如质粒PRK290、PRK404、PRK415(Dittaetal.，1980和1985;Keenetal.，1988;Schmidhauseretal.，1988)。其中特别应提到的是质粒pRK290(Dittaetal.，1980)，该质粒在许多革兰氏阴性菌中显示出很高的稳定性(SchmidhauserandHelinski，1985)。该质粒可稳定地存在于大肠杆菌、固氮菌(Azotobacter)、臭味假单胞菌(PseudomonasPutita)、苜蓿根瘤菌(Rhizobiummeliloti)、球形红色假单胞菌(Rhodopseudomonassphaeroides)中。然而，在其他革兰氏阴性菌中该质粒仍是不稳定的;如在瘤病土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)、Acetinobacter、柄杆菌属(Caulobacter)及铜绿色假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)中(SchmidhauseretHelinski，1985)。PRK290有一个20Kb的尾部，这对于一个克隆载体来说是很大的。由RK2开始，通过一系列连续缺失而得到了该质粒。除转移功能(tra基因)、卡那霉素抗性基因及转座子Tnl外，这些缺失除去了KilA和KilC、KilC和KilE功能(SchmidhauseretHelinski，1985)。因此，尽管失去了某些Kil和Kor功能，仍有可能观察到RK2衍生物的某些稳定性。然而，已观察到单纯丢失KilB功能可表现出其在许多革兰氏阴性菌中之稳定性的净减低，并且还观察到PRK290比所有被试的有更小尾部的RK2衍生物之稳定性都低(SchmidhauseretHelinski，1985)。除了有关在trfA表达调节系统中所涉及的不同RK2决定子之各自重要性的研究工作外，还发现了一个对这些质粒之分离稳定性可能起决定性作用的片段(Saurugeretal.，1986)。这个位于tra2区域和卡那霉素抗性基因之间的片段编码一个分配系统(par)。而且表明该片段可稳定大肠杆菌中的PBR322和PACYC177(Saurugeretal.，1986)。至于不相容性组群Q的天然质粒，其实例可包括RSF1010、R1162和R300B。这些质粒在适当微生物中的拷贝数可为10至60个。这些质粒的尾部小于不相容性P组群质粒的尾部;事实上它们的尾部在10Kb以下。复制这些质粒需要有一个Cis区域，其包括两个亚区域(ⅰ)由3，5重复序列、40pb富AT、60pb富GC和推断的大肠杆菌DnaA蛋白质固定盒所形成的区域;以及(ⅱ)另一个有反向重复序列的区域，该反向重复序列构成了有40-60pb“杆”部分的次级结构。RSF1010复制的起始必需有由下述质粒编码的三种蛋白质存在由repA、repB和repC基因编码的RepA、RepB和RepC。RepC(与重复序列相对应)识别复制原点，并正向调节其复制的起始;RepA具有解螺旋酶活性;RepB和RePB＊(它们相应于由相同相编码的而又赋予各蛋白质以不同密码子的两种蛋白质)具有体外RSF1010特异性的引物酶(Primase)活性。RSF1010的复制依赖于DNA聚合酶Ⅲ和宿主的促旋酶。RSF1010可借助不相容性IncIα、IncM、IncX，特别是IncP组群的质粒的tra功能由一种革兰氏阴性菌迁移到另一种革兰氏阴性菌中(DerbyshireetWillets，1987)。迄今尚未描述过有关RSF1010及其衍生物之稳定性的任何研究工作。此外，RSF1010的序列已为人们所熟知(ScholzetScherzinger，1989)，但用功能性分析和分子分析法均不能鉴定出任何质粒稳定性的决定子。有各种理由认为不相容性Q组群质粒，以及不相容性P组群质粒都是不稳定的。虽然作了上述工作，但有广泛宿主的已知质粒存在着许多与其性能及工业规模上的应用有关的缺点。尤其是对于工业应用，除不依赖于宿主细菌外，载体质粒还应具有某些与开发限制及生物安全性相对应的性质。应用上受到限制实质上与质粒的分离稳定性有关。事实上，非常希望在抗生素工业应用中不选择那么易于丢失的质粒。基于这一观点，要求工业上应用的载体应具有很好的稳定性。这种稳定性应大到能维持25次连续传代，此即代表了达到200M3工业发酵罐之生产规模时仍能保留重组菌株所必须的传代数(StanburryetWhitaker，1984)。而且，对于含有可扩增、表达等DNA序列之核苷酸插入段的这些质粒的衍生物来说，也应有相近的稳定性。另外，生物安全限制性规定迫使对重组菌株实行许多生物学限制。1987年5月7日NIH“有关重组DNA分子研究准则”中述及的I级(BL1)生物安全系统提出了相应较少的限制。这一大肠杆菌和臭味假单胞菌中的系统必须以利用非接合和非迁移质粒为条件。事实上，如果重组微生物在天然介质中偶然处于被释放状态，则这些质粒一定不能被转移到其他生物体内(Trevorsetal.，1987)。然而，文献中描述的宽宿主范围的质粒中，没有一种能完全满足这些条件。首先，这些质粒从未以普遍存在的方式达到一种良好的分离稳定性。事实上，如果其中某些质粒在某些宿主内是很稳定的，却不能在所有革兰氏阴性菌中有同样的稳定性。此外，长时间以来一直没有研究过在将含有例如可扩增或表达之序列的DNA片段插入这些质粒后的稳定性。这里特别应提到的是质粒PRK290，以前从未研究过该质粒中插入DNA片段后的稳定性特征。再者，现有技术中描述的有宽范围宿主之质粒的其他特性是它们可以迁移或被迁移，以便由供体细菌接合转移到受体细菌中。具有mob座位的PRK290质粒同样是这种情况。为此，这些质粒便不适合于对生物安全性的限制，而只能以很高迁移频率从其他微生物中排除这些带有特定DNA序列的质粒。另外，这些质粒中的某些质粒因缺乏稳定性而导致只能以低效率产生蛋白质或代谢产物，从而使其在工业发酵过程中的应用受到限制。本发明的一个目的是提供适于在广泛宿主内克隆和/或表达的载体，其特征在于该载体可在几乎所有革兰氏阴性菌内复制，它具有很高的分离稳定性，而且是不能迁移的。本发明的再一个目的是提供这种载体的所有衍生物。从本发明的意义来说，该载体的许多衍生物都包括了保留上述特征的载体，尽管可在其相对重要的区域内有某些改变或修饰(缺失、突变、插入等)。本发明的载体衍生出在革兰氏阴性菌中有广泛宿主的不相容性P组群的质粒。具体地说，它们具有由属于不相容性P组群之质粒衍生的复制原点。更有利的是它们可衍生RK2质粒。它们结合了对载体来说从未描述过的特性，即它们在革兰氏阴性菌中有广泛宿主、具有高稳定性，以及不存在迁移功能。本发明载体的高稳定性是由于具有稳定性特性之特定核苷酸序列的掺入。特别是可使用得自然RP4质粒的特定片段。Saurugger等人(1986)描述了称为par片段的已克隆之片段，并述及它们在大肠杆菌内稳定某些质粒的能力。现已发现，插入par片段可大大提高稳定性，而且这种增加与所选择的宿主生物体、性质(基因、启动子等)或核苷酸插入段的尾部无关。事实上，本发明的载体及其衍生物的分离稳定性比可用作克隆载体的RK2衍生物的稳定性更高，而且在所有已试验的革兰氏阴性菌中都是这样。迁移功能的丢失是本发明载体的第二个特征。因此，与如PRK290这样的质粒相反，本发明的载体不能从一种革兰氏阴性菌向另一种迁移。这样它们便与这些细菌形成I类宿主-载体对，使之符合工业生产规则。特别是因缺失含mob座位的区域所得到的本发明载体更具有这种有利的特性。本发明载体的第三个特性是其能够在大多数革兰氏阴性菌中复制。这一特性是特别有利的，因为在将载体引入所选择的革兰氏阴性宿主之前，这种特性尤其能在完成构建所需的大肠杆菌内发挥作用。同样还可根据所要求的载体应用(扩增、表达等)或其核苷酸插入段之尾部等性质，以及适当宿主来选择之。在一特定的实施方式中，本发明的载体具有多个克隆位点及许多独特的克隆位点，这样将大大有利于整合期望扩增或表达的核苷酸插入段。在另一实施方式中，本发明的载体含有选择标志，如抗生素抗性基因。更可取的是它们含有RK2的四环素抗性基因。该抗性基因能用于选择存在于几乎所有革兰氏阴性菌中的质粒。可将其他抗性基因插入本发明所述的载体及其衍生物上。本发明的一个特定目的是提供在革兰氏阴性菌中有宽范围宿主的克隆和/或表达载体，其特征在于它衍生于RK2质粒、其尾部小于20Kb、含有一个携带RP4质粒之par区域的DNA片段、不含mob座位，并可含有多个克隆位点及选择标志。本发明的载体可用于扩增或表达给定的DNA序列。因此，本发明的一个目的是涉及前面限定之含重组DNA片段的载体。更具体地说，依赖于遗传表达之调节序列的重组DNA含有一个或多个编码一种或多种给定之多肽的结构基因。根据本发明，结构基因总是依赖于它们所特有的调节信号或不同的调节信号。在一优选实施方案中，其遗传表达的调节序列是由选自启动子、决定子、信号肽和核蛋白体固定位点的一个或多个元件组成的。编码多肽的结构基因可选自于编码酶、激素或生长因子的基因。最好是选自编码白蛋白、tPA、TIMP、白细胞介素、脱辅基脂蛋白及干扰素的结构基因。在本发明的一个特定实施方式中，一个或多个结构基因是在代谢产物的生物合成中，在遗传或生物化学水平上起作用的基因，也就是说它们是为生物合成代谢产物之方法中所涉及的多肽编码的基因。具体地说，代谢产物可以是维生素、氨基酸、抗生素或其他任何细菌代谢产物。代谢产物最好选自于维生素B12、生物素、核黄素、赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、青霉素或四环素。在一更可取的实施方式中，本发明的载体含有位于允许表达的信号，可能还有允许分泌所需蛋白质的信号之前的，编码给定之蛋白质的结构基因。本发明的另一个目的涉及生产蛋白质或代谢产物的方法，其特征在于-在革兰氏阴性菌内引入一个如上文中限定的载体，该载体含有编码所述蛋白质的结构基因，或在遗传或生物化学水平上参予生物合成上述代谢产物的一个或多个基因。-在适于表达所说之基因的条件下培养该细菌;以及-回收所产生的蛋白质或代谢产物。可在工业规模上在几乎所有革兰氏阴性菌中利用本发明所描述的载体。对于质粒PXL1635来说，可在能复制质粒RK2的几乎所有革兰氏阴性菌，即除黄色粘球菌、Bradyrhizobiumjapanium、拟杆菌属细菌以外的所有革兰氏阴性菌中使用该质粒(KüesetStahl，1989)。可按下列方式利用这些质粒如可在多克隆位点处克隆携带一个或多个将被扩增之基因的一个或多个DNA片段，然后将如此构建的质粒引入期望在工业上使用的细菌中。如可使用电穿孔转化系统来引入已构建好的质粒(Wirthetal.，1986)。可基于由质粒提供的抗性来选择重组克隆。然后按照工业上应用的传统保存技术保存这些克隆(StandburryetWhitaker，1984)。本发明的再一个目的是涉及含有本发明载体的革兰氏阴性细菌及其应用。这样的细胞特别适用于生产蛋白质或代谢产物，或直接用于生物转化反应中。本发明的其他目的及优点可体现于下述实施例中，这些实施例旨在举例说明而不是限制本发明。克隆、分子生物学及生物化学的一般技术用于本发明的传统分子生物学方法，如在氯化铯-溴乙锭梯度下离心质粒DNA、用限制酶消化、凝胶过滤、由琼脂糖凝胶中电洗脱DNA片段、向大肠杆菌内转化及核苷酸沉淀等均如文献所述(Maniatisetal.，1982;Ausubeletal.，1987)。按已提出的程序经链终止法测定核苷酸序列(Ausubeletal.，1987)。所用限制酶由New-EnglandBiolabs(Biolabs)公司、BethesdaReseachLaboratories(BRL)公司或Amersham公司(Amersham)提供。为了进行连接，用0.7%琼脂糖凝胶或8%丙烯酰胺根据其尾部分离DNA片段，经电洗脱纯化、用苯酚提取、在乙醇中沉淀，然后在T4噬菌体的DNA连接酶(Biolabs)存在下，于含50mMTris-HCl(PH7.4)、10mMMgCl2、10mMDTT、2mMATP的缓冲液中保温。必要时可在缓冲液(10mM甘氨酸、1mMMgCl2、1mMZnCl2，PH10.5)中于37℃下用牛小肠碱性磷酸酶(ClP，Pharmacia)处理30分钟，使带有突出之5′末端的DNA片段脱磷酸化。可用同样技术使突出的或跨越的3′末端脱磷酸化，但不同的是于37℃处理15分钟，再于56℃处理15分钟。于1%SDS和100mMNaCl存在下，65℃下加热该反应混合物以使酶失活，然后用苯酚提取并用乙醇沉淀。用大肠杆菌之DNA聚合酶I的Klenow片段(Biolabs)填充突出的5′末端，该反应于室温下在50mMTris-HCl(PH7.2)、0.4mMdNTPs、10mMMgSO4、0.1mMDTT、50μg/mlBSA缓冲液中进行30分钟。可按照制造商推荐的方法，在T4噬菌体的DNA聚合酶存在下，填充和/或消化突出的3′末端。用Biosearch8600型自动DNA合成仪，按制造商推荐的程序以氰乙基基团呈β型保护的氨基磷酸酯(phosphoramidites)化学(Simaetal.，1984;Giles，1985)方法合成寡核苷酸。按照Taylor等人(1985)建立的方法，用Amersham公司(France，SA)提供的试剂盒对寡核苷酸进行体外诱变。按照制造商推荐的程序使用Promega公司(Madison，WI，USA)的Erase-BaseTMSystem试剂盒，借助核酸外切酶Ⅲ和核酸酶S1以Henikoff(1984)的技术造成序列缺失。用已连接的DNA转化感受态菌株对于质粒为大肠杆菌MC1060〔△(lacIOPZYA)φX74，galU，galK，StrAr，hsdR〕(Casadabanetal.，1983)和HB101〔hsdS20，supE44，recA13，ara-14，proA2，lacY1，galK2，rpsL20，xyl-5，mtl-1，λ-〕(Maniatisetal.，1982)，或对于噬菌体M13之复制形式的衍生物则为大肠杆菌TG1〔△(lacproA，B)，supE，thi，hsdD5/F′traD36，proA+，B+，lacIq，lacZ△M15〕(Gibson，1984)。所用polA菌株是具有萘啶酮酸抗性(Nalr)的SF800菌株(Stacheletal.，1985)。当大肠杆菌与大肠杆菌接合时，利用C600菌株〔thi-1，thr1，leu-B6，lacY1，tonAL1，supE44，λ-〕(Maniatisetal.，1982)自发利福平抗性克隆(C600Rifr)(50μg/ml)作为受体菌株。按照Birnboim和Doly(1979)的技术纯化质粒DNA。按照Klein等人(1980)的方法小量制备质粒DNA。有关细菌部分的实验使用LB培养基(Maniatisetal.，1982)。在LB培养基中和30℃保温温度下培养脱氮假单胞菌SC510Rifr、瘤病土壤杆菌C58C9(Cameronetal.，1989)、臭味假单胞菌KT2440(Bagdasarianetal.，1981)和苜蓿根瘤菌102F34(Leongetal.，1982)。按已述方法(Dittaetal.，1980)进行接合。将参予接合之各细菌的109个细胞经过滤吸附到0.45μm微孔滤膜上。在LB培养基上37℃保温该滤膜后将细胞悬浮在1ml的10mMMgSO4中。然后再将细胞悬浮液的稀释液涂布在添加了适当抗生素的LB培养基上。实施例1质粒pXL1635的构建本实施例举例说明如何构建不能迁移的、具有高度分离稳定性的多宿主载体。实施例1.1得到丢失mob座位之pRK290的衍生物本实施例举例说明如何使RK2的衍生物上缺失RK2的mob座位。鉴于不清楚在靠近mob座位处有何独特的限制性位点，因而给缺失该座位带来困难。在这种情况下，如果使用已描述过的核酸外切酶Bal31，则将有可能进行体外缺失(Maniatisetal.，1982)。为了进行上述缺失，须在RK2的mob座位引入一个独特的限制性位点。为此，我们按照Taylor等人(1985)的技术，分下述三个步骤在一小片段上进行定位诱变首先将含有转移原点(oriT)的RK2的片段再克隆到噬菌体M13的噬菌体衍生物中，进行定位诱变以便引入一个独特的限制性位点;其次将如此突变的片段再克隆到质粒PUC13(VieraetMessing，1982)上，然后将携带卡那霉素抗性基因的暗盒克隆到存在于转移原点内的限制性位点上;第三，经双重重组将突变的片段与由pRK290携带的野生片段交换。所产生的质粒即是在转移原点水平上具有独特限制性位点的pRK290衍生物。这样便有可能通过核酸外切酶，然后是DNA连接酶的作用经诱变完成缺失目的。有关构建细节如下文所述。将足以以cis得以迁移的RK2之760pbHeaⅡ片段(GuineyetYakobson，1982)克隆到M13mp10(VieraetMessing，1982)中。该片段含有RK2的转移原点(GuineyetYakobson，1983)，并且当其克隆到质粒上时，可由RK2的tra功能提供以trans迁移的转移原点。由对RK2的HaeⅡ消化开始纯化该片段，并用T4噬菌体的DNA聚合酶消化末端。另外，经pstⅠ和SstⅠ消化使可复制形式的噬菌体M13mp10线性化;并用T4噬菌体的DNA聚合酶消化其末端。连接如此制得的复制形式并已纯化的片段，然后用以转化感受态大肠杆菌TG1的细胞。按已述方法(VieraetMessing，1982)检测这些重组噬菌体。将所得到的复制形式定名为PXL1418(参见图1)。也已公开了含有RK2转移原点的112pb之HpaⅡ片段的序列(GuineyetYakobson，1983)。该片段包含于PXL1418之760pbHaeⅡ片段中。已观察到它存在一个反向重复序列，且各重复序列均可形成有19pb的发夹结构(参见图2)。按照Taylor等人(1985)建立的方法，对由这一复制形式开始制得的一小的噬菌体DNA进行定位诱变。所用的寡核苷酸具有下示序列5′-CCCGTTGAGCTCCGCCAGGTGC-3′。图2中列出了112pb之HpaⅡ片段及寡核苷酸的序列;如该图所示，寡核苷酸序列与该片段的序列只有一个核苷酸不同;经这一突变而引入了SstⅠ位点。首先证实寡核苷酸与用复制形式之PXL1418感染大肠杆菌TG1所得到的单一小DNA片段完全互补。为此可使用所研究的寡核苷酸作为核苷酸序列的起始部分。已清楚地观察到所发生的序列反应。已显示出该核苷酸序列，并且前面的碱基相当于图2中上一列的右侧端序列。按已述方法进行上述诱变。得到一个在所期望的位置上引入了适当SstⅠ位点的突变克隆。将其中一个复制形式的突变克隆定名为PXL1454(参见图1)。下述步骤旨在将含有抗生素抗性基因的暗盒引入SstⅠ位点，以使其中存在供选择的标志。为此，用SstⅠ处理PXL1461使之线性化，然后与从PUC4KIXX(PharmaciaFrance，SA)纯化的SstⅠ片段连接。该1.6Kb片段携带来自Tn5转座子的卡那霉素抗性基因。在添加氨苄青霉素和卡那霉素的LB培养基上转化之后，选择重组体克隆。将如此得到的质粒定名为PXL1462(参见图1)。将质粒PRK290转化到大肠杆菌polA，SF800菌株(Stacheletal.，1985)中。由RK2衍生的质粒可在该菌株中复制，因为它们的复制并不依赖于大肠杆菌的DNA聚合酶;而PUC13则不能被复制。然后将PXL1462转化到菌株SF800/PRK290中。转化后，将细菌铺敷在添加了四环素、卡那霉素和氨苄青霉素的LB培养基上。因为质粒PXL1462不能在该菌株中复制，所以要使该质粒具有这一抗性，只有在两质粒之间进行同源重组。事实上，这两种质粒共同具有携带转移原点的760pbHaeⅡ片段。这样，在两质粒的同源区域间进行同源重组，便可导致两复制子之间的融合。用限制性酶切法分析三种抗生素抗性克隆的质粒DNA。经琼脂糖凝胶分析表明其只含有单一的质粒。经限制性酶切分析，表明就转移原点水平来说，PXL1462与质粒PRK290重组很好。由两复制子融合所得到的质粒具有两个RK2的转移原点一个是野生型的，一个则具有经诱变而引入的SstⅠ位点，以用于克隆携带卡那霉素抗性基因的暗盒(见图3)。然后在添加四环素和卡那霉素的LB培养基中，用稀释的培养物培养含有这类质粒的克隆。因切除携带转移原点之760pb片段之野生拷贝的PUC13会发生简单重组，从而可在没有苄苄青霉素情况下选择之。既然PUC13及其衍生质粒未被复制，已切除的质粒会立即丢失。在可以选择PRK290和突变之复制原点标志的液体培养基中，经代表60次传代的一系列稀释培养后，将细菌涂布在添加同样抗生素的LB培养基上。将2000个菌落接种到相同培养基和添加氨苄青霉素的LB培养基上。得到2个对氨苄青霉素敏感的克隆。纯化由这些克隆携带的质粒，进行限制性酶切分析。分析结果表明，这些质粒完全符合于切除了RK2转移原点之野生拷贝及PUC13的质粒。该质粒被定名为PXL1561(见图3)。既然该质粒具有两个与转移原点相应的HindⅢ位点，那么就有可能在经HindⅢ消化后再用核酸外切酶切割以实现缺失(见图3)。为此，先用HindⅢ消化pXL1561，再用Henikoff(1984)的技术进行一系列缺失;该技术中利用了核酸外切酶和核酸酶S1的连续作用;所得到的缺失是双向的。然后连接这些缺失，并用连接产物转化MC1060。用限制性酶切法分析如此得到之转化体的质粒DNA。结果表明许多克隆经受了与mob座位相应的缺失。我们得到了缺失3.5Kb的质粒。如果核酸外切酶相对于HindⅢ位点以两个方向相同的动力学消化质粒DNA，则该缺失应有相对于质粒转移原点为1.75Kb的缺失。将如此得到的质粒定名为PXL1570(见图3)。PXL1570具有独特的限制性位点EcoRⅠ和BglⅡ。我们试图在EcoRⅠ位点处引入克隆的多位点，以便使所得质粒包含多个克隆位点。使用具有以两个EcoRⅠ位点为边界之多克隆位点的质粒PFR10(Shapiraetal.，1983)作为多克隆位点的来源。同PXL1570一样，用EcoRⅠ消化PFR10。连接两消化产物，并将连接物转化到大肠杆菌MC1060中。将所得到的已确定了多位点取向的重组克隆定名为PXL1594(参见图4)。实施例1.2构建具有RK2之par座位的不可迁移的PRK290衍生物本实施例举例说明如何将具有RP4之par座位的片段克隆到RK2衍生物上，以得到分离稳定的质粒。将含RP4之par座位的PGMA28(Gerlitzetal.，1988)的2.2KbBamHⅠ片段纯化后，与用BglⅡ线性化的PXL1594相连接。用该连接物转化大肠杆菌MC1060。经限制性消化分析24个转化体的质粒DNA，以及3个携带2.2Kb片段的克隆。其中两个具有相同定向的片段，第3个则相当于相反定向。与前两个克隆相应的质粒命名为PXL1635，而有另一取向之片段者则定名为PXL1634(图4)。如此得到的质粒是RK2，更准确地说是PRK290的衍生物，它缺失转移原点周围的3.5Kb，整合了RP4的par区域，且还可以具有克隆的多位点。对于对称性克隆可依次利用下列位点EcoRⅠ、BamHⅠ、PstⅠ、HindⅢ、ClaⅠ、XbaⅠ、XhoⅠ和SstⅠ;对于非对称性克隆应排除EcoRⅠ，但可使用其他的酶。实施例2PXL1635的迁移已研究过PXL1635的迁移。这种迁移是基于从大肠杆菌到大肠杆菌的接合转移而达到的。按照Ditta等人已述及的技术，利用下列菌株进行三对间的转移-携带迁移质粒的菌株HB101(PXL1635)或HB101(PRK290)或HB101(PXL1570)或HB101(PUC9tet)。-含有RK2衍生物迁移所需之“辅助”质粒的菌株。-受体菌株C600Rifr。质粒PUC9tet得自PharmaciaFranceS.A.;其为不能迁移的、PBR322衍生的质粒，并被赋予与PRK290、PXL1635和PXL1570相同的抗性。在添加四环素和利福平的LB培养基上选择转移接合体。按常规方法(Dittaetal.，1980)，根据有效地获得质粒抗性之受体细胞数对受体细胞总数之比计算接合的频率。用HB101作供体菌株进行接合。这涉及到recA菌株，它可避免了因具有同源序列而在PRK2013与PXL1570、PRK290、PXL1635和PUC9tet之间发生同源重组的可能性。表RK2的衍生物由大肠杆菌HB101向C600Rifr接合的频率。试验细节如正文所述。一无供体质粒。实施例3将PXL1635引入大肠杆菌以外的革兰氏阴性菌中本实施例举例说明如何将质粒PXL1635(非迁移性的)引入各种革兰氏阴性菌中。既然质粒PXL1635不具有转移原点，便不可能由大肠杆菌向其他革兰氏阴性菌中迁移。为将PXL1635引入各种革兰氏阴性细菌中，可使用经电穿孔转化的方法(Wirthetal.，1989)。借助这一方法用质粒PRK290、PXL1570和PXL1635转化下列细菌-脱氮假单胞菌SC510Rifr-瘤病土壤杆菌C58C9-臭味假单胞菌KT2440-苜蓿根瘤菌102F34对每种细菌均再次分离重组克隆;纯化质粒DNA表明与经过许多限制性消化的起始质粒没有差异。据此可将质粒PXL1635引入革兰氏阴性细菌中。实施例4PXL1635的稳定性本实施例举例说明在革兰氏阴性菌中为什么PXL1635比PRK290更稳定。不同的重组体细菌及其亲代菌株均培养于添加抗生素的LB培养基中。达到生长稳定期时进行1/1000稀释。如此培养这些菌株达到平均50代(传代数估计为50代，包括在40-60代之间)，然后将培养物稀释液分散到LB琼脂培养基上。对每份培养物，取200个独立的克隆转移到对质粒有选择性的培养基上。计算失去抗性，因而也就是失去了质粒之克隆的频率。所得数值列于下表中。表各种革兰氏阴性细菌中PRK290、PXL1570和PXL1635的丢失频率这些数值相应于在非选择性的LB培养基中培养50代后，丢失质粒抗性之克隆的频率(%)。由此表可以清楚地看出，PXL1635比PRK290和PXL1570稳定得多;这种特性对于所研究的所有细菌都是符合事实的。携带后两种质粒的克隆均以同样的频率丢失质粒;从统计学上看所观察到的差异性并不显著。可见缺失3.5Kb并不影响PRK290的复制特性和稳定性。相反，克隆PGMA28的2.2Kb片段对于引起稳定性的增加却是极为重要的。这些结果清楚地表明，从稳定性角度看，质粒PXL1635是一种比PRK290更为有利的质粒。其他的RK2衍生物同样保留了这些优点。对于工业应用来说，按照已公开的材料，RK2之其他衍生物的优点要比PRK290少。图1PXL1418、PXL1454、PXL1461和PXL1462的构建。有关构建细节如正文所述。图2含有RK2之转移原点的110bpHpaⅡ片段的序列(据GuineyetYakobson，1983)。标出了用于诱变之寡核苷酸的序列及所引入的SstⅠ位点。用箭头着重标示了两个应形成发夹结构的反向重复序列。图3PXL1561和PXL1570的构建。构建的细节如正文所述。图4PXL1594、PXL1635和PXL1634的构建。所用术语的定义与缩写重组DNA技术组合，它们或者在同一微生物中使微生物固有的DNA序列相结合，或者对特定DNA片段进行诱变。ATP腺苜-5′三磷酸BSA牛血清白蛋白CodonStop转导终止密码子dNTP2′-脱氧核苜5′-三磷酸DTT二硫苏糖醇Kb千碱基pb碱基对参考文献RéférencesbibliographiquesAusubelF.M.，R.Brent，R.E.Kinston，D.D.Moore，J.A.Smith，J.G.SeidmanandK.Struhl.1987.Currentprotocolsinmolecularbiology1987-1988.JohnWilleyandSons，NewYork.Bagdasarian，J.Frey，andK.Timmis.1981.Specific-purposeplasmidcloningvectors.Ⅱ.Broadhostrange，highcopynumber，RSF1010-derivedvectors，andahostvectorsystemforgenecloninginPseudomonas.Gene16，237-247.CameronB，K.Briggs，S.Pridmore，G.BrefortandJ.Crouzet，1989.CloningandanalysisofgenesinvolvedincoenzymeB12biosynthesisinPseudomonasdenitrificans.J.Bacteriol，171，547-557.Casadaban，M.J.，A.Martinez-Arias，S.T.ShapiraandJ.Chou.1983.β-galactosidasegenefusionforanalysinggeneexpressioninEscherichiacoliandYeast.MethodsEnzymol.100，293-308.Derbyshire，K.M.andN.S.Willets.1987.MobilizationofthenonconjugativeplasmidRSF1010ageneticanalysisofitsoriginoftransfer.Mol.Gen.Genet.，206，154-160.DittaG.，SchmidhauserT.，YakobsonE.，LuP.，LiangX.-W.，FinlayD.R.，GuineyD.，HelinskiD.R.，1985.PlasmidsrelatedtothebroadhostrangevectorpRK290，usefulforgenecloningandformonitoringgeneexpression.Plasmid，13，149-154.DittaG.，StanfieldS.，CorbinD.，HelinskiD.R.，1980.BroadhostrangeDNAcloningsystemforGram-negativebacteriaConstructionofagenebankofRhizobiummelitoti.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，77，7347-7351.Gerlitz，M.，O.HrabakandH.Schwab.Abstract8thInternationalBiothechnologySymposium，1988，A156，p.129.Giles，J.W.1985.AdancesinautomatedDNAsynthesis.Am.Biotechnol.，Nov./Dec.GuidelinesforresearchinvolvingrecombinantDNAmolecules;Notice.NationalInstituteofHealth，FederalRegister，Vol.51，No.88，16958-16965.Guiney，D.G.andE.Yakobson.1983.LocationandnucleotidesequenceofthetransferoriginofthebroadhostrangeplasmidRK2.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80，3595-3598.HenikoffS.1984.UnidirectionaldigestionwithexonucleaseⅢcreatestargetedbreakpointsforDNAsequencing.Gene，28，351-359.Keen，N.T.，S.Tamaki，D.KobayashiandD.Trollinger.1988.ImprovedbroadhostrangeplasmidsforDNAcloningingram-negativebacteria.Gene，70，191-197.Kües，U.andU.Stahl.1989.Replicationofplasmidingram-negativebacteria.Mic.Rev.，53，491-516.Leong，L.S.，G.S.Ditta，andD.R.Helinski.1982.Identificationofaclonedgenecodingforδ-aminolevulinicacidsynthetasefromRhizobiummelitoti.J.Biol.Chem.257，8724-8730.Maniatis，T.，E.F.Fritsch，andJ.Sambrook.1982.Molecularcloningalaboratorymanual.ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NewYork.Saurugger，P.N.，O.Hrabak，H.SchwabandR.M.Lafferty.1986.Mappingandcloningofthepar-regionofbroad-host-rangeplasmidRP4.J.Biotechnol.，4，333-343.Schmidhauser，T.J.andD.R.Helinski.1985.Regionsofbroad-host-rangeplasmidRK2involvedinreplicationandstablemaintenanceinninespeciesofgram-negativebacteria.J.Bacteriol.，164，446-455.Schmidhauser，T.J.，G.DittaandD.R.Helinski.1988.Broad-Host-Rangeplasmidcloningvectorsforgram-negativebacteria.InR.L.RodriguerandD.T.Denhardt(ed.)，Vectors，asurveyofmolecularcloningvectorsandtheiruses，Butterworths，Boston.Scholz，P.，V.Haring，B.Wittman-Liebholt，K.Ashman，M.BagdasarianandE.Scherzinger.1989.Completenucleotidesequenceandgeneorganizationofthebroad-host-rangeplasmidRSF1010.Gene，75，271-288.ShapiraS.K.，J.Chou，F.V.Richaud，andM.C.Casadaban.1983.NewversatileplasmidvectorforexpresssionofhybridproteinscodedbyaclonedgenefusedtolacZgenesequencesencodingenzymaticallyactivecarboxy-terminalportionofβ-galactosidase.Gene25，71-83.Sinha，N.D.，J.Biernat，J.McManusandH.Koester.1984.Polymersupportoligonucleotidesynthesis，ⅩⅤⅢUseofβ-cyanoethyl-N，N-dialkylamino-/N-morpholinophosphoramiditeofdeoxynucleosidesforthesynthesisofDNAfragmentssimplifyingdeprotectionandisolationofthefinalproduct.Nucl.AcidsRes.，12，4539-4557.StachelS.E.，G.An，C.FloresandE.W.Nester.1985.ATn3lacZtransposonfortherandomgenerationofβ-galactosidasegenefusionsapplicationtotheanalysisofgeneexpressioninAgrobacterium.EmboJ.，4，891-898.Stanburry，P.F.andA.Whitaker.1984.Principlesoffermentationtechnology.PergamonPress，Oxford.TaylorJ.W.，J.OttandF.Eckstein.1985.Therapidgenerationofoligonucleotide-directedmutationsathighfrequencyusingphophorothioate-modifiedDNA.Nucl.AcidRes.，13，8764-8765.ThomasC.M.1986.EvidencefortheinvolvementoftheincClocusofbroadhostrangeplasmidRK2inplasmidmaintenance.Plasmid，16，15-29.Trevors，J.T.，T.BarkayandA.W.Bourquin.1987.Genetransferamongbacteriainsoilandaquaticenvironmentsareview.Can.J.Microbiol.，33，191-198.VieraJ.andJ.Messing.1982.ThepUCplasmids，anM13mp7-derivedsystemforinsertionmutagenesisandsequencingwithsyntheticuniversalprimers.Gene，19，259-268.Wirth，R.，A.FriesenegerandS.F.Fielder.1989.Transformationofvariu-ousspeciesofgram-negativebacteriabelongingto11differentgenerabyelectroporation.Mol.Gen.Genet.，216，175-177.权利要求1.有宽范围宿主的克隆和/或表达载体，其特征在于它能在几乎所有的革兰氏阴性细菌中复制、具有很高的分离稳定性，并且是不迁移的。2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于它具有在不相容性P组群革兰氏阴性细菌中有由宽范围宿主之质粒衍生的复制原点。3.根据权利要求2所述的载体，其特征在于它具有质粒RK2的复制原点。4.根据权利要求1所述的载体，其特征在于它含有携带质粒RP4之par区域的DNA片段。5.根据权利要求1所述的载体，其中缺失了mob座位。6.根据权利要求1所述的载体，其特征在于它还含有克隆的多位点。7.根据权利要求1所述的载体，其特征在于它还含有最好由抗菌素抗性基因构成的选择标志。8.在革兰氏阴性细菌中有宽范围宿主的克隆和/或表达载体，其特征在于它是由质粒RK2衍生的、有一个小于20Kb的尾部、含有携带质粒RP4之par区域的DNA片段、不含mob座位、并且可能含克隆的多位点和选择标志。9.质粒PXL1635，其特征在于它是由RK2质粒衍生的、有一个小于20Kb的尾部、含有携带质粒RP4之par区域的DNA片段，不含mob座位，并且含克隆的多位点和抗生素抗性基因。10.根据上述权利要求中任一项所述的载体，其特征在于它还含有重组DNA。11.根据权利要求10所述的载体，其特征在于依赖于遗传表达的调节序列的重组DNA含有编码给定之一种或多种多肽的一个或多个结构基因。12.根据权利要求11所述的载体，其特征在于所说的结构基因依赖于其固有的调节序列或不同的调节序列。13.根据权利要求11或12中之任一项所述的载体，其特征在于遗传表达的调节序列是由选自于启动子、决定子、信号肽和核蛋白体固定位点的一个或多个元件组成的。14.根据权利要求11所述的载体，其特征在于其中一个或多个结构基因编码选自于酶、激素、生长因子，最好是选自于白蛋白、tPA、TIMP、白细胞介素、脱辅基脂蛋白和干扰素的蛋白质。15.根据权利要求11所述的载体，其特征在于其中的一个或多个结构基因是在遗传与生物化学水平上参与代谢产物之生物合成的基因。16.根据权利要求15所述的载体，其特征在于其中代谢产物选自于维生素、抗生素、氨基酸和所有其他细菌代谢产物。17.根据权利要求16所述的载体，其特征在于所说的代谢产物选自于维生素B12、生物素、核黄素、赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、青霉素和四环素。18.生产蛋白质或代谢产物的方法，其特征在于-在革兰氏阴性细菌中引入权利要求10至17中之任一项所述的载体，该载体含有编码所述蛋白质的结构基因或在遗传或生物化学水平上参与所述代谢产物之生物合成的一个或多个基因。-在一个或多个所述基因的表达条件下培养所说的细菌，-回收所产生的蛋白质或代谢产物。19.含有权利要求1至17中之任一项所述的载体的革兰氏阴性细菌。20.权利要求19所述的细菌用于生产蛋白质或代谢产物。21.权利要求19所述的细菌直接用于生物转化反应中。全文摘要本发明涉及在革兰氏阴性细菌中有宽范围宿主的、不能迁移的、并且有较大稳定性的新的克隆和/或表达载体。本发明还涉及这些载体的应用，尤其是在生产重组蛋白质与代谢产物中的应用或在生物转化反应中的应用，以及含有这种载体的宿主细胞。文档编号C12N15/74GK1056712SQ9110334公开日1991年12月4日申请日期1991年4月22日优先权日1990年4月24日发明者贝齐思·凯莫龙,约尔·科劳瑟特,奥非·雷威·齐尔申请人:罗纳-布朗克生物化学公司