传染性支气管炎病毒分离株s1蛋白的b细胞抗原表位多肽及其疫苗的制作方法
【专利摘要】本发明提供了鸡传染性支气管炎病毒Shanghai 1208分离株S1蛋白B细胞线性抗原表位多肽，属于基因和蛋白质工程领域。本发明还提供B细胞表位多肽联合使用，可用于制备IBV多表位疫苗。本发明的IBV B细胞抗原表位能够引起高水平的免疫应答反应。
【专利说明】
传染性支气管炎病毒分离株S1蛋白的B细胞抗原表位多肽及 其疫苗
技术领域
[0001]本发明属于基因工程和蛋白质工程领域，具体地说，本发明涉及传染性支气管炎 病毒分离株S1蛋白的功能性B细胞抗原表位多肽及其疫苗。
【背景技术】
[0002] 鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis，IB)是国际兽疫局(0ΙΕ)及我 国规定的家禽B/二类传染病之一。该病是由传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus，IBV)引起的一种急性、高度传染性并具有重大经济意义的病毒病。该病毒病发生于 所有养禽国家，且病原存在多个临床表型，包括肾型、呼吸型和腺胃型等，并且常与新城疫 (NDV)、禽流感(AIV)等病毒造成混合感染，给该病的防控带来较大困难。目前我国养鸡场这 3种亚型IBV均有发现。IBV属于冠状病毒科，是冠状病毒的代表株。S蛋白是构成冠状病毒最 表层纤突的主要成分，由S1和S2两部分构成，IBV主要的保护性抗原表位存在S1蛋白中，S1 蛋白是决定IBV血清特异性抗原决定簇的主要蛋白。由于IBV血清型众多，S1是IBV变异程度 最大的基因，不同毒株S1基因核苷酸变化幅度可高达50%以上，在同一血清毒株的S1基因 中有25 % -50 %的氨基酸差异。
[0003] IBV的血清型众多，并且不同血清型之间交叉保护性差，使用单一血清型的弱毒疫 苗或灭活疫苗只能保护同一种血清型病毒感染的宿主，对其他不同血清型IBV的保护作用 较低或无保护。目前，普遍使用的防制IB最有效最直接的方法是利用本地区分离株制备弱 毒疫苗、多价疫苗等。但是随着IB弱毒苗的大量使用，疫苗株与野毒株间可能会发生基因重 组和返祖现象，导致新的变异株不断出现，增加防控难度。随着IBV分子生物学研究的逐步 深入，利用分子生物学研究技术开发IB新型基因工程疫苗，用以克服传统疫苗的不足，已成 为未来IB疫苗研制的主流方向。
[0004] 随着分子生物学的不断发展，人们逐渐对病毒的基因组结构及其主要免疫原基因 的功能有了深入的了解，开发IBV基因工程疫苗，从主要免疫原性蛋白的良好表达到免疫策 略的不断完善，以克服传统疫苗的不足之处。基于表位为基础的疫苗开始显示出良好的应 用前景。多表位疫苗作为基因工程疫苗的重要形式，能够同时保护两种或多种病原的感染， 具有免疫原性好，且生产成本低，易于使用等优点，因此，开发多表位IBV疫苗对于同时预防 多种亚型IBV具有重要的生产意义。
[0005] 开发多表位疫苗最关键是获得保护性抗原基因，抗原基因由若干个抗原决定簇， 又称抗原表位(antigen epitope)组成。抗原表位是真正具有刺激免疫细胞产生免疫应答 的成分。根据抗原受体结合的细胞不同，抗原表位分为T细胞表位和B细胞表位，T细胞表位 主要通过在抗原提呈细胞(APC)中与MHC分子结合后提呈于细胞表面与TCR结合后激活T细 胞免疫应答。MHC I类分子主要结合8-10个氨基酸的多肽，而MHC II类分子主要结合12-25 个氨基酸多肽，B细胞表位在结构上与T细胞不同，其包括两种形式，非连续的构像表位和连 续的线性表位，两者均无 MHC限制性，B细胞表位相对较长，范围从10多个氨基酸到100多个 氨基酸不等，通过结合BCR激活B淋巴细胞分泌抗体发挥抗病毒作用。通过对潜在抗原表位 进行筛选，选择具有保护性抗原表位，以此为基础构建的多表位疫苗，通过一剂注射可以保 护多种病原或者多亚型病原的一种确实方法。筛选出的功能表位疫苗不但能够避免抑制性 表位诱导的免疫抑制作用，还可以使保护性表位诱导的免疫反应处于主导地位。
[0006] 目前关于IBV的B细胞抗原表位研究较多的主要集中在N蛋白和Μ蛋白上，S蛋白的B 细胞抗原表位报道相对较少。不同类型IBV毒株S蛋白的氨基酸差异主要集中在S1蛋白区 域，推断高变区域可能是S1蛋白的Β细胞抗原表位区。
[0007] 本发明着重对IBV Shanghai 1208分离株S1蛋白的Β细胞线性表位进行筛选，用于 开发多表位IBV疫苗。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供鸡IBV分离株(Shanghai 1208)S1蛋白的功能性B细胞抗原 表位多肽。
[0009] 本发明另一目的在于提供该抗原表位多肽在制备IBV多表位疫苗中的应用。
[0010] 本发明还一目的在于提供用于IBV多表位疫苗的S1蛋白的功能性B细胞抗原表位 多肽组合。
[0011] 本发明再一目的在于提供一种包含该S1蛋白的功能性B细胞抗原表位多肽组合的 表达盒。
[0012]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0013]本发明的鸡IBV分离株Shanghai 1208)S1蛋白的功能性B细胞抗原表位多肽，其 包含三条IBV B细胞抗原表位多肽，其氨基酸序列分别为：
[0014] NYVYYYQSAFRPPNGWHLQGGAYAWNSINKTNNAGA(SEQ ID N0.2)、
[0015] RIEANHIRISAMRNGSLF(SEQIDN0.6)JP
[0016] ILTYQTQTAQSGYYNFNLSFLSSFVYKESDYMYGSYHPACNFRLETINNGLWFNSLSVSLAYGPLQGGCKQSVFSSR ATCCYAYSYNGPRACKGVYAGELRQNFECGL(SEQ ID N0.8)〇
[0017] 本发明还提供编码上述鸡IBV分离株(Shanghai 1208)S1蛋白的功能性B细胞抗原 表位多肽的基因。
[0018] 本发明上述鸡IBV分离株(Shanghai 1208)S1蛋白的功能性B细胞抗原表位多肽可 用于制备IBV多表位疫苗。
[0019] 本发明还提供一种用于制备IBV多表位疫苗的S1蛋白的功能性B细胞抗原表位多 肽组合，其包含八条IBV B细胞抗原表位多肽，其氨基酸序列分别为：
[0026] SESPEDRRNRGR(SEQ ID N0.9)〇
[0027] 本发明还提供包含上述八条上述IBV B细胞抗原表位多肽的B细胞表达盒。
[0028] 其中，所述的IBV B细胞抗原表位多肽序列之间采用柔性linker(氨基酸序列为 GGGGSGGGGSGGGGS(SEQIDN0·9))连接。
[0029]本发明还提供一种IBV多表位疫苗，其包含八条上述IBV B细胞抗原表位多肽。 [0030]本发明还提供一种用于筛选IBV S1蛋白功能性B细胞抗原表位的方法，其包括以 下步骤：
[0031] 1)在IBV Shanghai 1208株S1基因氨基酸序列中筛选获得八条S1蛋白的B细胞抗 原表位；
[0032] 2)然后将合成的八条S1蛋白的B细胞抗原表位多肽分别免疫SPF鸡；
[0033] 3)免疫期间分别取血后，分离血清用于B细胞抗原表位产生抗体的检测；
[0034] 4)最后采用ELISA方法筛选与IBV S1蛋白反应的多肽免疫组血清，获得三条功能 性B细胞抗原表位多肽。
[0035]其中，通过ELISA酶标仪测定0D值大于阴性0D值2.1倍以上的血清样品对应的多肽 判定为优势抗原表位。
[0036]本发明通过预测出八条IBV S1蛋白B细胞表位多肽，并成功筛选得到三条鸡传染 性支气管炎病毒Shanghai 1208分离株S1蛋白B细胞线性抗原表位多肽。本发明所述的三条 B细胞表位多肽联合使用可用于制备IBV多表位疫苗。经检测，本发明的IBV B细胞抗原表位 能够引起高水平的免疫应答反应。
[0037]基于IBV B细胞抗原表位构建的DNA疫苗对于致死剂量的鸡传染性支气管炎病毒 感染鸡能够提供90%的保护率，并且能够显著抑制IBV排毒。因此，IBV B细胞多表位疫苗免 疫后能够有效保护易感鸡。为研制IBV多价疫苗以及与其他病毒抗原构建多联疫苗提供了 基础。
【附图说明】
[0038] 图1为本发明重组质粒pV-SIB及空载体质粒pVA)(l转染HeLa细胞后Western Blot 检测体外表达S1B表位盒，1号为pV-SIB，蛋白目的大小为35Kd，2号为pVAXl空载体，无条带。 [0039] 图2为本发明重组质粒pV-Sl及空载体质粒pVAXl转染HeLa细胞后Western Blot检 测体外表达S1表位盒，1号为pV-Sl，蛋白目的大小为75Kd，2号为pVAXl空载体，无条带。
[0040] 图3为本发明间接免疫荧光（IFA)检测pV-SIB和pV-Sl蛋白体外表达情况，1号为 pV-SlB，2号为pV-Sl均能够在细胞中检测到绿色荧光蛋白表达，3号为pVAXl空载体，无荧光 出现。
[0041] 图4为本发明攻毒后各组鸡生存情况，攻毒后观察14天，pV-Sl免疫组无鸡只死亡， 保护率100%，PV-S1B免疫组第7天时死亡一只，保护率90%，pVAXl对照组，从第3天到第9天 均有鸡只死亡，保护率为0。
[0042] 图5为本发明Real time PCR检测IBV攻毒后鸡只排毒情况，pV-SIB和pV-Sl免疫组 排毒IBV颗子拷贝数显著低于pVAXl对照组。pV-SIB和pV-Sl两组抑制排毒能力差别不大。 [0043]图6为本发明ELISA方法检测IBV S1特异性IgG抗体，pV-SIB和pV-Sl免疫组抗体效 价在初次免疫后7天开始出现上升，第二次免疫后10天达到最高，pVAXl对照组抗体效价在 整个免疫周期无变化且显著低于pV-SIB和pV-Sl组。
【具体实施方式】
[0044] 以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用 于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按 照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟 练人员所熟悉的意义相同。
[0045] 本发明中未标注的试剂和原料均为市场上购买所得。
[0046]实施例1采用生物信息学方法分析IBV Shanghai 1208株S1蛋白B细胞抗原表位 [0047] IBV Shanghai 1208株S1基因氨基酸序列见表1(SEQ ID N0.1)，利用网络服务器 BepiPred(http ://www. cbs · dtu. dk/services/BepiPred/)B 细胞表位预测工具进行计算 S1 蛋白氨基酸的性质(亲水性、柔韧性、可及性、极性、暴露表面及转角等)来预测B细胞线性表 位。疏水性0^(11'(^11〇13；[(3；^50和亲水性(117(11'(^11；[1;[(3；^50，在机体内，疏水性残基一般被埋 在蛋白内部，而亲水性残基位于蛋白质表面，因此，蛋白的亲水部位与蛋白抗原表位有着密 切的联系；可及性(8(^688；[13；[1；^7)，蛋白质抗原中氨基酸残基被溶剂分子接触的可能性， 反映了蛋白质抗原各个氨基酸残基的分布情况;柔韧性(f 1 ex i b i 1 i ty )，蛋白质抗原构象的 多肽链骨架具有一定程度的活动性，活动性强的氨基酸残基柔韧性好，易形成抗原表位;转 角，β转角和无规则卷曲多处于蛋白质的表面，结构松散，容易展示在蛋白质表面，有利于与 抗体嵌合，成为抗原表位的可能性大。
[0048] 表1IBV Shanghai 1208分离株S1蛋白核苷酸序列
[0049] 563aa
[0051] 经BepiPred在线服务器分析预测，获得S1蛋白的B细胞表位8条，详细见表2。
[0052] 表2 S1蛋白的B细胞表位
[0054]实施例2ELISA方法筛选功能性B细胞抗原表位
[0055]人工合成预测获得的IBV S1表位多肽，每条多肽合成量10mg，多肽偶联BSA以增强 免疫原性，合成多肽纯度大于90%。每种合成多肽与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂按1:1 的比例分别混合均匀，分别免疫SPF鸡，首免用弗氏完全佐剂混合多肽于鸡皮下多点注射 150ug，加强免疫用合成多肽与弗氏不完全佐剂在初免后21天加强免疫，注射部位和剂量相 同，免疫期间每7天采鸡翅静脉血，分离血清用于B细胞抗原表位产生抗体的检测。
[0056]将原核表达的IBV S1蛋白纯化后包被于ELISA酶标板4°C过夜，每孔包被剂量为 10ug/100ul，次日用TOST洗涤三次，每次3min，将多肽免疫SPF鸡血清用抗体稀释液按1:100 稀释后分别加入酶标板孔，同时设立阴性对照孔和空白对照孔。置37°C温育lh，PBST洗涤三 次，每次3min，用抗体稀释液将HRP标记的兔抗鸡IgG按1:1000稀释后加100ul至酶标板。37 。(:温育lh，PBST洗涤五次，每次3min。每孔加入新鲜配置的TMB底物显色液100ul，室温孵育 15min，每孔加入50ul 2N H2SO4终止显色，酶标仪检测450nm 0D值。0D值大于阴性0D值2.1倍 以上的血清样品对应的多肽判定为优势抗原表位，具体见表3。
[0057]表3优势抗原表位
[0058]
[0059] 实施例3B细胞表位盒真核表达质粒(pV-SIB)及S1基因表达质粒(pV-Sl)构建
[0060] 在筛选的B细胞表位序列之间加入柔性linker(氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID N0.10))以保持表位间二级结构能够正确折叠，通过人工合成基因方法将功能性 IBV S1蛋白B细胞表位串联后形成B细胞表位盒，如表4(SEQ ID NO. 11)，命名为S1B。合成的 S1B表位盒5'端加入限制性内切酶Hind 111酶切位点和KOZAK序列（氨基酸序列为 GCCACCATG(SEQIDN0.12))，3'端加入限制性内切酶Xho頂每切位点。
[0061 ] 表4 S1B表位盒氨基酸序列
[0063] 构建S1B表位盒真核表达质粒，将S1B表位盒定向克隆入真核表达载体pVAXl，经酶 切鉴定和DNA测序鉴定获得阳性质粒命名为pV-SIB。另外，作为对照，同时构建了 IBV S1基 因的真核表达质粒，命名为PV-S1。
[0064] 为了验证pV-SIB和pV-Sl能够在体外正确表达目的蛋白，利用Western Blot和间 接免疫荧光（IFA)方法对其进行检测，将阳性质粒重新转化DH5a感受态细胞，用QIAGEN plasmid Maxi kits进行质粒大提，质粒纯度均在1.7-1.9(0D260/0D280)之间，浓度>lyg/y L。按Lipofectin Reagents操作说明转染Hela细胞，转染48h后，收取细胞样品。实验设立对 照组。
[0065] Western blot检测：去除培养基，收集细胞沉淀，用细胞裂解液裂解细胞，加入1 X 上样缓冲液，沸水中煮沸l〇min，室温12000r/min离心5min，进行SDS-PAGE电泳，电泳后将凝 胶取出，250mA恒流湿转90min。转印后将PVDF膜置于含5%脱脂乳的TOST中4°C封闭过夜， TOST漂洗3次，每次3-5min。加入兔抗阳性血清，4 °C孵育过夜，PBST漂洗3次。加入辣根过氧 化物酶标羊抗兔二抗（1:10000稀释），作用lh，以TOST漂洗3次，以ECL显色试剂盒显色，在X 感光片下曝光，结果见图1和图2。
[0066] 图1为本发明重组质粒pV-SIB及空载体质粒pVA)(l转染HeLa细胞后Western Blot 检测体外表达S1B表位盒，1号为pV-SIB，蛋白目的大小为35Kd，2号为pVAXl空载体，无条带。 [0067] 图2为本发明重组质粒pV-Sl及空载体质粒pVAXl转染HeLa细胞后Western Blot检 测体外表达S1表位盒，1号为pV-Sl，蛋白目的大小为75Kd，2号为pVAXl空载体，无条带。 [0068] 间接免疫荧光检测：取60mm Dish，将飞片放入其中。接种Hela细胞，生长至50- 70 %时，取10yg重组质粒进行转染，48h后以丙酮固定细胞，加入兔抗阳性血清，37 °C湿盒中 作用lh，PBST洗涤3次，每次lOmin;加入FITC标记的羊抗兔二抗(含0.01%Evensblue)，37°C 作用lh，PBST洗涤3次，每次10min;用甘油封片剂封片，于荧光显微镜下观察。结果见图3。
[0069] 图3为本发明间接免疫荧光（IFA)检测pV-SIB和pV-Sl蛋白体外表达情况，1号为 pV-SlB，2号为pV-Sl均能够在细胞中检测到绿色荧光蛋白表达，3号为pVAXl空载体，无荧光 出现。
[0070] 结果显示，PV-S1B和pV-Sl均成功表达目的条带和相应的蛋白表达，说明两种质粒 构建成功。
[0071] 实施例4IBV S1B细胞表位核酸疫苗免疫保护效力研究
[0072] 将1周龄的SPF鸡分成3组置于隔离器饲养，每组10只，分别免疫pV-SlB、pV-Sl和 pVAXl空载体质粒DNA，每只鸡腿部肌肉多点注射150ug质粒DNA，每周鸡翅静脉采血，分离血 清用于抗体检测。首免后3周（28日龄），对各组SPF鸡加强免疫一次，剂量和免疫方式同首 免。二免后两周各组SPF鸡分别用106ELD5Q剂量的Shanghai 1208株IBV通过滴鼻方式攻毒， 攻毒后每天观察鸡只记录存活情况，各组攻毒后鸡只的保护率见图4。攻毒后第3天pVAXl组 出现流鼻涕、甩头症状，伴有气管啰音，且鸡只开始出现死亡，至第14天，死亡率达100%，保 护率为0,剖检病变主要在呼吸道和肾脏，具体表现为上呼吸道充满黏液，喉头肿胀，气管有 出血点，肾脏肿大，呈典型的花斑肾。疫苗组pV-Sl、pV-SlB免疫后，鸡只无明显临床症状，保 护率分别为1 〇〇%和90%，B细胞表位组(pV-SIB)保护效果良好。
[0073]排毒检测:攻毒后第4、6、8、10、12、14d采集泄殖腔棉拭子，置于无菌PBS中，反复冻 融三次，5000r/min离心10min，取上清液提取RNA作为模板，用荧光定量PCR法检测排毒量。 IBV M41株Μ基因的质粒pMD19T-M，提质粒测浓度，计算拷贝数，作标准曲线。制备的标准品 质粒PMD19T-M浓度为11.5ngAU，质粒大小为678bp，换算成拷贝数为3.221 X 107copiesAi 1。当标准品在10-2至10-8范围内稀释时，线性关系良好。以CT值为y轴，对应的标准品拷贝数 的对数为X轴，绘制标准曲线，标准方程为y =-3.5982x+33.688，相关系数R2为0.9993。
[0074] 图5为本发明Real time PCR检测IBV攻毒后鸡只排毒情况，pV-SIB和pV-Sl免疫组 排毒IBV颗子拷贝数显著低于pVAXl对照组。pV-SIB和pV-Sl两组抑制排毒能力差别不大。 [0075] 实施例5ELISA检测特异性IBV IgG抗体
[0076] 首免前及免疫后7d、14d、21d以及二免后10d每组随机抽取3只鸡进行颈静脉采血 并分离血清，用间接ELISA方法检测抗体效价。
[0077]具体方法:将IBV病毒液用包被液10倍稀释后，加入酶标板中，100ul/孔，4°C过夜； 弃掉液体，用TOST洗板3次，300ul/孔，每次3min，每孔加入200ul 10 %胎牛血清封闭，置于 37 °C作用2h; TOST洗板3次。加入提前用roS稀释20倍的待测血清，100ul/孔，置于37 °C作用 2h; TOST洗板3次。加入兔抗鸡酶标抗体IgG(roS稀释1:5000) 100ul/孔，37 °C作用lh;洗板3 次，加入TMB底物溶液，100ul/孔，避光室温作用20min;加入2N H2S04 100ul/孔终止反应， 于波长450nm下测定各孔0D值。
[0078] ELISA结果显示，免疫后7天抗体水平有所上升，随着免疫时间的延长其抗体水平 逐渐增高，pV-SIB和pV-Sl组均高于pVAXl对照组，并在二免后第10天达到最高水平，其中以 pV-SIB组抗体水平最高（如图6所示），说明IBV B细胞表位能够引起高水平的免疫应答反 应，且有效保护免疫鸡只。
[0079] 本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本 领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落 入所附权利要求书的范围之内。
【主权项】
1. 鸡IBV分离株SI蛋白的功能性B细胞抗原表位多肽，其包含三条IBV B细胞抗原表位 多肽，其特征在于，其氨基酸序列分别为： NYVYYYQSAFRPPNGWHLQGGAYAVVNSINKTNNAGA(SEQ ID NO.2)^ RIEANHIRISAMRNGSLF(SEQ ID N0.6)、和 ILTYQTQTAQSGYYNFNLSFLSSFVYKESDYMYGSYHPACNFRLETINNGLWFNSLSVSLAYGPLQGGCKQSV FSSRATCCYAYSYNGPRACKGVYAGELRQNFECGL(SEQ ID N0.8)〇2. 编码权利要求1所述的鸡IBV分离株SI蛋白的功能性B细胞抗原表位多肽的基因。3. 权利要求1所述的鸡IBV分离株Sl蛋白的功能性B细胞抗原表位多肽在用于制备IBV 多表位疫苗中的应用。4. 用于制备IBV多表位疫苗的Sl蛋白的功能性B细胞抗原表位多肽组合，其包含八条 IBV B细胞抗原表位多肽，其氨基酸序列分别为： NYVYYYQSAFRPPNGWHLQGGAYAVVNSINKTNNAGA(SEQ ID NO.2) AFRPPNGffHL(SEQ ID NO.3) NKTNNAGAASE(SEQ ID NO.4) TNGNDVGYNNSASSVAMTAPLPGMSff(SEQ ID NO.5) RIEANHIRISAMRNGSLF(SEQ ID NO.6) KSDGSRIQTATDPPVITQH(SEQ ID NO.7) ILTYQTQTAQSGYYNFNLSFLSSFVYKESDYMYGSYHPACNFRLETINNGLWFNSLSVSLAYGPLQGGCKQSV FSSRATCCYAYSYNGPRACKGVYAGELRQNFECGL(SEQ ID NO.8) SESPEDRRNRGR(SEQ ID N0.9)〇5. 包含权利要求4所述的SI蛋白的功能性B细胞抗原表位多肽组合的B细胞表达盒。6. 根据权利要求5所述的B细胞表达盒，其特征在于，所述的IBV B细胞抗原表位多肽序 列之间采用柔性I i nker连接。7. 根据权利要求6所述的B细胞表达盒，其特征在于，所述柔性linker的氨基酸序列为 GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID N0.10)。8. -种IBV多表位疫苗，其包含权利要求4所述的SI蛋白的功能性B细胞抗原表位多肽 组合。9. 一种用于筛选IBV Sl蛋白功能性B细胞抗原表位的方法，其包括以下步骤： 1) 在IBV Shanghai 1208株Sl基因氨基酸序列中筛选获得八条Sl蛋白的B细胞抗原表 位； 2) 然后将合成的八条Sl蛋白的B细胞抗原表位多肽分别免疫SPF鸡； 3) 免疫期间分别取血后，分离血清用于B细胞抗原表位产生抗体的检测； 4) 最后采用ELISA方法筛选与IBV Sl蛋白反应的多肽免疫组血清，获得三条功能性B细 胞抗原表位多肽。
【文档编号】A61P31/14GK105949321SQ201610290210
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月4日
【发明人】丁铲, 谭磊, 于圣青, 孙英杰, 仇旭升, 孟春春, 宋翠萍
【申请人】中国农业科学院上海兽医研究所