专利名称：一种牛传染性鼻气管炎病毒的检测方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于病毒检测领域，具体涉及病毒性传染病的检测方法，特别是涉及一种
牛传染性鼻气管炎病毒的检测方法及应用领域。
背景技术：
牛传染性鼻气管炎(Infectious bovine rhinotracheitis， IBR)是由牛疱疹病毒 l型(Bovineherpes virus 1)引起的牛的一种病毒性传染病，牛疱疹病毒1型简称BHV-1 。 发病牛常出现严重的呼吸道感染、结膜炎、脑炎、产奶下降、子宫炎、肠炎和流产等临床症 状。该病世界范围内分布广泛，我国部分省区的血清学调查也表明该病的存在。世界动物 卫生组织(0IE)将IBR列为B类动物疫病，我国动植物检疫法中也明确规定，进出口牛必须 检测IBR，以便控制本病的发生与流行。 目前，BHV-1常用的检测方法有病毒分离和血清抗体检测，血清抗体检测不利于 BHV-1急性感染或早期感染的诊断；病毒分离存在检测时间长，灵敏度较低，且存在样品的 细胞毒性等诸多弊端，不利于病毒分离试验的操作。随着分子生物学技术的迅速发展，荧光 PCR检测技术的应用极大的提高了检测效率和检测灵敏度。但由于样品中存在大量复杂的 未知成分，以及样品处理过程中， 一些物质的残留会影响PCR扩增，使反应测得的灵敏度降 低甚至造成假阴性结果，对于荧光PCR检测，无法正确确定目的基因拷贝数。
经检索，国内外也未见有关检测灵敏度高，特异性好，操作方便且能够指示并校准 假阴性结果，提高准确率的检测BHV-1的荧光定量PCR检测方法的报道。因此，探索和研究 检测灵敏度高，特异性好，操作方便且能够指示并校正假阴性结果的方法，对于及时准确有 效的检测BHV-1，保护畜牧业健康发展、促进我国农产品出口和保护我国在国际贸易中的良 好形象等方面均具有重要意义。
发明内容
针对目前未见有关检测灵敏度高，特异性好，操作方便且能够指示并校正假阴性 结果，提高准确率的检测BHV-1的荧光定量PCR方法。本发明通过引物和探针设计，用搭桥 法PCR扩增，获得了 BHV-1荧光定量PCR扩增内标模板，并对内标模板的添加量和反应条件 进行了优化，建立了含有内标物的荧光定量PCR检测体系，从而实现对BHV-1的灵敏、高效、 快速、准确检测。 本发明的目的在于提供了一种检测灵敏度高、特异性好、试验周期短，且能够指示 并校正假阴性结果，确保PCR检测准确性的BHV-1检测方法。 本发明提供了一种牛传染性鼻气管炎病毒确证和准确定量的快速检测方法。
本发明的技术方案通过建立了一种牛传染性鼻气管炎病毒的检测方法，采用在 PCR反应体系中加入指示假阴性的扩增内标(internal amplificationcontrol， IAC)，通过 碱基重排、引物设计和搭桥法PCR扩增，构建了一条IAC片段，经条件优化，成功的构建了含 有内标的荧光定量PCR反应体系，可以显示抑制成分的存在或指示假阴性结果的发生，实现对试验过程实施监测，确保检测质量。
本发明具体提供了一种牛传染性鼻气管炎病毒检测方法，具体步骤如下
1.引物和探针的设计与合成根据BHV-lgB基因序列设计扩增出141bp的特异性引物Ip2、 Ir2和荧光探针 ITpro，模板构建引物Ipl和Irl，其中Ipl、Irl位于Ip2、Ir2外侧，扩增出长度为787bp的 片段。将探针ITpro序列进行重排，设计引物Icl和Ic2，利用碱基突变原理，通过人为添加 的接头序列，构建内标探针ICpro。
2.目标DNA模板的制备 将BHV-1经细胞培养增殖，冻融后取上清液用DNAZol提取液提取病毒DNA ;精液 用S印hacryl S-400凝胶过滤后，用DNAZol进行核酸提取。 以病毒DNA为模板，用Ipl、 Irl为扩增引物，反应条件为95 °C变性5min ; 96°C lmin，5(TC lmin，72°C 2min，35个循环；最后在72"C延伸10min。扩增产物经凝胶纯化 回收，连接到pMD18-T载体上，转化DH5a感受态细胞，提取质粒，经酶切、PCR及测序鉴定 后，命名为pMD18-IT，简称IT。
3.搭桥法PCR扩增和内标探针的设计 以质粒IT为模板，分别采用引物Ipl、 Icl和Ic2、 Irl为配对引物进行PCR扩增， Ipl、 Icl的扩增条件为95。C 5min ;96。C lmin，56。C 45s，72。C 45s，35个循环；72。C 10min ; Ic2、Irl的扩增条件为95。C 5min ;96。C lmin，62。C 45s，72。C 45s，35个循环；72。C 10min。 扩增产物分别命名为Iplcl、 Ic2rl。 将Iplcl、Ic2rl等量混合后作为模板，用引物Ipl和Irl进行PCR扩增，反应条件 为95t:变性5min ;96°C lmin，5(TC lmin，72°C 2min，35个循环；最后在72。C延伸10min。 将扩增后的产物纯化回收并连接到pMD18-T载体上，转化DH5a感受态细胞，提取质粒，经 酶切、PCR及测序鉴定正确后，命名为pMD18-IC，简称IC。
4.单重荧光PCR扩增体系的建立 以IT和IC为模板，分别以Ipl、 Irl、 ITpro和Ipl、 Irl、 ICpro为引物和探针进 行扩增，dNTP浓度为0. 15 3. 0mmol/L，引物浓度为0. 2 0. 6mmol/L，探针浓度为0. 1 0. 4mmol/L，Mg2+浓度为1. 0 4. 0mmol/L，Taq DNA聚合酶为1. 25 2. 5u， Tm为59 61°C ， 循环参数为40、45和50，优化一项时其他参数不变。 5.分别以不同浓度的IT与IC混合物为模板，以Ipl、Irl、ITpro和ICpro为引物 和探针进行荧光PCR共扩增，确定共扩增反应体系中IC模板的添加浓度。
本发明中，参照基因库中编号为AJ004801. 1的BHV-lgB基因序列设计引物和荧光 探针，该BHV-1基因序列长135305bp，本领域普通技术人员可以通过公众的渠道获知。
本发明中，以BHV-1基因为模板，用引物Ipl和Irl扩增出长度为787bp的片段， 该片段克隆至pMD-18T载体，得到目标模板pMD18-IT，简称IT。 本发明中，以IT为模板，用引物Ip2和Ir2扩增出长度为141bp的荧光PCR扩增 片段。 本发明中，以IT为模板，用引物Ipl、 Icl和Ic2、 Irl分别扩增出长度为227bp和 588bp片段，命名为Iplcl和Ic2rl。 本发明中，以Iplcl、Ic2rl等量混合物为模板，用引物Ipl和Irl进行PCR扩增出
4长度为787bp的片段，该片段克隆至pMD-18T载体，得到内标模板pMD18-IC，简称IC。
同时，本发明充分考虑到，当IC和IT两模板同时扩增时，会竞争酶、引物和探针，对扩增产生影响，对共扩增体系的反应条件和检测低限进行了优化研究。取106 101拷贝/PL浓度的IT与IC混合物，以Ipl、Irl、ITpro和ICpro为引物和探针进行荧光PCR共扩增，经优化，共扩增体系中内标模板添加浓度为每个反应102拷贝，Mg2+2. 0mmol/L， dNTP各0. 3mmol/L，引物各0. 5mmol/L，探针各0. 2mmol/L，扩增条件为50。C，2min，1个循环;95。C，5min，l个循环；95。C 15s，60。C 60s，45个循环。 进一步，本发明对牛传染性鼻气管炎病毒检测方法的特异性和可重复进行了确证，并建立了标准曲线。 用本发明提供的扩增体系分别扩增了 BVDV、 BLV、 BTV、 PRV、 MDV等核酸样品，被测样品均没有阳性扩增曲线，表明该方法具有较好的特异性。 用本发明提供的扩增体系，以102拷贝/反应的IC模板分别与105、102和10^考贝/反应的IT进行多次重复性扩增检测，对不同试验获得的C t值标准差和变异系数进行分析，不同试验获得的Ct值变异系数为0. 38 2. 8，表明该方法具有较好的重复性。
进一步，本发明通过对106 101拷贝/反应浓度的IT与体系中添加浓度为102拷贝的IC共扩增，建立了 BHV-1荧光PCR共扩增检测标准曲线。
通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下有益效果。 1.检测时间短传统的病毒分离法对BHV-1的检测时间至少要在7d以上，该发明检测时间包括样品前处理到获得检测结果在2h之内，比常规的PCR检测方法至少也要縮短30min。 2.检测灵敏度高该方法可检测到10个拷贝的重组质粒和0. 01TCID5。的病毒粒子，灵敏度比常规PCR和病毒分离高10 IOO倍。 3.特异性好通过对BVDV、BLV、BTV、PRV、MDV和BHV-1等相关病毒核酸样品检测，只有BHV-1检测为阳性。 4.重复性好通过对不同滴度的病毒进行三次重复性检测，不同试验获得的Ct值变异系数为0. 38 2. 8%，均在10%之内。 5.稳定性高通过对样品的重复性检测，均得到一致性结果。 6.污染少与普通PCR检测相比，整个反应在同一个封闭的管内进行，减少了电泳步骤造成的污染。 7.可进行实时监测和定量检测通过仪器对每个扩增中产生荧光信号的接收，实现对整个反应过程的实时监测和结果的定量检测。
8.可指示假阴性结果的发生因该反应体系中的内标模板随着反应启动而进行
扩增，如果被测样品和内标模板均没有扩增曲线，说明该检测结果为假阴性结果。
9.流程简单操作性强，易于掌握，只要具备分子生物学基础知识，无需良特别的
训练便能很好完成。
10.成本低使用的试剂为分子生物学常用试剂，价格便宜，易于采购，用量少。
11.内标模板设计合理通过碱基重排和搭桥法PCR扩增，构建的内标模板两端序列与目的基因序列完全一致，只在探针结合部位序列发生了改变，使之只能与内标探针结合，内标片段的碱基序列与目的基因的性质也基本完全相同，与同一对引物结合，因此内标
5片段与目的基因有同样的扩增效率，确保了共扩增的进行。 12.内标模板的添加量合理添加内标模板为102个拷贝的重组质粒，该浓度即能达到对反应过程的监测，又不影响对目标模板荧光定量PCR的扩增检测。 13.实用价值高实现对试验过程实施监测，有效的解决了传统检测方法中存在的假阴性结果，可以对实验室进行质量监控，确保检测结果的准确性。 14.应用效果好用该发明方法对临床收集的40份牛精液和10份牛鼻腔拭子用该体系进行检测，均得到预期结果。 15.借鉴意义大该方法的建立，为相关病毒检验检疫技术的研究提供了较好的借鉴意义。并为规范检测试剂向标准化水平的发展具有指导借鉴意义。 16.应用前景广阔该方法能够广泛应用于出入境检验检疫部门、畜牧兽医部门和养殖单位，为疫病的有效防控具有重要意义。
图1所示为BHV-IPCR扩增结果，其中，1，2为引物Ipl禾P Irl对BHV-1PCR扩增产物(787bp) ， M为DL 2000marker。 图2所示为重组质粒PCR扩增结果，其中，1为引物Ipl和Irl对重组质粒PCR扩增产物(787bp) ， M为DL2000marker。 图3所示为重组质粒酶切鉴定结果，其中，1，2为重组质粒酶切产生的片段，M为DL2000marker。 图4所示为Iplcl和Ic2rlPCR扩增结果，其中，1，2为引物Ipl和Icl对IT的扩增结果(227bp) ，3，4为引物Ic2和Irl对IT的扩增结果(588bp) ， M为DL 2000marker。
图5所示为引物、探针相对模板位置。
图6所示为IT和IC模板荧光PCR扩增部分序列示意图。 图7所示为ITpro(图A)和ICpro(图B)荧光定量PCR扩增曲线，其中，1为IT(图A)和IC(图B) ;2为IC(图A)和IT(图B);结果表明，探针针对各自模板具有较好的特异性。 图8所示为102拷贝/反应的IC与系列梯度稀释的IT共扩增曲线，其中，1-6为K)6-101拷贝/反应的IT(图a)和对应的IC(图b)扩增曲线。
图9所示为共扩增标准曲线。 图10所示为共扩增体系的重复性试验，其中，1-3分别为105， 102， 101拷贝/反应的IT(图A)和对应的IC(图B)扩增曲线。
具体实施例方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
本发明中选用的病毒、样品和菌种 BHV-lBarta Nu/67致弱毒株和MDBK牛肾传代细胞购自中国兽医药品监察所，牛精液、拭子和血清等样品采自某牛场。 牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛白血病病毒(BLV)、蓝舌病病毒(BTV) 、 口蹄疫病毒(FMDV)、伪狂犬病病毒(PRV)、马立克病病毒(MDV)等核酸样品由本实验室保存，本领域普通技术人员也可获得。 本发明中选用的主要试剂 DNA Zol(DP3002)、质粒制备试剂盒(DP1001)为百泰克公司产品；pMD18-T载体(D101A)、凝胶纯化回收试剂盒(DV805A) 、DH5 a感受态细胞、Taq DNA聚合酶、引物、TaqMan探针等均为珍宝生物工程(大连)有限公司产品。
本发明中选用的主要仪器 倒置显微镜(Leica DMI 6000B)，微量加样器(Eppendorf)，高速冷冻离心(HITACHI CF16RX)，荧光PCR仪(ABI7300) ， PCR仪(Biometra)，电泳仪(Bio-RADM0DEL200)，数字图像分析仪(Alpha innotech corporation IS-2200) ， Lambda35紫外分光光度计等。 本发明中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实
施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。 本发明中参照基因库中编号为AJ004801. 1的BHV-lgB基因序列设计引物和荧光
探针，本领域普通技术人员可以通过公众的渠道获知。 实施例一 牛传染性鼻气管炎病毒的检测 1.引物和探针的设计与合成 根据BHV-lgB基因序列设计扩增出141bp的特异性引物Ip2、 Ir2和荧光探针ITpro，模板构建引物Ipl和Irl，其中Ipl、Irl位于Ip2、Ir2外侧，扩增出长度为787bp的片段。将探针ITpro序列进行重排，设计引物Icl和Ic2，利用碱基突变原理，通过人为添加的接头序列，构建内标探针ICpro。
2.目标DNA模板的制备 将BHV-1经细胞培养增殖，冻融后取上清液用DNAZol提取液提取病毒DNA ;精液用S印hacryl S-400凝胶过滤后，用DNAZol进行核酸提取。 以病毒DNA为模板，用Ipl和Irl为扩增引物，反应条件为95。C变性5min ;96°C lmin，5(TC lmin，72°C 2min，35个循环；最后在72"C延伸10min。扩增产物经凝胶纯化回收，连接到pMD18-T载体上，转化DH5a感受态细胞，提取质粒，经酶切、PCR及测序鉴定后，命名为pMD18-IT(简称IT)。
3.搭桥法PCR扩增和内标探针的设计 以质粒IT为模板，分别采用引物Ipl、 Icl和Ic2、 Irl为配对引物进行PCR扩增，Ipl、 Icl的扩增条件为95。C 5min ;96。C lmin，56。C 45s，72。C 45s，35个循环；72。C 10min ;Ic2、Irl的扩增条件为95。C 5min ;96。C lmin，62。C 45s，72。C 45s，35个循环；72。C 10min。扩增产物分别命名为Iplcl、 Ic2rl。 将Iplcl和Ic2rl等量混合后作为模板，用引物Ipl和Irl进行PCR扩增，反应条件为:95。C变性5min ;96。C lmin，50。C lmin，72。C 2min，35个循环；最后在72。C延伸10min。将扩增后的产物纯化回收并连接到pMD18-T载体上，转化DH5 a感受态细胞，提取质粒，经酶切、PCR及测序鉴定正确后，命名为pMD18-IC(简称IC)。
4.单重荧光PCR扩增体系的建立 分别以IT和IC为模板，分别以Ipl、Irl、ITpro和Ipl、 Irl、 ICpro为引物和探针进行扩增，dNTP浓度为O. 15 3. 0mmol/L，引物浓度为0. 2 0. 6mmol/L，探针浓度为0. l 0. 4mmol/L，Mg2+浓度为1. 0 4. 0mmol/L，Taq DNA聚合酶为1. 25 2. 5u， Tm为59 61°C ，循环参数为40、45和50，优化一项时其他参数不变。 5.分别以不同浓度的IT与IC混合物为模板，以Ipl、Irl、ITpro和ICpro为引物
和探针进行荧光PCR共扩增，确定共扩增反应体系中IC模板的添加浓度。 进一步，本发明分别取106 101拷贝/y L浓度的IT与IC混合物，以Ipl、 Irl、
ITpro和ICpro为引物和探针进行荧光PCR共扩增，经优化，共扩增体系中内标模板添加
浓度为每个反应102拷贝，Mg2+2. 0mmol/L， dNTP各0. 3mmol/L，引物各0. 5mmol/L，探针各
0. 2mmol/L，扩增条件为50。C，2min， 1个循环；95。C，5min， 1个循环；95。C 15s，60。C 60s，45
个循环。本发明中的引物代号、序列、位置见表1。其中，参照基因库中编号为AJ004801. 1
的BHV-lgB基因序列设计引物和荧光探针，该BHV-1基因序列长135305bp，本领域普通技术
人员可以通过公众的渠道获知。 表1 :引物代号、序列、位置及核苷酸数
code Se，€B Loeati纖〖A，幅歸l.1》 :、u"濯，___，.隱l eyjp...
lplCGG TCT CCT TTG CCT TCG57291-57308謂
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TAG A-I2('LIPS 实施例二 目标模板的获得 将BHV-1经细胞培养增殖，冻融后取上清液用DNAZol提取液提取病毒DNA，精液用S印hacryl S-400凝胶过滤后，用DNAZol进行核酸提取。 以病毒DNA为模板，用Ipl、Irl为扩增引物进行PCR扩增，20 y L反应体系，其中Mg2+1. 5mmol/L， dNTP各0. 25mmol/L，引物各lmmol/L， Taq DNA聚合酶1. 25u，模板5ii L。扩增条件为:95。C变性5min ;96。C lmin，50。C lmin，72。C 2min，35个循环；最后在72。C延伸10min。扩增产物用1%琼脂糖电泳，并凝胶纯化回收，连接到pMD18-T载体上，转化DH5a感受态细胞，提取质粒进行PCR、酶切及测序鉴定。 1.重组质粒的PCR扩增鉴定筛选电泳时较阴性移动慢的重组质粒10倍稀释后，取1 y L为模板，加入2. 0 ii L 10 XPCR缓冲液，2 ii L dNTP (2. 5mM)混合物，0. 25 y L Taq DNA聚合酶(5u/ ii L)，上、下游引物(10pmoL)各2 y L，补水至20 y L体积进行PCR扩增，扩增条件同上，1 %琼脂糖凝胶电泳检测。 2.重组质粒的酶切鉴定在0. 5mL管中加入10X限制性内切酶缓冲液(bufferE)liiL，BamHI禾PHind III酶(12u/iiL)各0. 5 ii L，BSA (10mg/mL) 0. 25 ii L，质粒DNA 4yL，灭菌水补至lOii L，离心混合均匀，置37t:水浴消化2h，65t:水浴10min灭活内切酶，加入2 ii L6 X上样buffer, 1 %琼脂糖凝胶电泳检测。
8
3.重组质粒的测序将PCR扩增、酶切鉴定均为阳性的质粒克隆，过夜培养，提阳 性质粒测序。 琼脂糖凝胶电泳表明，以BHV-1全基因DNA为模板，Ipl和Irl为引物，扩增出大 小相符的7S7bp片段，重组质粒经引物Ipl和Irl PCR扩增和酶切鉴定均得到787bp片段， 测序鉴定均正确。经鉴定正确的重组质粒即为目标模板，命名为pMD18-IT，简称IT。结果 参见附图1、2、3。 实施例三内标模板的构建 以质粒IT为模板，分别采用引物Ipl、 Icl和Ic2、 Irl为配对引物进行PCR扩增， 20ii L反应体系，其中Mg2+1. 5mmol/L， dNTP各0. 25mmol/L，引物各1,1/L， Taq酶1. 25u， 模板5ii 1。 Ipl、 Icl扩增条件为95°C 5min ;96°C lmin，56。C 45s，72。C 45s，35个循环； 72°C 10min。 Ic2、 Irl扩增条件为95°C 5min ;96°C lmin，62。C 45s，72。C 45s，35个循环； 72°C 10min。分别扩增出大小为227bp和588bp的片段，并命名为Iplcl和Ic2rl，参见附 图4。 将Iplcl、 Ic2rl等量混合后作为模板，用引物Ipl和Irl进行PCR扩增，反应体 系和扩增条件同实施例一、二。将扩增后的产物纯化回收并克隆至pMD18-T载体，同实施例 一、二转化DH5a感受态细胞，提取质粒，经酶切、PCR及测序鉴定正确后，命名为pMD18-IC， 简称IC。 Icl和Ic2拼接部分即为内标探针序列。 各引物、探针相对模板位置及内标模板构建图参见附图5。 IT、IC荧光PCR扩增部
分序列如下，可参见附图6。 IT sequence : 1 GCTCGCGGAG CTGGAGGTGA T |CiJC c5iC7^f*f*....3^ flp(S!JC^,...jJC^fT(^JC^ G TTCTGGAGGA61 CCGCGAGTTC TTGCCGCTAG AAGTGTACAC GCGCGCCGAG CTCGCCGACA CGGGTCTGCT
121CGACTACAGC GAGATACAGC G
IC sequence : 1 GCTCGCGGAG CTGGAGGTGA T jrCC-4CCC7TGC44rCCTCGrCG70^G4 G TTCTGGAGGA61 CCGCGAGTTC TTGCCGCTAG AAGTGTACAC GCGCGCCGAG CTCGCCGACA CGGGTCTGCT 121 CGACTACAGC GAGATACAGC G 实施例四单重荧光PCR扩增体系的建立 分别以IT和IC为模板，分别以Ipl、Irl、ITpro和Ipl、 Irl、 ICpro为引物和探针
进行扩增，25 ii L反应体系，其中Mg2+1. 5mmol/L， dNTP各0. 2mmol/L，引物各0. 4mmol/L，探
针0. 2mmol/L， Taq DNA聚合酶1. 25u，模板1 ii L，扩增条件为50。C，2min， 1个循环；95。C，
5min，l个循环；95°C 15s，6(TC 60s，45个循环。结果表明，探针针对各自模板具有较好的特
异性，扩增曲线参见附图7。 实施例五共扩增检测低限的测定 当IC和IT两模板同时扩增时，会竞争酶、引物和探针，对扩增产生影响，应该重新 研究共扩增体系的反应条件和检测低限。 分别取106 101拷贝/y L浓度的IT与IC混合物，以Ipl、 Irl、 ITpro和ICpro增。由于IC与IT在同一反应中进行扩增，检测引物也相 同，二者会对底物、引物、酶等进行竞争，因此，选择适宜浓度的IC片段添加到荧光定量PCR 检测体系至关要。经优化，本发明的共扩增体系中选择内标模板添加浓度为每个反应102拷 贝，Mg2+2. 0mmol/L， dNTP各0. 3mmol/L，引物各0. 5mmol/L，探针各0. 2mmol/L，其余条件同 实施例四，扩增曲线参见附图8。
实施例六标准曲线的建立 取106 1(^拷贝/ii L浓度的IT与IC混合物，以Ipl、Irl、ITpro和ICpro为引物 和探针进行荧光定量PCR共扩增，经优化，共扩增体系最终选择内标模板添加浓度为每个 反应1()2拷贝，其中Mg2+2. 0mmol/L，dNTP各0. 3mmol/L，引物各0. 5mmol/L，探针各0. 2,1/ L，扩增条件为50。C，2min，1个循环；95。C ， 5min， 1个循环；95。C 15s，60。C 60s， 45个循环。 以IT的扩增曲线制定标准曲线，参见附图9。从获得的标准曲线可以看出，在所测的浓度范 围内，标准品的浓度与对应的Ct值呈现明显的线性相关关系，其回归曲线的斜率为-3. 42， 截距为35. 61，相关系数R2为0. 9997，该系数大于0. 95，且各稀释度的扩增点均合理分布于 标准曲线上，表明该研究获得的标准曲线良好。
实施例七方法的特异性检测 以实施例六中的反应体系和扩增条件分别扩增了 BVDV、BLV、BTV、PRV、MDV等核酸 样品，被测样品均为阴性，说明方法具有较好的特异性。
实施例八重复性检测 以实施例六中的反应体系和扩增条件分别对105、102和10拷贝/反应的IT进行 多次重复性扩增检测，不同试验获得的Ct值变异系数为0. 38 2. 8，均在10%以内，表明 该方法具有很好的重复性和稳定性，扩增曲线参见附图10。
实施例九方法的灵敏度比较
1.与病毒分离方法的比较 取103-10—4TCI D5。/50iiL的BHV-l分别用本发明建立的荧光定量PCR方法进行检 测，荧光PCR以出现S型扩增曲线，Ct < 40，且阴性对照和空白对照均没有扩增曲线和Ct 值，但对应的内标模板有S型扩增曲线作为阳性判定标准。病毒分离用含2%胎牛血清的 MEM维持液代替上述MEM进行10倍系列稀释，每个稀释度各取50uL进行病毒分离。将上 述病毒分离样品接种8孔96孔单层MDBK细胞，每个梯度接种8 L37。C吸附lh，加入维持 液150uL/孔，37吸附lh，加入150u1/孔维持液，置C02培养箱7d，以出现CPE的最高稀释 倍数作为病毒分离的灵敏度。该荧光PCR方法可检测到0. 01TCID5。的病毒含量，而病毒分 离方法对于O. 1TCID50的病毒含量的细胞孔只有3个孔出现CPE，该荧光PCR方法比病毒分 离方法灵敏度至少高10倍以上，结果见表2。
2.与普通PCR和不含内标的荧光PCR检测比较 将上述系列稀释样品提取的DNA用Ipl和Irl为引物进行普通PCR扩增，反应体 系和扩增条件同实施一、二，反应产物凝胶电泳检测，扩增出长度为787bp的特异性片段， 以呈阳性反应的最高稀释度作为检测灵敏度。同时用实施例四建立的不含内标的荧光PCR 法检测。结果显示该含内标的荧光PCR方法检测灵敏度比普通PCR灵敏度高IOO倍，该灵 敏度与不含内标的荧光PCR灵敏度相当。
表2 :BHV1内标荧光PCR方法与病毒分离试验比较
10
TCID 10310210，10°w-，10310-4
荧光定1—PCR U'l )1.5,34腦722.1826.1829.2534.21〉45>45
病毒分离出现细胞888300
病变的孔数 实施例十对临床样品的检测 分别向经本发明建立的内标法荧光PCR扩增为阴性的MEM、牛血清、新鲜牛精液和 冻存牛精液中添加已知量的病毒，用该内标法荧光PCR方法进行检测，结果显示该内标荧 光PCR方法可对上述样品的检测灵敏度约为0. 01TCID50/反应。对临床收集的40份牛精 液(其中8份已经鉴定为阳性)和IO份牛鼻腔拭子(其中3份已经鉴定为阳性)用该体 系进行检测。有3份牛精液(包括l份阳性)的样品和内标模板均没有扩增曲线，表明精 液中存在抑制成分。经对核酸进一步纯化后重新扩增，内标模板和阳性样品均扩增出曲线。
序列表 Organization Applicant 〈110〉0rganizationName :新疆出入境检验检疫局检验检疫技术中心Application Project 〈120〉Title :—种牛传染性鼻气管炎病毒的检测方法及应用 〈130〉A卯FileReference :—种牛传染性鼻气管炎病毒的检测方法及应用 〈140>CurrentAppNumber : Sequence 〈213>0rganismName :Bovine herpesvirusl
〈400〉PreSequenceString :cggtctcctttgccttcggc朋Cg3g3gCgagccggtggagggccagctcggcg郷織60acgagctgctgccgggccgcgagctcgtggagccctgcaccgcc朋ccacaagcgctect120tccgctttggcgcggactecgtgtectecgag朋ctecgcgtecgtgcggcgggtcccgc180tcgcggagctggaggtgatcagcacctttgtggaccte朋cctcacggttctggaggacc240gcgagttcttgccgcteg朋gtgtecacgcgcgccgagctcgccgacacgggtctgctcg3003ctecagcg3gatecagcgccgcaaccagctgcacgagctccggttctecgacattgacc360gcgtggtc朋gacggacggc朋tetggccatcatgcgagggctcgccaacttctttcagg420gcctgggcgccgtcgggcaggCggtgggC3cggtggtgctgggcgccgcgggtgccgcgc■tctcgaccgtgtcgggcatcgcctcgtttettgcgaacccgttcggcgcgctggccacgg540ggctgctggtgctcgccgggctggtggccgctttcctggcgteccggtecatttcccgcc600tccgcagcaaccccatgaaggcgctgtecccgatcaccacgcgcgcgctc朋ggacgacg660cccggggcgcaaccgccccgggcg郷朋g￡lgg￡lgg￡lgtttgacgcggcc3朋Ctgg3gC720aggcccgcgagatgatc朋gtetetgtcgctcgtgtcagcggtcg3gcggC朋g3gC3C3780787
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12
SequenceName :Iplcl
SequenceDescription :
权利要求
一种牛传染性鼻气管炎病毒检测方法，其特征在于，所述的检测方法具体步骤如下(1)根据BHV-1 gB基因序列设计扩增出141bp的特异性引物Ip2、Ir2和荧光探针ITpro，模板构建引物Ip1和Ir1，其中Ip1、Ir1位于Ip2、Ir2外侧，扩增出长度为787bp的片段；将探针ITpro序列进行重排，设计引物Ic1和Ic2，通过人为添加的接头序列，构建内标探针ICpro；(2)将BHV-1经细胞培养增殖，冻融后取上清液用DNAZo1提取液提取病毒DNA；精液用Sephacryl S-400凝胶过滤后，用DNAZo1进行核酸提取；以病毒DNA为模板，用Ip1和Ir1为扩增引物，反应条件为95℃变性5min；96℃1min，50℃1min，72℃2min，35个循环；最后在72℃延伸10min；扩增产物经凝胶纯化回收，连接到pMD18-T载体上，转化DH5α感受态细胞，提取质粒，经酶切、PCR及测序鉴定后，构建质粒IT；(3)以质粒IT为模板，分别采用引物Ip1、Ic1和Ic2、Ir1为配对引物进行PCR扩增，Ip1、Ic1的扩增条件为95℃5min；96℃1min，56℃45s，72℃45s，35个循环；72℃10min；Ic2、Ir1的扩增条件为95℃5min；96℃1min，62℃45s，72℃45s，35个循环；72℃10min；将扩增产物Ip1c1、Ic2r1等量混合后作为模板，用引物Ip1和Ir1进行PCR扩增，反应条件为95℃变性5min；96℃1min，50℃1min，72℃2min，35个循环；最后在72℃延伸10min；将扩增后的产物纯化回收并连接到pMD18-T载体上，转化DH5α感受态细胞，提取质粒，经酶切、PCR及测序鉴定，构建质粒IC；(4)分别以质粒IT和IC为模板，分别以Ip1、Ir1、ITpro和Ip1、Ir1、ICpro为引物和探针进行扩增，dNTP浓度为0.15～3.0mmol/L，引物浓度为0.2～0.6mmol/L，探针浓度为0.1～0.4mmol/L，Mg2+浓度为1.0～4.0mmol/L，Taq DNA聚合酶为1.25～2.5u，Tm为59～61℃，循环参数为40、45和50；(5)分别以不同浓度的IT与IC混合物为模板，以Ip1、Ir1、ITpro和ICpro为引物和探针进行荧光PCR共扩增，确定共扩增反应体系中IC模板的添加浓度。
2. 按照权利要求1牛传染性鼻气管炎病毒检测方法，其特征在于，所述的共扩增检测 体系中，内标模板添加浓度为102拷贝，]\%2+2. 0mmol/L，dNTP各0. 3mmol/L，引物各O. 5mmo1/ L，探针各0. 2mmol/L， Taq DNA聚合酶1. 5u。
3. 按照权利要求1牛传染性鼻气管炎病毒检测方法，其特征在于，所述的共扩增检测 体系扩增条件为50。C，2min，l个循环；95。C ， 5min， 1个循环；95。C 15s， 60°C 60s， 45个循环。
全文摘要
本发明公开了一种牛传染性鼻气管炎病毒的检测方法，采用在PCR反应体系中加入指示假阴性的扩增内标，通过碱基重排、引物设计和搭桥法PCR扩增，构建了一条IAC片段，通过碱基重排和搭桥法PCR扩增，内标模板添加浓度为每个反应102拷贝，Mg2+2.0mmol/L，dNTP各0.3mmol/L，引物各0.5mmol/L，探针各0.2mmol/L，扩增条件为50℃，2min，1个循环；95℃，5min，1个循环；95℃15s，60℃60s，45个循环，能够准确显示抑制成分的存在或指示假阴性的发生。该方法灵敏度比常规PCR和病毒分离高10～100倍。该方法广泛应用于检测牛传染性鼻气管炎病毒领域。
文档编号C12Q1/70GK101701265SQ20091011352
公开日2010年5月5日 申请日期2009年11月17日 优先权日2009年11月17日
发明者于学辉, 员丽娟, 季新成, 杨忠, 段晓东, 牛国辉, 田延河, 黄玲 申请人:新疆出入境检验检疫局检验检疫技术中心