专利名称：7、8-脱氢酶基因的克隆与表达的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程和酶工程领域，具体涉及7、 8-脱氢酶基因的克隆与表达。
背景技术：
维生素D3是人与动物生长、发育、繁殖、维持生命和保持健康必不可少的一种脂溶性维 生素。它的主要作用是调节钙磷代谢，促进肠内钙磷吸收和骨质钙化，维持血钙和血磷的平衡， 可用作药物制剂、食品和饲料添加剂等，在临床上还可用于治疗佝偻病、老年骨质疏松、甲状 腺机能减退症等。目前维生素D3是采用光化学法生产，即以7-脱氢胆固醇(7—DHC)为原料， 经紫外照射后转变为维生素D3前体(PreD3)，再热异构化而得。作为主生产原料的7-脱氢胆固醇， 可采用多种不同的原料和工艺路线，通过化学合成法制备。如可从羊毛脂提取胆固醇，再进行 酯化、氧化生成7-酮胆固醇酯，后者可还原成7ff和7i9-羟基胆固醇酯，再通过消除反应生成7-脱氢胆固醇。我国中科院感光化学所(现为理化所)张建成等人的工艺路线,则以胆固醇为基本 原料，经氧化、加成等一系列反应得到7-脱氢胆固醇。
随着世界人口的不断增加和各国国民经济的发展，以及人们生活水平的提高，市场对维生 素D3的需求量也呈上升趋势。但迄今，无论采用何种化学合成法制备原料7-脱氢胆固醇，都有 反应步骤长，总产率不高，副反应多，条件难控制，效率偏低，成本高等缺点，从而影响维生 素D3的生产成本、销售价格、市场推广。因此，目前研究开发工艺路线短、成本低的7-脱氢 胆固醇生产方法变得十分迫切和必要。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够克服现有技术中的不足之处，采用生物工程方法，研究开发工 艺路线短、成本低的7-脱氢胆固醇生产路线。
本发明是从果蝇cDNA文库中克隆一种编码7、 8-脱氢酶的基因，其目的是提供一种克隆与表 达7、 8-脱氢酶的方法,该发明可以获得有酶活的7、 8-脱氢酶。
目前有关蜕皮激素合成机理的研究发现，某些昆虫的幼虫，在蜕皮激素生物合成的第一步， 其体内有种脱氢酶，先将胆固醇7、 8号位上的氢原子脱除，得到中间产物7-脱氢胆固醇，进而 在P450酶系其它酶的作用下，经多步酶促反应合成蜕皮激素。基于这种理论，我们从果蝇cDNA 文库中克隆一种编码7、 8-脱氢酶的基因，并成功表达。通过控制合适的酶反应条件，发现该7、 8-脱氢酶能将胆固醇转化为7-脱氢胆固醇。这样的结果，十分有利于下一步研究高酶活、低成本
4的脱氢酶制造方法，从而开发一种全新的、生物法合成7-脱氢胆固醇工艺路线，并最终实现大幅 度降低7-脱氢胆固醇和维生素D3生产成本的目的。 本发明的技术方案如下
1、 从果蝇中获取cDNA文库和pSE380质粒，保存于实验室中。
2、 基因的克隆与测序，自行设计的引物进行PCR扩增，PCR产物经0. 8%琼脂糖凝胶电泳检 测，回收后与pGM-T vector连接，得到重组质粒，用连接液转化感受态￡ co力'DH5 a ,在含Amp、 IPTG、 X-gal的LB平板上挑取白色菌落，接种于含Amp的LB培养基中，抽提质粒进行PCR和酶切 验证、测序。
3、 根据上述扩增得到的片段，釆用上述设计的引物进行片段的扩增。以重组克隆载体为模板 进行降落PCR扩增，回收产物和pSE380分别经过EcoR I和BamH I进行双酶切，回收后连接，转 化f. 7/DH5a， A即抗性筛选，抽提重组质粒进行PCR，酶切鉴定，将鉴定后的重组质粒测序， 进一步验证。
4、 ￡ co7i BL21 (DE3) plysS的转化和7、 8-脱氢酶的诱导表达，将重组pSE380转化感受态 的BL21，取160uL转化液涂布于LB平板上，35 — 38'C培养至出现单菌落，并用含有空白载体 pSE380的菌株作为空白对照。从转化平板上挑取单菌落到5 rrL LB液体培养基中，35 — 38'C 220 r/min摇床培养至0D6。。=0. 6左右，添加IPTG至终浓度为1咖ol/L，同时将含有空白载体pSE380 的菌株作为空白对照。通过SDS-PAGE分析，发现有特异性条带出现。
5、 重组菌粗酶液提取，按照上述方法进行摇瓶培养，将培养诱导所得菌液8000 r/min离心 5min，取菌体沉淀悬浮于PBS缓冲液中，超声波破壁，离心取上清液即得粗酶液。取上清液300 ml通过切向流膜过滤分离系统浓縮纯化分离蛋白酶，最终获得粗酶液20 ml，用于酶学性质等方 面的研究。
6、 以胆固醇为底物进行酶学性质鉴定，将lg胆固醇溶解于含Tween 80、 pH 7. 4的磷酸缓冲溶 液中，与10ml粗酶液混合，常温避光反应12h，反应液用有机溶剂萃取，萃取剂与反应液体积比为 5: 1，萃取温度38 — 40'C，萃取时间50—80 min，用反相高效液相色谱法检测反应结果，检测 发现反应液中有7-脱氢胆固醇，其出峰时间与标品7-脱氢胆固酵一致；所述的萃取的有机溶剂是 石油醚。所述的检测条件为C18柱(5ura， 250咖X4.6鹏)，流动相乙腈-异丙醇(7:3), 柱温30。C，流速l.O mL/min，检测波长280 nm 。
上述第2步中，从己构建的果蝇cDNA文库中获得一种编码7、 8-脱氢酶的基因以及该基因编 码的酶，该酶特征在于此酶由438个氨基酸组成，其分子量为51307.89 Da。此酶被命名为7、 8-脱氢酶。且由下列氨基酸序列组成
5MTSYSRFWMSLLE隨WKPISNDFViaWTLAVTFIRIYWIFFVPLEWKKDLDNEKWSFLRKTENVVCLAHKRD nNRLRKLKIQKIIELPPPYPNGWYGILKSSQLKAGEATCVSCLGEDLKLVIFRSKKDIVFILDAYCPHLGAN SRIGRRVADDCRICPFHQWKFRGGDGLCINIPYSTSVPKVTKLKKWISQVMDGFIFIWYHAEQTELPWDLPVP MGEIADTFVYHGHNEFYTVCHIQEIPENGADEAHFNAAHKKNFINGSWAQKKRLFGLGSH冊KARWSPFTNLS YGKLKYLAEVNLSHTFKLKGKFGCFRMEVSGKQIGPSIVCLEVNSYTFGKIKVFQYITRVEPMLQKVVRSFYG PRWIAPLIPIFIYGEVLMFERDMEIFHHFVF画PILAKEDAS服FRLWFSQFYSSNSKIYSE細IGWSLQ 上述编码7、 8-脱氢酶的基因，其核苷酸序列如下
atgacatca/tactcgcgattttggatg￡LgCatgactggaagccgataaca
aacgacttcgtaatatgcttatggacattggcggtaacctttatacggatttatctaatc
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3gtagt朋ttcacagatcagcagcgaggcaaccaatsttggttggtcgttgc犯本发明的有益效果
1、从果蝇中获取7、 8-脱氢酶基因；
2、 涉及到7、 8-脱氢酶基因的cDNA序列及克隆、与之相对应的蛋白质序列及其在大肠杆 菌中的表达，并且该酶可以转化胆固醇为7-脱氢胆固醇，为生物法合成7-脱氢胆固醇提供一 种新方法。
3、 该方法简单高效，实现7-脱氢胆固醇直接转化，即一步酶法转化胆固醇为7 脱氢 胆固醇，既提高其转化效率、縮短维生素D3的工艺路线、降低生产成本又减少环境污染。
图1为重组质粒EcoR I 、 BamH I双酶切和降落PCR鉴定图。
图2为表达载体物理图谱。
图3为酶促反应液高效液相色谱图。
图4为标品7-脱氢胆固醇高效液相色谱图。
本发明是一种7、 8-脱氢酶的基因克隆与表达，将结合附图简要说明 图1为重组质粒EcoR I 、 BamH I双酶切和降落PCR鉴定图
以重组克隆载体为模板进行降落PCR扩增，回收产物和pSE380分别经过EcoR I和BamH I进 行双酶切，其结果通过0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。 图2为表达载体物理图谱
将重组基因转化入五co7i(DE3)plysS所用的质粒载体是pSE380，该质粒具有如下特征带有 Amp选择标记；4476 bp;被克隆的基因受控于TRC启动子；带有多克隆位点(ploylinker site)。 图3为酶促反应液高效液相色谱图
将酶促反应液预处理后，用反相高效液相色谱法检测反应结果，检测条件为C18柱(5ixtn， 250 mmX4.6咖)，流动相乙腈-异丙醇(7:3)，柱温30。C，流速1. 0 mL/min，检测波长280 ntn 。 图4为标品7-脱氢胆固醇高效液相色谱图
标品7-脱氢胆固醇的反相高效色谱法检测结果，检测条件为C18柱(5ym， 250 mmX4. 6mm)， 流动相乙腈-异丙醇(7 : 3)，柱温30。C,流速l.O mL/min，检测波长280 nm 。
具体实施例方式
以下通过实施例对本发明做进一步的描述 实施例l
1文库来源和质粒
7果蝇cDNA文库和pSE380均由本实验室保存。 2主要试剂
pGM-TSimple连接试剂盒购自天根生化科技有限公司，BioSpin胶回收试剂盒、BioSpinPCR 产物纯化试剂盒均购自杭州博日科技有限公司。EcoR I和BamH I酶均购自Fermentas公司。 3方法
3.1基因的克隆与测序
以自行设计的引物进行PCR扩增，上游引物5- GGGGMTTCCCTACTAGAAAATGACTGGMGC -3，下游引物为5-GGGGGATCCTTTTGCAACATAGGTTCGACC-3。采用25uL的反应体系10Xbuffer 2. 5 uL， dTNPO. 5txL，正反向引物各0. 5 n L， cDNA模板0.5yL， rTaq酶0. 25uL，补水至25uL。 降落PCR条件为95'C 5 min, 94°C 50 s， 59'C 45 s， 72'C 2 min;先循环5次，每次下降 一度；然后94°C 50 s, 54'C 45 s， 72'C 2 min循环25次。PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电 泳检测，回收后与pGM-Tvector连接，得到重组质粒。连接体系为pGM-T vector 1 u L, PCR产物5 UL， 10XT4 ligase buffer 1 u L, T4 DNA连接酶1 w L,双蒸水2uL, 16°C连接过夜。用连接 液转化感受态E. coh'DH5a ，在含Amp、 IPTG、 X-gal的LB平板上挑取白色菌落，接种于含Amp的 LB培养基中，抽提质粒进行PCR和酶切验证、测序。
3. 2 pSE380表达载体的构建
根据上述扩增得到的片段，采用上述设计的引物进行片段的扩增。以重组克隆载体为模板进行 降落PCR扩增，见附图l。回收产物和pSE380分别经过EcoR I和BamH I进行双酶切，回收后连 接，转化f. cW/DH 5o， Amp抗性筛选，抽提重组质粒进行PCR，酶切鉴定，将鉴定后的重组质 粒测序，进一步验证。
3.3 ￡coJ/ BL21(DE3)plysS的转化和7、 8-脱氢酶的诱导表达
将重组pSE380转化感受态的BL21(DE3)plysS，取160yL转化液涂布于LB(含氨苄青霉素 0. lg/tnl)平板上，37'C培养至出现单菌落，并用含有空白载体pSE380的菌株作为空白对照。从转化 平板上挑取单菌落到5mL LB (含Amp 100ng/mL)液体培养基中，37°C 220 r/min摇床培养至0D6。。 =0.6左右，添加IPTG (异丙基-e-D-硫代半乳糖苷)至终浓度为1 mmol/L进行诱导表达，同时将 含有空白载体PSE380的菌株作为空白对照。通过SDS-PAGE分析，发现有特异性条带出现。
3.4重组菌粗酶液提取
按照上述方法进行摇瓶培养，将培养诱导所得菌液8000 r/min离心5 min，取菌体沉淀悬浮于 PBS缓冲液中，超声波破壁，离心取上清液即得粗酶液。取上清液300ml通过切向流膜过滤分离系 统浓縮纯化分离蛋白酶，最终获得粗酶液20 ml,用于酶学性质等方面的研究。
3.5以胆固醇为底物进行酶学性质鉴定将1 g胆固醇溶解于含Tween 80、 pH 7.4的磷酸缓冲溶液中，与10 ml粗酶液混合，常温 避光反应12 h。反应液用有机溶剂萃取，萃取剂(石油醚)与反应液体积比为5: 1，萃取温度38 一40'C，萃取时间50—80 min。为提高收率，可重复萃取2-3次。用反相高效液相色谱法检测反 应结果，检测条件为C18柱(5um， 250mmX4.6mra)，流动相乙腈-异丙醇(7:3)，柱温3(TC， 流速1.0 mL/min,检测波长280 nm 。检测发现反应液中有7-脱氢胆固醇，其出峰时间与标品7-脱氢胆固醇一致，结果参见附图3，图4。
权利要求
1、一种编码7、8-脱氢酶的基因，是从已构建的果蝇cDNA文库中获得，其特征在于该基因编码的酶由438个氨基酸组成，其分子量为51307.89Da，氨基酸序列组成如下MTSYSRFWMSLLENNWKPISNDFVICLWTLAVTFIRIYWIFFVPLEWKKDLDNEKWSFLRKTENVVCLAHKRDTINRLRKLKIQKIIELPPPYPNGWYGILKSSQLKAGEATCVSCLGEDLKLVIFRSKKDIVFILDAYCPHLGANSRIGRRVADDCRICPFHQWKFRGGDGLCINIPYSTSVPKVTKLKKWISQVMDGFIFIWYHAEQTELPWDLPVPMGEIADTFVYHGHNEFYTVCHIQEIPENGADEAHFNAAHKKNFINGSWAQKKRLFGLGSHHWKARWSPFTNLSYGKLKYLAEVNLSHTFKLKGKFGCFRMEVSGKQIGPSIVCLEVNSYTFGKIKVFQYITRVEPMLQKVVRSFYGPRWIAPLIPIFIYGEVLMFERDMEIFHHFVFNRNPILAKEDASIKKFRLWFSQFYSSNSKIYSEATNIGWSLQ
2、 根据权利要求1所述的编码7、 8-脱氢酶的基因，其特征在于其核苷酸序列如 下所示atgacatcat actcgcgatt ttggatgagc ctactagaaa atgactggaa gccgataaca aacgacttcg taatatgctt atggacattg gcggtaacct ttatacggat ttatctaatc ttttttgttc cactagaatg gaaaaaggat ttggacaacg aaaaatggtc atttttaagg aaaacagaaa atgtcgtttg cttggctcat aaacgagata ccataaaccg attaagaaaa ttaaaaattc aaaaaatcat cgaactacct cccccttatc caaeitggctg gtatggtatc ctcaaatcgt ctcagcttaa agctggggaa gcaacttgtg tgtcatgctt gggcg肪gat ctcaaactag tcatctttcg ttcaaagaaa gatatcgtgt ttattctgga tgcttattgc cctcacctag gagccaactc ccgtattggt aggcgcgttg ctgacgactg taggatatgc ccattccacc agtggaagtt cagaggcggt gatgggcaat gcattaacat accgtactca accagtgtgt tgaaggtaag aaagctgaag aaatggatca gtcaagtcat ggatggcttc atattcatct ggtaccacgc agagcacacg gagctgccat gggacctccc tgtcccaatg ggggagattg ccgatacatt tgtctatcac ggacacaatg agttttacac cgtttgccat attcaagaga taccggaaaa cggcgctgat gaagcgcact ttaatgccgc tcacaagaaa aattttatta atggcagttg ggctcaaa犯aaaagattgt ttggacttgg atctcatcat tggaaagcga ggtggtcccc atttaccaat cttagctacg gaaaattaaa atacttggcg gaagtaaacc taagtcatac atttaaacta aaaggaaagt tcggctgttt "tcgtatggaa gtttctggca aacagattgg accatcaatc gtgtgccttg犯gttaattc atatacattt ggaaaaatta aagttttcca atatattaca cgggtcgaac ctatgttgca aaaagttgtt cgatcgtttt atggtcctcg ttggattgcg ccacttatcc caatatttat ttatggagag gtcctgatgt ttgagcgtga catggagatc ttccaccact tcgtcttcaa tcgaaacccg attctggcaa acgaggacgc gagcatga犯aaattcagac tctggtttag ccagttatac agtagtaatt cacagatcag cagcgaggca accaatattg gttggtcgtt gcaa
3、 一种重组质粒，其特征在于它含有权利要求1或2所述的基因。
4、 根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于所述的基因连接在pSE380上。
5、 一种基因工程菌，其特征在于它被根据权利要求3或4所述重组质粒转化。
6、 根据1权利要求1所述的编码7、 8-脱氢酶基因的克隆与表达的方法，其特征在于(1) 从果蝇中获取cDNA文库和pSE380质粒，保存于实验室中；(2) 基因的克隆与测序，自行设计的引物进行PCR扩增，PCR产物经0. 8%琼脂糖凝胶电泳 检测，回收后与pGM-T vector连接，得到重组质粒，用连接液转化感受态￡ co力'DH5 a ,在含 A卿、IPTG、 X-gal的LB平板上挑取白色菌落，接种于含Amp的LB培养基中，抽提质粒进行PCR 和酶切验证、测序；(3) 根据上述扩增得到的片段，釆用上述设计的引物进行片段的扩增。以重组克隆载体为模 板进行降落PCR扩增，回收产物和pSE380分别经过EcoR I和BamH I进行双酶切，回收后连接， 转化f co"DH5ci， Amp抗性筛选，抽提重组质粒进行PCR，酶切鉴定，将鉴定后的重组质粒测 序，进一步验证；(4) 《co7iBL21(DE3)plysS的转化和7、 8-脱氢酶的诱导表达，将重组pSE380转化感受态 的BL21，取160 uL转化液涂布于LB平板上，35—38'C培养至出现单菌落，并用含有空白载体 pSE380的菌株作为空白对照。从转化平板上挑取单菌落到5 mL LB液体培养基中，35 —38°C , 摇床培养至0D卿^0.6左右，添加IPTG至终浓度为l咖ol/L，同时将含有空白载体pSE380的菌株 作为空白对照。通过SDS-PAGE分析，发现有特异性条带出现；(5) 重组菌粗酶液提取，按照上述方法进行摇瓶培养，将培养诱导所得菌液8000 r/min离 心5min，取菌体沉淀悬浮于PBS缓冲液中，超声波破壁，离心取上清液即得粗酶液。取上清液300 ml通过切向流膜过滤分离系统浓縮纯化分离蛋白酶，最终获得粗酶液20 ml，用于酶学性质等方 面的研究；(6) 以胆固醇为底物进行酶学性质鉴定，将1 g胆固醇溶解于含Tween80、 pH 7. 4的磷酸 缓冲溶液中，与10 ml粗酶液混合，常温避光反应12 h，反应液用有机溶剂萃取，萃取剂与反应 液体积比为5: 1，萃取温度38—40'C，萃取时间50—80 min，用反相高效液相色谱法检测反应 结果，检测发现反应液中有7-脱氢胆固醇，其出峰时间与标品7-脱氢胆固醇一致；所述的萃取的 有机溶剂是石油醚；所述的检测条件为C18柱5um, 250 mX4.6 ran,流动相乙腈-异丙醇 为7 : 3,柱温3(TC，流速l.O mL/min，检测波长280 nm 。
全文摘要
本发明是针对一种7、8-脱氢酶基因的克隆与表达，该编码7、8-脱氢酶的基因是从已构建的果蝇cDNA文库中获得，该酶可以转化胆固醇为7-脱氢胆固醇，为生物法合成7-脱氢胆固醇提供一种新方法，得到的可以缩短维生素D<sub>3</sub>的工艺路线，降低生产成本，减少环境污染。
文档编号C12N1/00GK101509004SQ20091011393
公开日2009年8月19日 申请日期2009年3月24日 优先权日2009年3月24日
发明者何鑫平, 吴孔阳, 夏小斌, 超 康, 张云开, 李湘萍, 李灿明, 梁智群, 晟 汪, 陈桂光, 黄时海 申请人:广西大学